Embriyo atık kültür sıvısının Raman spektroskopisi ile analizi

Raman spektroskopisi, moleküllerin titreşim spektrumlarını inceleyerek ışığın elastik olmayan saçılma yapmasına dayanan spektroskopik bir yöntemdir. Işık saçılırken büyük bir kısmının enerjisi maddeyle etkileşen ışığın enerjisiyle aynı olmaktadır. Bu saçılma elastik bir saçılmadır ve Rayleigh saçılması olarak bilinmektedir. Işığın çok küçük bir kısmının ise saçılırken edindiği enerji maddeyle etkileşirken sahip olduğu enerjiden farklıdır. Bu durumda ışık elastik olmayan bir saçılma yapmaktadır. Bu saçılmaya Raman Saçılması denir. Gelen ışık ve saçılan ışık arasındaki enerji farkı, molekülün titreşim enerji seviyeleri arasındaki enerji farkına bağlıdır. Bu yüzden Raman saçılma bantları moleküllerin karakteristiğini açıklar ve parmak izi niteliğindedir. Raman spektroskopisi biyolojik sistemler için yapılan ölçümlerde iyi sonuçlar vermektedir. Bu tez çalışması kapsamında biyolojik moleküler yapıda olan embriyo atık kültür sıvısının içerdiği proteinler, lipitler ve amino asitler hakkında bilgi edinebilmek için Raman spektroskopisi ile ölçümler alınmıştır. Embriyo atık kültür sıvısı örneklerinin Raman spektrumları ölçülerek, Raman bantları literatürdeki bantlarla karşılaştırılarak amino asit bantları ve lipit bantlarının hangileri olduğuna dair tahmini bir belirleme yapılmıştır. Tez çalışmasının bir basamağını oluşturan bilimsel araştırma projesinin genel amacı embriyoyu çevreleyen atık kültür ortamının Raman spektroskopisi ile değerlendirilmesi ve embriyo etrafındaki kültür ortamının spektroskopik yöntemle incelenmesi ile embriyo seçimi yapılmasıdır. Embriyo atık kültür sıvısı örnekleri İstanbul Üniversitesi Çapa Tıp Fakültesi Tüp Bebek Kliniği'nden alınmış ve sıvı azot içerisinde İstanbul Teknik Üniversitesi Lazer Spektroskopi Laboratuvarı'na ulaştırılmıştır. Tüp Bebek Kliniği'nde iki farklı gruba ayrılarak gelişmesini devam ettirme ihtimali yüksek olan örnekler Grade1 (G1), daha az ihtimali olan örnekler de Grade2 (G2) olacak şekilde mikroskobik yöntemlerle sınıflandırılmışlardır. Embriyo atık kültür sıvısı örneklerinin Raman spektrumları 786 nm dalga boyuna sahip bir diyod lazer kullanılarak ölçülmüş ve önişlemler uygulandıktan sonra istatistiksel analizleri yapılmıştır. Aynı ölçüm hücresi ile her bir hastaya ait örnek ölçümleri ve arka plan (su) ölçümleri alınmıştır. Her hasta için farklı ölçüm hücresi ile ölçüm alınmıştır. Farklı ölçüm hücreleri ile ölçüm yapmanın etkisini test etmek için embriyo atık kültür sıvısı örneklerini ölçtüğümüz disklerin her birinin boşken spektrumları alınarak farklılıklar incelenmiştir. Embriyo atık kültür medyası bileşenlerinin hangi konsantrasyona kadar istatistiksel analizlerde ayrışabilir olduğunu anlamak için model bir çözelti hazırlanmıştır. Bu çözeltiyi oluştururken amino asitlerden histidin ile birkaç amino asit karışımından oluşan ve biyolojik sistemlerle yapılan ölçümlerde protein konsantrasyonu standardizasyonu için kullanılan bovin serum albümin kullanılmıştır. Histidin doymuş sıvı çözeltisinin farklı konsantrasyonları ile bovin serum albümin doymuş sıvı çözeltisinin karıştırmasıyla 3 farklı karışım elde edilmiştir. Bovin serum albümin ve histidin sıvı çözeltilerinin %50, %10 ve %2 konsantrasyondaki karışımları ölçüm hücresi ile ölçülmüştür. Ölçümlere embriyo atık kültür sıvısı örneklerine yapılan önişlemler uygulanmıştır. Konsantrasyondaki farklılıkların istatistiksel analizler uygulandıktan sonraki gözle görünür ayrıştırılabilirliği bize embriyo atık kültür sıvısı bileşenlerinden olan amino asit ve lipitlerin çok düşük oranlarda var olduklarında da tespit edilebildikleri fakat daha düşük konsantrasyona sahip olduklarında ayrışamadıkları konusunda yol gösterici olmuştur. Embriyo atık kültür sıvısının önişlemler uygulanmış Raman ölçümlerine temel bileşenler analizi (PCA) uygulanmıştır. Temel bileşenler analizi (PCA) skorlarına göre elde edilen grafiğin x ve y eksenleri olan PC1 ve PC2 dataları kullanılarak elde edilen doğrusal ayırt etme analizi (LDA) sonuçlarına göre hassasiyet ve ayırt edilebilirlik oranları elde edilmiştir. Analiz sonuçlarına göre hassasiyet oranı %75, ayırt edilebilirlik oranı ise %73 olmaktadır. Histidin ve bovin serum albümin çözeltilerine de temel bileşenler analizi (PCA) ve doğrusal ayırt etme analizi (LDA) uygulanmıştır. Doğrusal ayırt etme analizi (LDA) sonuçlarına göre hassasiyet oranları; %50, %10 ve %2 konsantrasyondaki ölçümler için %100 oranındadır. Ayırt edilebilirlik oranları da %50, %10 ve %2 konsantrasyondaki ölçümler için %100 olmaktadır. Konsantrasyon oranlarını bildiğimiz ve embriyo atık kültür sıvısıyla aynı yöntemle ölçüp analiz ettiğimiz çözeltiler başarılı şekilde ayrışmışlardır. Buna göre ölçtüğümüz sıvı içerisinde herhangi bir bileşen %2 oranına kadar bulunduğunda Raman bantları gözlenebilmekte ve ayırt edilebilmektedir.