Transglutaminaz uygulanmış kazeinomakropeptidin fizikokimyasal özelliklerinin karakterizasyonu

Kazeinomakropeptid (KMP) peynir üretimi sürecinde, rennet enziminin κ-kazeini parçalaması sonucunda peyniraltı suyuna salınır. Peyniraltı suyunda 12-15 g/L protein bulunmaktadır ve bu proteinin yaklaşık %20-25'ini KMP oluşturur. Kazeinomakropeptid asidik pH değerlerinde bile suda çözünebilen hidrofilik ve negatif yüklü bir peptiddir. Kazeinomakropeptid peyniraltı suyundan izole edilir ve fonksiyonel biyoaktif bir peptid olarak gıdalarda kullanılır. Kazeinomakropeptidin fonksiyonel özellikleri arasında antibakteriyel, antiviral, bağışıklığı geliştirici ve prebiyotik özellikleri sayılabilir. Ayrıca saf halde aromatik amino asitleri, özellikle fenilalanin, içermediğinden bu amino asitleri sindiremeyen bireyler için üretilen gıdalarda kullanılabilir. Transglutaminaz enzimi proteinlerin çapraz bağlanması ve bu yolla jel, köpük ve emülsiyon oluşturma gibi yapısal fonksiyonlarının geliştirilmesi için uygulanan bir enzimdir. Araştırmalarda farklı gıda ürünlerinde uygulanması olumlu sonuçlar vermiştir. Gıda endüstrisinde bazı gıda ürünlerinde ticari uygulamaları vardır. Daha önce yapılan bir çalışmada, transglutaminaz enziminin kazeinomakropeptidi çapraz bağlayabildiği saptanmıştır. Bir başka çalışmada, transglutaminaz uygulamasının kazeinomakropeptid izolatının jel özelliklerini geliştirdiği saptanmıştır. Transglutaminazın kazeinomakropeptid izolatının fizikokimyasal özelliklerine olan etkisi bilinmemektedir. Bu çalışmada, transglutaminaz uygulamasının ticari bir kazeinomakropeptid izolatının fizikokimyasal özelliklerine ve bundan elde edilen jelin dokusal özelliklerine etkileri incelenmiştir. Kazeinomakropeptid çözeltileri kütlece %20 konsantrasyonda hazırlanmıştır. Kazeinomakropeptid izolat bileşiminde kütlece %3.6 peyniraltı suyu proteinleri bulunduğu için, peyniraltı suyu protein izolatı ile de bu konsantrasyonda örnekler hazırlanarak kazeinomakropeptid izolatının jelleşmesine olabilecek muhtemel etkileri belirlenmiştir. Kazeinomakropeptid izolatı ve peynir altı suyu protein izolatı çözeltileri kendi pH değerlerinde 0-12,5 U/g protein aktivite aralığında transglutaminaz enzimi ile 40ºC'de 1 saat muamele edilmiştir. Daha sonra enzim reaksiyonunu durdurmak için çözeltiler soğuk su banyosunda soğutulmuştur. Çözeltilerin pH değerleri kazeinomakropeptidin kuvvetli jel oluşturduğu pH 3,0'e ayarlanmıştır. Enzim eklenmeyen kontrol örnekleri de aynı işlemlere tabi tutulmuştur. En yüksek transglutaminaz aktivitesi ile muamele edilen örneklerin ve kontrol örneğinin hidrofobisite, zeta potansiyel ve jelleşme özellikleri ölçülmüştür. Ayrıca hazırlanan örnek çözeltilerinden elde edilen jellerin dokusal özellikleri belirlenmiştir. Çözeltilerin zeta potansiyeli, parçacık büyüklüğü analiz cihazı kullanarak ölçülmüştür. Kazeinomakropeptid izolatı çözeltileri %0.2 konsantrasyonda olacak şekilde seyretilmiş ve pH değeri 2.5-6.7 aralığındaki değerlere ayarlanmıştır. Örneklerin izoelektrik noktası, pH-zeta potansiyel verilerine uygun matematiksel denklemin saptanması ve bu denklemin sıfıra eşit olduğu pH değerinin hesaplanması ile bulunmuştur. Örneklerin hidrofobisitesinin belirlenmesi için örnek çözeltileri %0.01-0.1 konsantrasyon aralığına seyreltilmiştir. Fluoresan 8-anilino-1-naftalensülfonik asit (ANS) probunun 3 mM'lık çözeltisi pH 7.0 fosfat tamponunda hazırlanmıştır. Dilüe edilen örnek çözeltisi ve ANS çözeltisi 15 dakika oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edilmiştir. Örneklerin floresan şiddeti floresan spektrofotometrede 390 nm'de uyarım yapıldıktan sonra 480 nm dalga boyunda ölçülmüştür. Örnek çözeltilerinin jelleşme özellikleri reometre kullanılarak belirlenmiştir. Jelleşmenin gerçekleşmesi için 25-70°C aralığında sıcaklık taraması uygulanmıştır. Jelleşmenin tamamlanması için örnekler 70°C'de 30 dakika inkübe edildikten sonra 25°C'ye soğutma yapılmıştır. Elastik modül (G΄) değerinin 1 Pa'ı geçtiği noktada jelleşme sıcaklığı kaydedilmiştir. Kazeinomakropeptidın jelleşmesinde peyniraltı suyu proteinlerinin etkisinin olup olmadığını belirlemek için aynı jelleşme programı peyniraltı suyu protein izolatı örneklerine de uygulanmıştır. Kazeinomakropeptid izolatından elde edilen jellerin dokusal özelliklerinin belirlenmesi için örnek çözeltilerinden jel hazırlanmıştır. Örnek çözeltileri pH 3.0'e ayarlandıktan sonra test tüplerine aktarılarak, 70ºC su banyosunda 30 dakika inkübasyon uygulanarak jelleşme sağlanmıştır. Örnekler daha sonra soğuk su banyosunda soğutulmuş ve analiz edilene kadar bekletilmiştir. Elde edilen jellerin dokusal özellikleri doku analiz cihazı ile penetrasyon testi uygulanarak ölçülmüştür. Penetrasyon testinden elde edilen verilerden sertlik ve penetrasyon işi belirlenmiştir. Tüplerde hazırlanan jellerde ayrıca sinerez ölçümü yapılmıştır. Örnekler 2500×g'de 10 dakika santrifüj edilmiş ve ayrılan su miktarı ölçülmüştür. Transglutaminaz uygulaması ile kazeinomakropeptid izolatının yüzey yükü aynı pH'da daha negatif değerlere doğru değişmiş ve bu durum daha çok düşük pH değerlerinde gözlenmiştir. Kontrol ve enzimle muamele edilmiş kazeinomakropeptid izolatının pI değerleri sırasıyla 3,47 ve 2,98 olarak ölçülmüştür. Transglutaminaz uygulaması kazeinomakropeptid izolatının pI değerini düşürmüştür. Kazeinomakropeptid izolatının hidrofobisitesi transglutaminaz uygulaması ile azalmıştır. Reolojik analizler sonucunda, transglutaminaz ile muamele edilen ve edilmeyen kazeinomakropeptid izolatı örneklerinin jelleşme sıcaklığı ve elastik modül değerleri arasında istatiksel olarak önemli düzeyde bir farklılık tespit edilmemiştir. Enzim ile muamele edilen ve edilmeyen peyniraltı suyu protein izolatı örneklerinde jel oluşumu gözlenmemiştir. Bu durum peyniraltı suyu proteinlerinin çalışılan koşullar altında kazeinomakropeptid izolatı jelinin oluşumunda etkili olmadığını göstermiştir. Dokusal analizlerde, kazeinomakropeptid izolatı jelinin sertlik ve penetrasyon işi değerlerinin uygulanan enzim aktivitesi arttıkça arttığı tespit edilmiştir. Bu önemli değişim transglutaminaz enzimi ile çapraz bağlamanın kazeinomakropeptid izolatı jelini güçlendirdiğini göstermiştir. Örneklerde sinerez analizleri sonucunda su ayrılması gözlenmemiştir. Yapılan bu çalışma, kazeinomakropeptid izolatı kullanılarak pH 3'te 70C'de 30 dakika ısıl işlem ve soğutma sonrasında jel elde edilebileceğini göstermiştir. Bu koşullar altında jel oluşturan ana bileşen kazeinomakropeptiddir. Transglutaminaz enzimi ile çapraz bağlama sonucunda kazeinomakropeptidin jelleşme sırasındaki reolojik özellikleri istatiksel olarak önemli düzeyde değişmese de jelin dokusal özellikleri geliştirilmiştir. Transglutaminaz uygulaması ile daha sert ve dayanıklı bir jel elde edilmiştir. Transglutaminaz uygulanmış kazeinomakropeptid izolatının ticari olarak kullanım potansiyelini göstermek için ilave çalışmalara ihtiyaç vardır. Transglutaminaz uygulanmış kazeinomakropeptid izolatı kullanılarak gıda ürünleri geliştirilebilir ve bu ürünlerin kabul edilebilirliğini belirlemek için duyusal analizler yapılabilir.