Karışık kültürden biyobozunur polimer eldesi

Polihidroksialkanoatlar (PHA) biyobozunur, biyouyumlu, toksik olmayan ve uygun maliyetli poliesterler olduklarından geleneksel petrol bazlı plastiklere alternatif oluşturmaktadırlar. Yapıtaşları hidroksil grubu içeren yağ asitleri olmakla birlikte pek çok mikroorganizma tarafından hücreiçi karbon ve enerji kaynağı olarak üretilir ve depolanırlar. PHA'lar çevre dostu oldukları ve yenilenebilir kaynaklardan elde edilebildikleri için laboratuvar düzeyinde üretimleri kadar yüksek ölçekli endüstriyel üretim potansiyellerinin arttırılması da araştırma odağı olmuştur. Son yıllarda sürdürülen bu araştırmalar ile en yaygın PHA üretimi şekli olan saf kültürde üretimine alternatif stratejiler aranmaktadır. Geliştirilen stratejiler içerisinde Karışık Mikrobiyal Kültür (KMK) çalışmaları, sterilizasyon aşamaları gerektirmediği ve atıksular gibi ucuz besi kaynakları kullanılabildiği için saf kültür üretimlerine görece tercih konusu olmuştur. Karışık kültürden PHA üretimi kültür zenginleştirme ve PHA depolama olmak üzere iki ana basamaktan oluşmaktadır. Kültür zenginleştirme basamağı için ardışık anaerobik / aerobik fazlar ya da ardışık açlık / tokluk fazları uygulanır. Her iki metod için de uygun olan ve bu yüzden de en çok tercih edilen reaktör tipi Ardışık Kesikli Reaktördür (AKR). Bu aşamada doğal olarak PHA üretip depolama yeteneği olan mikroorganizmaların kültür içerisinde zenginleşerek baskın tür haline gelmeleri sağlanır. PHA üreten mikroorganizmaları sayıca arttırdıktan sonra asıl amaç olan PHA depolama basamağına geçilir. Bu basamakta genellikle zenginleştirilmiş kültür kesikli reaktörler ile işletilir. Bu tez çalışmasının ana amacı karışık kültür kullanarak yüksek kapasitede PHA depolaması sağlamak için proses koşullarını optimize etmek ve süreç içinde kimyasal ve biyolojik parametreleri takip etmektir. Bu amaçla uzun süreli bir kültür zenginleştirme aşaması uygulanmıştır. Konuyla ilgili yapılan literatür araştırmaları sonucunda zenginleştirme basamağı için en karlı stratejinin Aerobik Dinamik Besleme (ADB) olarak bilinen proses olduğu görülmüştür. ADB temel anlamda oksijen, karbon ya da nitrojen limitasyonunun olmadığı, birbirini takip eden kısa süreli tokluk ve uzun süreli açlık fazlarının mikrobiyal kültüre uygulanmasını temsil etmektedir. Bu doğrultuda Paşaköy Atıksu Arıtma Tesisi'nden (İstanbul) alınan aktif çamur AKR'de ADB rejiminde 10 günlük çamur tutma süresi ve 12 saatlik açlık/tokluk fazlarıyla karbon kaynağı olarak asetik asit, azot ve karbon kaynağı olarak da pepton olan sentetik atıksu ile beslendi. Zenginleştirme süreci boyunca reaktörün Askıda Katı Madde (AKM) ve Uçucu Askıda Katı Madde (UAKM) ölçümleri yapıldı ve haftalık olarak PHA numunesi alındı. AKM ve UAKM ölçümleri ile reaktörün kararlı duruma geçip geçmediği gözlendi. 20 aylık kültür zenginleştirme basamağı sonucunda elde edilen zenginleştirilmiş kültür kullanılarak PHA depolama basamağına geçildi. Bunun için Uçucu Yağ Asiti (UYA) açısından zengin endüstriyel bir atıksu ile 6 saatlik kesikli reaktörde işlem yapıldı üretim kapasitesinin azami seviyeye çıkması için gerekli koşulların belirlenmesi amacıyla dört farklı atıksu/mikroorganizma oranı denendi. Bunlara ek olarak PHA üretim sonuçlarını karşılaştırabilmek için asetik asit ile bir adet referans kesikli reaktörü kuruldu. Zenginleştirme basamağının PHA üretimi üzerindeki etkisinin tam olarak belirlenmesi için yukarıda bahsedilen endüstriyel atıksu ile kesikli reaktör deneyleri aynı şartlar korunarak hem zenginleştirme öncesi karışık kültüre hem de zenginleştirilmiş kültüre uygulandı. Her iki kesikli reaktör deney grubunun PHA üretim sonuçları karşılaştırıldı. Çalışmanın moleküler biyoloji ayağında ise zenginleştirme basamağı sırasında mikrobiyal komünite profilindeki değişimler 16S rRNA temelli polimeraz zincir reaksiyonunu izleyen (PZR) denaturan gradyan jel elektroforezi (DGJE) analizleriyle incelendi. DGJE'de gözlenen profiller BioNumerics 5.1 yazılımı kullanılarak analiz edildi. Ayrıca burada tamamlanan moleküler analizlerin doğrulaması amacıyla 16S rRNA temelli Yeni Nesil Sekanslama (YNS) analizi ile tür değişimleri gözlenip domine olan türler belirlendi. Zenginleştirme sürecinde reaktörün 1 ADB döngüsü içindeki takibi yapılmış ve tokluk fazı sürecinde %95 Kimyasal Oksijen İsteği (KOİ) ve %100 Uçucu Yağ Asiti (UYA) tüketimi olduğu gözlendi. Ayrıca haftalık alınan PHA örneklerinin analizi ile kültürde bulunan mikroorganizmaların PHA üretim kapasitesinin %0.47 (g PHA/g kuru biyokütle)'den % 4.1 (g PHA/g kuru biyokütle)'ye çıktığı görüldü. Üretim kapasitesindeki bu on katlık artış, uygulanan beslenme rejiminin PHA üreten mikroorganizmaların şartlara daha iyi uyum sağlayarak kültürü domine ettiklerini kanıtlamıştır. Zenginleştirme sürecinin başında ve sonunda kurulan endüstriyel atıksu ile beslenmiş kesikli reaktörlerin PHA üretimleri karşılaştırıldığında zenginleştirilmemiş kültürün yüksek atıksu miktarında bile en fazla %4.44 g PHA/g kuru biyokütle üretilirken zenginleştirilmiş kültürün % 43 g PHA/g kuru biyokütle ürettiği görülmüştür. Ek olarak yapılan KOİ ve UYA analizleri ile de zenginleştirilmemiş kültürün endüstriyel atıksuyu etkili bir şekilde kullanamadığı, bunun da PHA üretimine olumsuz yansıdığı anlaşılmıştır. Kullanılan endüstriyel atıksu alkaloid fabrikası atıksuyu olduğundan birçok farklı UYA'ini karışım olarak yüksek miktarda içermektedir. Gaz kromotografisi ile yapılan PHA analizinde gerçek atıksu ile kurulan kesikli reaktörlerde hem PHB hem de PHV üretimi görülürken, asetik asit ile kurulan referans reaktörlerinde yalnızca PHB üretimi görülmüştür. Her bir kesikli reaktör grubu çalışması kendi içerisinde değerlendirildiğinde artan atıksu miktarının üretilen PHA miktarını da aynı oranda arttırdığı görülmüştür. Zenginleştirilmiş kültürün PHA üretimi aşamasında F/M 2 oranında kullanılan atıksu miktarı yetersiz geldiğinden 6 saatlik kesikli deney sürecinde üretilen toplam PHA'nın 90. dakikadan itibaren parçalanmaya başlandığı görüldü. Bunların dışında yapılan moleküler analizlerde ise mikrobiyal komünite değişimi taksonomik düzeyde incelenmiştir. 20 aylık tür zenginleştirme sürecinin ilk 12 ayında alınan örneklerle yapılan 16S rRNA temelli DGJE analizi ile reaktörün 12 ay sonunda reaktörün ilk aşı örneğine göre %76.4 oranda farklılaştığı görülmüştür. Ayrıca 12. Ay içerisinde alınan haftalık örneklerin de birbirlerine %80 oranında benzediği anlaşılmıştır. Bu benzerlik-farklılık yüzdeleri ile AKR'nin gerekli profil değişimini yaşadıktan sonra kararlı hale ulaştığı ve mikrobiyal profil düzeyinde büyük değişimler geçirmediği çıkarımı yapılabilir. Yeni Nesil Sekanslama sonuçları da DGJE analiz sonuçlarını destekler şekilde zenginleştirme sürecinin başarılı olduğunu göstermiştir. Sekans analizlerine dayanarak yapılan taksonomik sınıflandırma ile 20 aylık kültür zenginleştirme süreci sonunda literatürde de belirtildiği üzere Alfa-proteobakteri sınıfından olan Shinella cinsinin %49'luk bir oranla kültür içerisindeki sayıca en baskın tür olduğu anlaşılmıştır. Bu grup başlangıç aşı topluluğunda bulunmamıştır. Tüm analitik ve moleküler sonuçlar birbirini destekler şekilde karışık mikrobiyal kültürden PHA üretimi prosesinde kültür zenginleştirme aşamasının prosesin en önemli basamağı olduğunu kanıtlamıştır. PHA üretim kapasitesi iki basamaklı zenginleştirme ve üretim stratejisi ile on katına çıkmıştır. Kullanılan endüstriyel atıksu ile saf kültürde yapılan PHA üretimi kadar yüksek oranda PHA üretimi sağlanmıştır. Bu bağlamda sıfır maliyetli atıksu kullanımı ile sürdürülebilir ve yenilenebilir biyoplastik eldesi sağlanarak biyo-ekonomiye yeni fırsat yolları açılmıştır. Laboratuvar araştırması düzeyinde yapılan bu çalışma zenginleştirme basamağının da gerçek endüstriyel atıksu ile yapılması ve bu süreçte etkili olabilecek çamur tutma süresi, sıcaklık, pH gibi kinetik parametrelerin de sonuca etkisinin araştırılması ile geliştirilebilir ve ölçek büyütme aşamasına geçilebilir.