Molecular cloning and characterization of bile salt hydrolase genes (BSH) from Lactobacillus plantarum GD2

Safra Tuzu Hidrolaz (BSH) Enzimleri taurin ve glisin bağlı safra tuzlarını aminoasitlere parçalayan enzimlerdir. BSH'ların kesin fonksiyonu halen bilinmezliğini korumakla birlikte; beslenme, kolesterol düşürücü etki ve bağırsak kanserindeki rolü ile ilgili bazı hipotezler geliştirilmiştir. BSH'lar bağırsak florasında bulunan kommensal laktobasiller tarafından da sıklıkla sentezlenirler. Farklı laktobasil suşlarından elde edilen BSH'ların genomik varyasyonları, optimum pH, kinetik özellikler ve substrat seçiciliği gibi farklılıklar gösterdikleri görülmektedir. Bu çalışmada, Lactobacillus plantarum GD2 suşundan elde edilmiş bsh1 geni pET22b ekspresyon vektörüne klonlanmış ve yoğun şekilde ekspres edilmiştir. Gen öncelikle PZR vasıtasıyla türe özgü primerler kullanılarak çoğaltılmış ve sırasıyla pJET1.0 veya pBluescript II SK+ klonlama ve pET22b ekspresyon vektörlerine aktarılmıştır. Klonlar sırasıyla XL1-Blue ve BLR (DE3) Escherichia coli suşlarına aktarılmış, daha sonra 0.1 mM isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside ile indüklenerek ekspres edilmiştir. Yoğun olarak ekspres edilen rekombinant protein, B-PER 6xHis Füzyon Protein Pürifikasyon Kiti kullanılarak saflaştırılmış ve ninhidrin protein analizi yöntemi kullanılarak altı adet farklı konjuge safra tuzu ile dekonjugasyon testi yapılmıştır. bsh1, bsh2, bsh3 ve bsh4 olmak üzere dört gen L. plantarum GD2 suşunun genom dizisinde tanımlanmış ve sekanslanmıştır. bsh1 geninin dizileme sonuçları, daha önceden bilinen diziler ile karşılaştırıldığında; birçok mikroorganizmanın BSH enzimleri ile yüksek oranda homoloji gösterdiği görülmüştür. Saflaştırılmış Bsh1 enziminin biyokimyasal karakterizyonunda enzimde diğer Lactobacillus türlerinde görülmeyen bir takım özellikler ortaya çıkmıştır. Enzim gliko-konjuge safra asitlerini daha yüksek oranda parçalamaktadır ve en yüksek oranda glycodeoxycholic ile aktivite göstermiştir. Bu çalışmada, ileri düzey çalışmalar için Bsh1 enziminin primer yapısının karakterizasyonu ve analizleri yapılmıştır. Gelecekte aktif bölge, substrat bağlanma bölgesi, substrat seçiciliği gibi özelliklerin anlaşılması için, BSH enziminin korunmuş amino asitleri üzerinde yönlendirilmiş mutagenez ve yapısal analizler yapılması gerektiği düşünülmektedir.