Functional interactions between Helicobacter-activated B(HACT-B) cells and CD4+ T cells

Helicobacter pylori, dünya popülasyonunun yarısından fazlasını enfekte etmiş bulunan, gram-negatif, spiral yapıda, mikroaerofilik bir bakteri olmakla beraber gastritten mide kanserine kadar uzanan gastrik patolojilerin temel risk faktörü olarak tanımlanmıştır. Enfeksiyonlar genelde çocukluk çağlarında meydana geldiğinden, dünya genelinde enfekte olan kişi sayısı oldukça fazla olmasına karşın, enfekte bireylerin büyük bir kısmı herhangi bir semptom göstermezken, popülasyonun yalnızca % 20'sinde gastrite, gastrik ve duodenal ülserlere ve ilerleyen zamanda gastrik adenokarsinoma sebep olmaktadır. Helicobacter'in etkisini incelemek için fare modelleri kullanılarak yapılan çalışmalarda, Helicobacter pylori'ye yakınlığıyla bilinen ve CagA virülans faktörü bulundurmamasına rağmen enfeksiyonlarda pylori'ye oldukça benzer sonuçlar veren Helicobacter felis kullanılmaktadır. Helicobacter felis de gram negatif, helikal şekilli ve mikroaerofilik bir bakteridir. İmmün sistem hücreleri, mikroçevrelerinde bulunan patojenleri tanımak için hücre yüzeylerinde bazı reseptörlere ihtiyaç duymaktadır. Toll benzeri reseptörler (Toll-like receptors -TLR), birçok patojenin varlığında sinyal üreterek doğal immün cevabın oluşmasını sağlayan bir grup tip 1 transmembran proteinidir. Hayvan ve hücre kültürü deneyleri, H.pylori kaynaklı ligandların B hücrelerinde aktivasyonu TLR2 yolu ile yaptığı ortaya konmuştur. Antijen sunucu hücreler (APC- antiger presenting cell) olan B hücrelerinin ve T hücrelerinin IL-10 üreten regülatör alt tipleri olduğu bilinmektedir. Güncel araştırmalar, Helicobacter felis (H.felis) enfeksiyonlu fare modellerinde TLR-2 yoluyla IL-10 üreten B hücrelerinin immün cevabı baskılayıcı ve düzenleyici rolü olduğunu ortaya koymuştur. Yardımcı T (Th) hücrelerinin bir alt kümesi olan Th17 (T helper 17) hücrelerinin ve salgıladıkları interlökin 17 (IL-17) sitokininin, Helicobacter gibi bakterilerin temizlenmesinde kritik rolü vardır. Th17 dönüşümü için transforme edici büyüme faktörü-β (TGF-β), IL-21, IL-6 gibi sitokinleri etkili olduğu önerilmiştir. Th17 için oldukça önemli bir transkripsiyon faktörü olan RORγt, IL-17 gen transkripsiyonunu tetikler. Fakat kronik gastrik enflamasyon sırasında, üretilen IL-17 seviyesinin enfeksiyonu temizlemeye yeterli olmadığı görülmektedir. Buna sebep olarak, bakterinin kendi devamlılığını sağlamak amacıyla diğer immün hücreleri aracılığıyla, T hücrelerini, Th17 etkisini bastıran ve düzenleyici etkiler gösteren regülatör T hücrelerine dönüştürdüğü düşünülmektedir. Doğal regülatör T hücreleri olarak bilinen nTreg'ler (CD4+CD25+FoxP3+) timustaki gelişim sırasında fonksiyon kazanırken, indüklenebilir Treg (iTreg) periferde naif CD4+ T hücrelerin farklılaşması sırasında gelişir. Fare ve insan Tr1 hücreleri ile yapılan çalışmalarda, hücre yüzeyinde bulunan CD49b ve lenfosit aktivasyon geni 3 (LAG-3)'ün her ikisinin de aynı anda yüzeyde eksprese edilmesinin IL-10 salgılayan Tr1 hücrelerini Th1, Th2 ve Th17 hücrelerinden ayırdığı ortaya atılmıştır. Helicobacter felis ile yapılan fare enfeksiyon modeli çalışmalarında, Helicobacter ile aktive edilen B hücrelerinin in vivo ve in vitro koşullarda T hücrelerini IL-10 üreten CD4+CD25+ Tr1-benzeri hücrelere dönüştürdükleri gösterilmiştir. Bu çalışmalarda, B hücreleri tarafından indüklenen Tr1 hücrelerinin in vitro koşullarda baskılayıcı aktivite gösterdiği ve in vivo koşullarda Helicobacter'e bağlı immünopatolojiyi baskıladığı ortaya konmuştur. Ayrıca, daha önce laboratuvarımızda yapılan çalışmalarda, Helicobacter-aktive B hücrelerinin TGF-β ürettiği gösterilmiştir. Ancak Helicobacter-aktive B hücrelerinden, IL-10 üreten ya da üretmeyen gruplardan hangisinin T hücrelerini IL-10 üreten Tr1-benzeri hücrelere dönüştürmede rolü olduğu bilinmemektedir. Bu nedenle, bu çalışmada Helicobacter-aktive B hücre alt gruplarının CD4+ T hücre farklılaşmaları (Tr1 veya Th17) üzerine olan etkilerinin incelenmesi amaçlanmıştır. Manyetik izolasyon teknikleri kullanılarak, CD19+ B hücreleri ve CD4+ T hücreleri, C57BL/6 farelerin dalaklarından %90'dan yüksek saflıklarla izole edilmiştir. B hücre izolasyonunu takiben hücreler Helicobacter felis sonikatı ile 24 saat muamele edilmiştir. Optimum bir IL-10 üretimi için inkübasyonun son 5 saatinde PMA ve iyonomisin hücrelere eklenmiştir. B hücrelerinin Helicobacter felis sonikatı ile in vivo tetiklenmesinin ardından IL-10 üreten hücreler manyetik olarak etiketlenerek bu sitokini üretmeyen IL-10 negatif B hücrelerinden manyetik ayrım yöntemi ile ayrılmıştır. Helicobacter-aktive B hücre alt grupları olan IL-10+ HAKT-B hücreleri ve IL-10- HAKT-B hücrelerinin CD4+ T hücreleri üzerindeki etkilerinin incelenmesi için bu hücreler 24 saat boyunca ko-kültüre konmuştur. Helicobacter-aktive B hücre alt gruplarının CD4+ T hücre farklılaşmaları (Tr1 veya Th17) üzerine olan etkileri RNA (kantitatif PZR) ve protein düzeyinde (ELIZA, hücre içi akan hücre ölçer analizi) incelenmiştir. Hücre içinde özgün antikorlar ile boyanan IL-10 analiz sonuçları göstermektedir ki, hem IL-10+ HAKT-B hücreleri hem de IL-10- HAKT-B hücreleri CD4+ T hücrelerinde IL-10 üretimine yol açarak bu hücrelerin Tr1-benzeri hücrelere dönüşmesinde rol almaktadır. 24 saat ko-kültür boyunca hücre dışına salgılanan IL-10'un ölçümünde kullanılan IL-10 ELISA sonuçları da akan hücre ölçer sonuçlarını desteklemektedir. Aktive olmuş ve regülatör T hücrelerinin yüzeyinde bulunan CD25'in ve T hücrelerinde aktive olduktan sonra ekspresyonu azalan CD62L'nin özgün antikorlarla etiketlenerek akan hücre ölçerde analizlerinin sonucunda IL-10- HAKT-B hücreleri ile ko-kültürde tutulan CD4+ T hücrelerinin daha fazla aktive olduğu ya da farklılaştığı önerilmektedir. Literatürde regülatör T hücre belirteci olarak kullanılan CD49b ve LAG-3 yüzey belirteçlerinin birlikte eksprese edilmesinin incelenmesi sonucunda, IL-10+ HAKT-B hücreleri ile birlikte tutulan T hücrelerinin yaklaşık %20'si bu belirteçleri bir arada gösterirken, IL-10- HAKT-B hücreleri ile ko-kültürde tutulan T hücrelerinin ancak %10'u bu belirteci aynı anda eksprese etmektedir. İkincil olarak, Helicobacter-aktive B hücreleri ile etkileşime giren T hücrelerindeki IL-17 üretimi incelenmiştir. Hücre dışına salınımı engellenen IL-17 sitokininin hücre içi boyama sonuçlarına göre IL-10- HAKT-B hücreleri ile ko-kültürde tutulan T hücrelerinin %15'i IL-17 üretimi gerçekleştirirken, IL-10+ HAKT-B hücreleri T hücrelerinin yaklaşık %8'ini IL-17 üretmesi için tetiklemiştir. IL-17 ELISA sonuçlarının yanı sıra IL-17 üretiminde önemli bir transkripsiyon faktörü olan Ror gamma T ve IL-17'nin gen düzeyinde kantitatif PZR ile incelenmesinin sonuçları da akan hücre ölçer sonuçları ile paralellik göstermiştir. Bütün bu sonuçlar bir araya getirildiğinde, Helicobacter-aktive B hücre alt grupları her ikisinin de CD4+ T hücrelerinin IL-10 ürettiğini göstermiştir. Bu sonuçlara dayanarak, IL-10+ HAKT-B ve IL-10- HAKT-B hücrelerinin T hücrelerinin Tr-1 benzeri hücrelere dönüşmesinde etkisinin olduğu ortaya atılmıştır. Regülatör T hücre belirteci olarak kabul edilen CD49b-LAG3 yüzey belirteçlerinin ko-ekspresyonunun, IL-10+ HAKT-B hücreleri ile birlikte tutulan CD4+ T hücrelerinde daha yüksek olması bu hücrelerin regülatör profile daha yakın olduğunu önerirken, CD25 ve CD62L sonuçları IL-10- HAKT-B hücreleri ile ko-kültürde tutulan T hücrelerinin daha aktive olmuş/farklılaşmış olduğunu desteklemektedir. Fakat bu aktivasyonun ya da farklılaşmanın özgün olup olmadığı belli değildir. Bununla beraber, IL-17'nin hem protein düzeyinde hem de gen düzeyindeki incelemeleri CD4+ T hücrelerini Th17 benzeri hücrelere farklılaşmasında IL-10- HAKT-B hücrelerinin IL-10+ HAKT-B hücrelerine kıyasla daha fazla rolü olduğunu göstermiştir. Th17 farklılaşmasında TGF-betanın önemi göz önünde bulundurulduğunda, bu sonuçlar, daha önceden IL-10- HAKT-B hücrelerinin, IL-10 pozitif gruba göre daha fazla TGF-beta ve IL-6 ürettiğinin gösterilmesi ile tutarlıdır. Bu çalışma literatüre, Helicobacter-aktive B hücre alt grupları, IL10+ HAKT B ve IL10- HAKT B hücrelerinin, CD4+ T hücreleri ile ex vivo ilişkisini gösteren ilk çalışma olarak katkıda bulunmaktadır.