Domuz modeli üzerinde diş kök hücresi kullanılarak kemik doku mühendisliği

Kemik kendi kendini tamir etme potansiyeline sahip olmasına rağmen genetik bozukluklar, travma, tümör ameliyatları sonucu oluşan kritik boyutlu kemik hasarları rekonstrüksiyon ameliyatları ile rehabilitasyonu gerektirir. Bu hasarların tedavisinde otojenik kemik greftleri altın standart olarak kabul edilir (Von Wilmowsky et al., 2010). Yine de donor bölge morbiditesi, grefte ulaşılabilirliğin limitli olması, şekilsel uyumsuzluk gibi sorunlar kemik hasarlarının otojenik kemik greftleriyle tamirini zorlaştırmaktadır (Marolt, 2015). Greftle ilgili bu sınırlamaları azaltmak ve kemik oluşumunu artıracak daha güvenli bir yol oluşturmak için doku mühendisliği yaklaşımları kullanılır. Doku mühendisliği, doku ve organ nakillerine olan ihtiyacın büyümesi sonucunda ortaya çıkan ve malzeme bilimi ve hücre biyolojisi bilgisini birleştirerek doku yerine geçen ve vücudun "yedek parçaları"nın geliştirilmesini sağlayan interdisipliner bir alandır. Kemik doku mühendisliğinin birincil amacı, kritik boyutlu kemik hasarları sonucunda bozulan kemiğin doğal iyileşme mekanizması için gerekli optimum koşulları sağlamaktır (Schlegel et al., 2006). Doku mühendisliği 3 önemli kısımdan oluşur: hücre, iskele ve biyokimyasal ipuçları. Kemik doku mühendisliği iskeleleri, greft yapılan bölgeye yeterli mekanik stabiliteyi sağlayan, osteokondüksiyon, osteoindüksiyon ve osteogenezisi destekleyen şekilde tasarlanır (Cypher & Grossman, 1996). Hücre göçü, farklılaşması, kemik büyümesi ve damarlanmasını destekleyen kemik doku mühendisliği iskeleleri doğal ya da sentetik polimerler, seramikler ve kompozitler gibi çeşitli biyomalzemeler kullanılarak oluşturulur (Nair & Laurencin, 2007a). Biyoaktif moleküller de eklenerek hücre tutunması, yeni kemik oluşumu ve anjiyogenez de desteklenir (Devescovi et al., 2008). Kemik doku mühendisliği yaklaşımlarında, kemik oluşturma potansiyeli olan hücreler doku iskelesi üzerinde çoğaltılarak iskelenin osteokondüksiyon özelliği ile birlikte hücre merkezli osteogenezis yaparlar (Kwan et al., 2007). Bu amaçla, kemik iliğinden elde edilen mezenkimal kök hücreler (MKH) sıklıkla kemik doku mühendisliğinde kullanılır (Li et al., 2015; Liao et al., 2014). Ancak, kemik iliği alımı sırasında hastada oluşan travma, kemik iliği kaynaklı hastalıklar gibi sebepler kök hücre çalışmalarını yetişkin kök hücrelerini barındıran alternatif kaynaklar ve invaziv olmayan yeni doku toplama yöntemleri arayışına yöneltmiştir. Son dönemde yapılan çalışmalar, dental dokularda da yetişkin kök hücrelerin olduğunu göstermiştir (Gronthos et al., 2000). İnsanda, üçüncü molar dişleri 6 yaş civarında organogeneze başlar ve 18 yaşına kadar tam olarak gelişemez. Bu durum, o yaşa kadar tam faklılaşmamış hücrelerin bu dokuda bulunduğunu gösterir. Bu yüzden diş jerm kök hücreleri, primitive kök hücrelerin izolasyonunda kullanabilecek kemik doku dahil olmak üzere birçok hedef dokuya farklılaşma potansiyeline sahip ektomezenkimal bir kaynaktır (d'Aquino et al., 2008). Bunun yanı sıra, dental dokulardan MKH izole etmek kolay, ucuz, güvenli ve etiktir. Bu kök hücreler MKH ile benzer yüzey antijeni profiline sahiptir (Calikoglu Koyuncu et al., 2014). Bir yüzey antijeni olan stromal öncül antijeni-1 (STRO-1), MKH'lerin kemik hücresi öncüllerini içeren ve fonksiyonel kemik hücrelerine dönüşebilen bir alt populasyonunda bulunur (Gronthos et al., 1994). Bu sebeple, STRO-1 yüzey antijeni bulunduran hücrelerin seçilmesi dental kök hücrelerin içerisinden osteojenik hücrelerin ayrılması için verimli bir strateji olduğu düşünülmektedir. Kalsiyum fosfat bazlı seramikler, osteokondüktif özellikleri ve mekanik özelliklerinin doğal kemik ile benzemesi sebebiyle kemik doku mühendisliğinde sıklıkla taşıyıcı madde olarak kullanılır (Dubok et al., 2010; Samavedi et al., 2013). Bir çok çalışmada hücreler, çeşitli seramik malzemeler ile önceden ex-vivo (Tsiridis et al., 2005) kültüre edilerek ya da operasyon sırasında hücreler ile kombine edilerek (Kokemueller et al., 2010) kullanılmıştır. Her iki yaklaşım da kendine özgü avantajlara sahip olmakla birlikte, kök hücrelerin alloplastik malzeme ile operasyon sırasında birleştirilerek kullanılması, kök hücre merkezli kemik iyileşmesinde daha kolay ve verimli bir prosedür olarak görülmektedir. Ancak, seramik bazlı malzemelerin hacim stabilitesinin azlığı ve işleme zorluğu gibi sebeplerden dolayı greftin uygulamasını kolaylaştıran ve hücrelerin yaşamasını destekleyen ek malzemelere ihtiyaç vardır (Spetzger et al., 2010). Biyobozunur ve biyoaktif polietilen glikol (PEG) bazlı hidrojel (MX10™, Straumann Holding AG, İsviçre), hücre ve proteinleri hasar bölgesine zarar vermeden ulaştıran yeni bir taşıyıcı malzeme olarak öne çıkmaktadır. Bu yüzden, hücreleri PEG hidrojele hapsederek seramik greft malzemesi ile birlikte uygulamak, kritik boyutlu kemik hasarlarının tedavisi için uygun bir strateji olarak düşünülmüştür. Bu çalışmada, evcil domuz, insana olan anatomik, fizyolojik ve metabolik benzerliklerinin yanı sıra diş yapısının benzerliğinden ötürü deneysel model olarak seçilmiştir. Domuz diş jermi kök hücreleri (dDJKH), 6 aylık domuzların üçüncü molar dişlerinden izole edilerek yüzey antijen profili bakımından karakterize edilmiştir. dDJKH'leri, STRO-1 yüzey belirtecini ifade etmeleri bakımından STRO-1(+) ve STRO-1(-) olarak ayrılmıştır. Tezin ilk kısmında, hücrelerin STRO-1 yüzey antijeni bulundurmalarına göre ayrılmalarının, hücre çoğalması ve osteojenik kapasite üzerine etkisi in vitro olarak araştırılmıştır. Bu amaçla STRO-1(+), STRO-1(-) ve ayırma işlemine tabi tutulmamış heterojen populasyon (US) arasında kıyaslama yapılmıştır. STRO-1(+) hücreler daha iyi çoğalma ve koloni oluşturma özellikleri göstermiştir. Tüm gruplar osteojenik farklılaşma göstermiş olup bu durum alkalin fosfataz (ALP) aktivitesi, kalsiyum depolama testi, osteojenik mRNA ve proteinlerin tespiti ve mineralizasyon boyamaları ile gösterilmiştir. Farklılaşma testlerine göre STRO-1(+) hücreler, STRO-1(-) ve US hücrelere kıyasla in vitro ortamda osteogenez açısından daha iyi bir performans göstermemiştir. Bu sonuçlar, STRO-1(+) hücrelerin osteogenez açısından sahip olduğu iddia edilen özellikleri göstermesi için STRO-1(-) hücrelerin de içinde bulunduğu heterojen populasyona ihtiyaç duyduğunu göstermektedir. Tezin ikinci kısmında, STRO-1(+) ve US hücrelerinin in vivo osteogenez kapasitelerinin karşılaştırılmasının yanı sıra seramik ve hidrojel doku iskelelerinin kritik boyutlu kalvaryal kemik hasarlarının iyileşmesine etkisi araştırılmıştır. MX10 hidrojel, hücrelerin hasar bölgesine taşınması ve bu bölgede tutulması için uygun bir taşıyıcı iskele olarak bulunmuştur. Hücrelerin transplantasyon sonrası in vivo ortamda izlenmesi için kullanılan CM-DiI'in kullanışlı olduğu görülmüştür.