Toksikolojide in vitro hücre temelli sitotoksisite çalışmaları

Yeni ilaç keşif ve geliştirme çalışmalarında en büyük zaman, maliyet ve emek kaybına neden olan durumlardan birinin çalışmaların geç evrelerinde aday bileşiklerin toksisiteye sahip olduğunun görülmesi ve o aşamaya kadar yapılan tüm çalışmaların bir kenara atılması olduğu ifade edilmektedir. Bu nedenle ilaç endüstrisi ve yasal düzenleyici kuruluşlar, ilaç keşif ve geliştirme çalışmalarının erken evrelerinde uygulanacak in vitro hızlı tarama testleri ile maddelerin sitotoksisitelerinin araştırılmasının bu kayıpları kısmen de olsa önleyeceğini ifade etmektedir. Bu bilgi ve öneriden hareketle bu tez proje çalışmasında bitkisel diyet destek ürünleri içerisinde yer alan bir flavonoid (apigenin) ve bir biflavonoid (amentoflavon) yapısında iki bileşiğin sağlıklı bir hücre hattı olan Çin Hamster Over (CHO) hücrelerinde olası sitotoksik etkileri 3 farklı yöntem ile araştırılmıştır. Bunlar; ölü hücrelerin boyanması ve mikroskop altında sayımı esasına dayanan "Tripan Mavisi Deneyi", hücrenin metabolik aktivitesinin göstergesi olan "MTT Deneyi" ve membran hasarı/bütünlüğünün göstergesi olarak Laktat Dehidrojenaz enzimi (LDH) Sızma Testi'dir. Öncelikle yöntemlerin bilinen sitotoksik bir referans madde varlığında kısmi validasyonları gerçekleştirilmiş, ardından maddelerin her üç yöntemle sitotoksik potansiyelleri araştırılmıştır. Bu maddelerden amentoflavonun son yıllarda bazı yararlı biyolojik etkileri olabileceği yönünde çalışmalar yapılmakta ancak literatürde toksisite potansiyeli konusunda veri bulunmamaktadır. Dolayısı ile bu çalışmada amacımız amentoflavonun olası sitotoksik etkisini ortaya koymak ve üç farklı mekanizma üzerinden etkinin belirlendiği bu testlerle olası sitotoksik etkisinin mekanizmasını aydınlatmaktır. Bulgularımız her üç yöntem içinde tripan mavisi deneyinin en yüksek standart sapma değerlerine sahip olduğunu ve MTT deney bulgularının daha hassas sonuç verdiğini göstermiştir. Amentoflavonun tripan mavisi, LDH ve MTT deneylerinde aynı konsantrasyonda sitotoksisite göstermesi bu maddenin 100 µM konsantrasyonda hücre membran hasarı ile hücre ölümüne yol açtığını düşündürmektedir. Apigeninin membran hasarına bağlı hücre canlılığının belirlenmesinde kullanılan tripan mavisi ve LDH deneylerinde korelasyon görülmemiştir ancak MTT deneyinde sitotoksik konsantrasyonu 33.3 µM olarak bulunmuştur. Bu nedenle apigeninin sitotoksik etkisinin mitokondriyal hasarla gerçekleştiği düşünülmektedir. Ayrıca bu bilgiden hareketle MTT deneyinin sitotoksisitenin belirlenmesinde mitokondriyal enzim aktivitesini esas aldığı için hücre hasarının erken aşamada belirlenmesinde yararlanılacak bir yöntem olduğu ortaya konmuştur.