Edinsel bağışıklık cevabının düzenlenmesinde nod-benzeri reseptör 11 (NLRP11)'in moleküler genetik karakterizasyonu

Bütün organizmalar patojenlere, yabancı maddelere ve rakiplerine karşı savaşmak adına en az bir çeşit savunma mekanizması geliştirmişlerdir. İnsanlar da dahil olmak üzere gelişmiş omurgalılar, 'bağışıklık sistemi' olarak da bilinen savunma mekanizmalarının en sofistike, en etkili ve en iyi organize olmuş biçimine sahiptirler. Yüksek omurgalılarda gördüğümüz bağışıklık sisteminin bu becerikliliği, bünyesinde barındırdığı doğuştan gelen 'doğal bağışıklığın' ve sonradan kazanılan 'edinsel (adaptif) bağışıklığın' birbirinden farklı ve birbirini tamamlayıcı etki mekanizmalarından kaynaklanır. Doğal bağışıklık enfeksiyona saatler içerisinde yanıt verir ve patojen kaynağını spesifik olmayan bir şekilde giderir. Buna karşılık olarak patojenler de doğal bağışıklıktan kaçmak için mekanizmalar geliştirmişlerdir. Bu patojenler bir takım mekanizmalarla doğal bağışıklığı atlarak enfeksiyon oluşturabilir. Doğal bağışıklık atlatıldığında patojenler bu kez, etkisi daha kuvvetli ve daha uzun süren, üstelik belirli bir patojene spesifik yanıt geliştiren edinsel bağışıklıkla karşılaşır. Bu iki sistem farklı aşamalarda ve farklı özelliklerde ancak birbirlerini tamamlayıcı ve uyum içerisinde çalışarak patojenlere karşı etkili bir savunma geliştirirler. Ancak edinsel bağışıklığı, doğuştan gelen bağışıklıktan ayıran katı çizgi uzun zamandır bulanıklaşmıştır. Doğal bağışıklık bileşenlerinin adaptif bağışıklığın düzenlenmesinde rolleri olabileceği artık bilinmektedir. Ayrıca, kalıp tanıma reseptörleri olarak bilinen Toll-benzeri reseptörler ve Nod-benzeri reseptörler gibi doğal bağışıklığın bazı elemanları edinsel immünitenin hücrelerinde de bulunur. Bu reseptörler patojen varlığının farkedilmesini ve ardından immün yanıtın başlatılmasını sağlalar. Fakat ne yazık ki Toll-benzeri reseptörler ve Nod benzeri reseptörler, adaptif bağışıklık düzenlemesi bağlamında pek fazla araştırılmamıştır. NLR ailesi PRR ailesinin nispeten yeni keşfedilmiş üyeleridir. Bu ailenin işlevleri neredeyse sadece doğal bağışıklık yönünden incelenmiştir. İnsanlarda NLR ailesinin bilinen 22 üyesi vardır ve bunlardan 4'ü inflamazom kompleksi olarak adlandırılan çoklu protein kompleksi oluşturmaktadır. İnflamazom kompleksi oluşturmanın yanısıra, NLR ailesinin arteroskleroz, tip II diyabet, obezite, Alzheimer, gut ve bakteri, virüs, parazit enfeksiyonları gibi çeşitli hastalıklarla ilişkileri olduğu gösterilmiştir. NLR ailesinin en yeni keşfedilen üyelerinden biri olan Nod-benzeri reseptör protein 11 sadece primatlarda eksprese olmaktadır. NLRP11 proteininin hücresel işlevi ve bu proteini aktive eden spesifik ligand(lar) bilinmemektedir. Bu tez, primatlarda ifade edilen bir Nod-benzeri reseptör ailesi üyesi olan NLRP11'in moleküler analizine odaklanmaktadır. NLRP11 hakkında yok denecek kadar az literatür bilgisi bulunmaktadır ve NLRP11 ile ilgili yapılan çalışmalar oldukça kısıtlıdır. Dolayısıyla Nod-benzeri reseptör ailesinin bu üyesinin bağışıklık sistemde ne gibi roller üstlendiği ve edinsel bağışıklık sistemini koordine etmede düzenleyici bir görevinin olup olmadığı büyük ölçüde bilinmemektedir. NLRP11'in insan Burkitt lenfoma hücrelerinden biri olan Daudi hücrelerinde yüksek oranda eksprese olması nedeniyle, deneyler boyunca bu hücre hattı kullanılmıştır. NLRP11'i aktive eden spesifik ligandlar bilinmediğinden LPS, CD40L, PMA/iono gibi çeşitli liganlar kullanılmıştır. Daudi hücreleri ayrıca adenosin A2A reseptörünü de yüksek oranda eksprese etmektedir. Adenozin reseptörleri (A1, A2A, A2B ve A3), adenozinin biyolojik etkilerine aracılık eden G-protein bağlı reseptörlerdir. Adenozin bir purin nükleozittir. Birçok bağışıklık hücresi üzerindeki purinerjik reseptörlerine bağlandıktan sonra adenozin, bağışıklık sistemin yanıtlarını regüle etmektedir. A2A reseptörüne bağlanarak adenozin, immün yanıtın baskılanmasına neden olmaktadır. Bu yönü nedeniyle adenozin birçok tümör hücresi tarafından bağışılık sistemin hücrelerinden kaçmak için kullanılmaktadır. Genel bir uyarıcıdan ziyade spesifik bir uyarıcı olan adenozinin etkilerini görmek içinbu tezde RT-qPCR ve western blot analizleri yapılmıştır. Yapılan bu analizler sonucunda NLRP11'in, bir anti-enflamatuar bileşik olan, adenozin ile stimülasyondan sonra hem mRNA hem de protein seviyelerinde arttığı tespit edilmiştir. Ayrıca, adenozin uyarımının süreleri arasındaki farklılıklar ile birlikte farklı adenozinin dozlarının etkileri araştırılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre, optimum adenozin konsantrasyonu 50 μM ve stimülasyon sonrası optimum 4 saat olarak seçilmiştir. Genel sonuçlar, NLRP11'in LPS, CD40L ve PMA/ionomycin uyarımına değil, adenozin uyarımına yanıt olarak artmış bir şekilde Daudi hücrelerinde ifade edildiği hipotezimizi kuvvetle desteklemektedir. Adenozinin NLRP11 üzerindeki arttırıcı etkisini doğrulamak için Adenozin A2A reseptörünün antagonisti olan ve adenosinin etkisini engellediği bilinen kafein kullanılmıştır. Sonuç olarak, kafeinin Daudi hücrelerinde adenozinin tersine etki yaparak, NLRP11 ekspresyonunu azalttığı gözlemlenmiştir. Bu bulgu NLRP11 in bir adenozin reseptörü tarafından control ediliyor olabileceği hipotezimizi desteklemektedir. NLRP1, NLRP3, NLRC4 ve AIM2 gibi NLR proteinlerinin aktivasyonunun ASC proteini ve kaspaz-1 enzimi içeren, inflamazom adı verilen çoklu protein kompleksinin oluşumuna neden olduğu bilinmektedir. Kaspaz-1 enziminin aktifleşmesi, IL-1β (İnterlökin-1β) ve IL-18 gibi pro-inflamatuar sitokinlerin olgun formlarına kesilmesi ile sonuçlam-nmaktadır. Daudi hücrelerinde adenozin yardımıyla artan NLRP11'in bir inflamazom kompleksi oluşturup oluşturmadığını incelemek adına, inflamzom üyelerinden ASC ile etkileşimleri araştırılmıştır. ASC ile NLRP11 etkileşimini anlamak için yapılan Ko-immünopresipitasyon (Birlikte-immün çöktürme) analizi, NLRP11'in adenozin ile stimülasyondan sonra ASC adaptör proteinine bağlandığını göstermiştir. Bununla birlikte, muhtemel bir inflamazom kompleksinin varlığını işaret eden olgun IL-1β ve IL-18 sitokinlerinin hücrelerden salgılanması, NLRP11-ASC etkileşimi sonrasında gözlenmemiştir. Ancak bu sitokinler mRNA seviyesinde Daudi hücrelerinde ifade edilmektedir. Bu bulgu, adenozin ile uyarılan Daudi hücrelerinde inflamazom kompleksinin bir diğer üyesi olan kaspaz-1 enziminin, NLRP11-ASC etkileşiminin neticesinde aktive olup olmadığı sorusunu gündeme getirmiştir. Kaspaz-1 enziminin aktivazyon durumu incelendiğinde adenozin uyarımının bu enzimin aktivasyonunu azaltığı gözlemlenmiştir. Ancak kaspaz-1 aktivasyon deneylerinin optimize edilmesi ve tekrarlanması gerekmektedir. B hücrelerinin bir diğer fonksiyonuda T hücrelerine antijen sunmaktır. B hücreleri T hücreleri ile etkileşime girerek daha kaliteli antikorlar üretmekte ve T hücresi yanıtını yönlendirebilmektedir. Daudi hücrelerinde NLPR11'in fonksiyonunu değerlendirdikten sonra, NLRP11'in; B hücreleri ile etkileşime giren insan primer T hücreleri üzerinden edinsel bağışıklık yanıtına etkisi bu tez ile incelenmiştir. Kısaca, NLRP11 ile ilgili çalışmalarımız NLR ailesinin bu üyesinin adaptif immün yanıtı nasıl şekillendirdiğini araştırmaktadır. Bu amaçla öncelikle antijen sunan hücre yeteneğini değerlendirmek için Daudi hücrelerinde B7.1 (CD80) ve B7.2 (CD86) yardımcı uyarıcı moleküllerin ekspresyon düzeyleri flow sitometri yöntemiyle incelenmiştir. Daudi hücrelerinin tipik bir antijen sunan hücre karakteristiği göstererek, bu yardımcı uyarıcı molekülleri hücre yüzyinde eksprese ettiği, ancak bu moleküllerin ekspresyon düzeylerinin NLRP11'e bağımlı olmadığı tespit edilmiştir. NLRP11'in T hücresi yanıtına etkisinin daha kapsamlı incelenebilmesi için, Daudi hücrelerinde NLRP11'in seviyesi siRNA ile azaltıldıktan sonra, kandan izole edilen insan primer CD4+ T hücreleri ile birlikte kültüre edilip, NLRP11'in T hücresi farklılaşmasına etkisinin anlaşılabilmesi için, primer CD4+ T hücrelerinden sitokin salınımı araştırılmıştır. Primer CD4+ T hücre sitokinlerinin analizi, NLRP11'in Th1 ve Th17 yanıtlarının baskılanmasına yol açtığnı ve siRNA ile NLRP11 protein seviyesinin azlatılması bu Thq ve Th17 yanıtlarının geri kazanılmasına sebep olduğunu göstermiştir. Ancak NLRP11 protein seviyesideki değişikliklerin Th2 ve Treg yanıtlarında belirgin farklılıklara neden olmadığı bulunmuştur. Bulgularımız, NLRP11'in inflamasyon ve edinsel bağışıklık sistemdeki rolleri hakkında aydınlatıcı ve ümit verici bilgiler vermenin yanı sıra, NLRP11'in T hücresi farklılaşmasını düzenlediği mekanizmayı anlamak için daha ileri çalışmalara zemin hazırlamakta ve T hücre yanıtı eksikliklerinden kaynaklanan bağışıklık sistemi ile ilişkili hastalıların tedavisi için yeni hedeflerin olasılığını arttırmaktadır.