Effect of transglutaminase on emulsifying properties of caseinomacropeptide

Kazeinomakropeptid (KMP) peynir üretimi sırasında oluşan biyolojik aktiviteye sahip bir polipeptiddir ve gerek fizyolojik ve besinsel, gerekse teknolojik özellikleri bakımından son yıllarda araştırılmaktadır. Bu çalışmada, kazeinomakropeptidin emülsiyon özelliklerine transglutaminaz (Tgaz) enziminin etkisi incelenmiştir. Ayrıca enzimsiz ve enzimli KMP'nin emülsiyon özellikleri sodyum kazeinat ve peyniraltı suyu protein izolatının özellikleri ile karşılaştırılmıştır. Çalışmanın ilk aşamasında, uygun emülsiyon koşulları belirlenmesi için denemeler yapılmıştır. Peptid konsantrasyonu %0,25-5,00, iyonik kuvvet (0-500 mM NaCl) ve pH'nın (2,0-10,0) emülsiyon aktivite ve stabilitesine etkileri belirlenmiştir. Emülsiyonlar hacimce %25 ayçiçek yağı ve %75 protein çözeltisi kullanılarak ve elde edilen karışım 15500 rpm'de 2 dk homojenize edilerek hazırlanmıştır. Protein çözeltilerinin hazırlanması aşamasında gerekli miktarda proteinler tartıldıktan sonra deney dizaynına göre distile su veya 0,1 M fosfat buffer kullanılarak uygun derişime sahip protein çözeltileri hazırlanmıştır. Çözeltiler 15 dakika magnetik karıştırıcı yardımı ile orta hızda karıştırıldıktan sonra 15 dakika boyunca da ultrasonik karıştırıcı yardımıyla çözündürülmüştür. Ardından 4°C'de 24 saat depolanarak iyice hidrate olmaları sağlanmıştır. Emülsiyon özelliklerinin belirlenmesi aşamasında kullanılan parametreler; emülsiyon aktivite indeksi (EAI), emülsiyon stabilite indeksi (ESI), kremalaşma indeksi ve emülsiyon kapasitesidir (EC). Emülsiyon aktivite ve stabilite indeksleri türbidimetrik olarak belirlenmiştir. 9 mL protein çözeltisi ve 3 mL yağ kullanılarak emülsiyon örnekleri hazırlanmıştır. Hazırlama işleminin hemen ardından emülsiyondan 50 µL örnek alınmıştır ve 20 mL %0,1 (kütle/hacim) SDS çözeltisi ile seyreltilmiştir. Seyreltme işleminin ardından spektrofotometrede 500 nm'de ABS değeri okunmuştur ve emülsiyon aktivite indeksi hesabı yapılmıştır. 15 dakika sonra tekrar aynı emülsiyon örneğine ait 50 µL örnek alınıp 20 mL %0,1 (kütle/hacim) SDS çözeltisi ile seyreltilmiştir. Seyreltme işleminin ardından 500 nm'de ABS değeri okunmuştur ve emülsiyon stabilite indeksi hesaplanmıştır. Emülsiyon kapasitenin belirlenmesi için %2 (kütle/hacim) protein çözeltisine ait örneklerden 4 mL alınarak farklı yağ fraksiyonlarında emülsiyonlar hazırlanmıştır. Emülsiyonun, su içinde yağ emülsiyonundan yağ içinde su emülsiyonuna döndüğü minimum yağ miktarı iletkenlikölçer ile tespit edilmiştir. Emülsiyonun iletkenliğinin ani bir düşüş gösterdiği durum faz değişiminin olduğu nokta olarak kabul edilmiştir. Faz dönüşümüne neden olan minimum yağ miktarı belirlendikten sonra hesaplama yapılmıştır. Kremalaşma indeksinin belirlenmesi için ise 9 mL protein çözeltisi ve 3 mL yağ kullanılarak hazırlanan emülsiyonlardan 0. dakika için TScan yardımı ile ölçüm alınmıştır. Örnekler 4°C'de 24 saat bekletildikten sonra tekrar TScan ile ölçüm alınmıştır ve gerekli hesaplamalar yapılmıştır. Peptid konsantrasyonunun emülsiyon özelliklerine etkisini belirlemek için peptid konsantrasyonu %0,25-5,0 oranlarında değişen, sabit iyonik güç (10mM NaCl) ve pH (pH 8,0) değerindeki emülsiyonlar hazırlanmıştır. Emülsiyon stabilite indeksi (ESI) konsantrasyon değişikliğinden etkilenmezken emülsiyon aktivite indeksi (EAI) ve faz ayrılma yüzdesi olarak da tanımlayabileceğimiz kremalaşma indeksi konsantrasyon artışıyla paralel olarak düşmüştür. İyonik gücün KMP emülsiyonu üzerindeki etkisini belirlemek için ise, %0,5 peptid konsantrasyonunda sabit pH 8,0'de iyonik kuvvet 0-500 mM NaCl aralığında değiştirilerek emülsiyonlar hazırlanmış ve emülsiyonların özellikleri incelenmiştir. Maksimum EAI değeri 10 mM NaCl varlığında görülmüş ve tuz miktarı arttıkça EAI değerinin düştüğü gözlenmiştir. ESI ve kremalaşma indeksi değerleri iyonik güç değişiminden önemli derecede etkilenmemişlerdir. Emülsiyon özelliklerinin pH değişimi ile gösterdiği farklılıkları belirlemek için %0,5 KMP konsantrasyonunda iyonik güç 10 mM NaCl varlığı ile sabit tutularak 2,5-10,0 pH aralığında emülsiyonlar hazırlanmıştır. KMP'nin emülsiyon akvitesinin ve stabilitesinin pH 4,0 dolaylarında en düşük değerlere sahip oldukları bulunmuştur. Bu çalışmalardan elde edilen sonuçlar neticesinde %0,5 protein konsantrasyondaki 10 mM NaCl ile sabit iyonik kuvvete sahip olan KMP çözeltilerinin emülsiyon hazırlanmasında kullanılmasına karar verilmiştir. Çalışmanın ikinci aşamasında Tgaz enzimi uygulamasının kazeinomakropeptidin emülsiyon özellikleri üzerindeki etkisi incelenmiştir. 1, 5 ve 20 U Tgaz/g KMP aktivitede Tgaz ile 40°C'de 1 saat muamele edilmiş, enzim inaktivasyonu için 80°C'de 2 dakika ısıl işlem uygulanmış, KMP çözeltilerinin 3,5, 4,5 ve 6,5 pH'lardaki emülsiyonları oluşturulmuş ve bu çözeltilerden elde edilen emülsiyonların özellikleri incelenmiştir. Yapılan çalışmaların sonucunda, 1 U Tgaz/g KMP kullanımının emülsiyon özelliklerinde değişikliğe neden olmadığı görülmüştür. 5 U Tgaz/g protein enzim kullanımı ise pH 4,5'da etkisini en fazla şekilde gösterirken diğer pH değerlerinde çok fazla değişikliğe neden olmamıştır. 20 U Tgaz/g KMP enzim kullanımı ise her üç pH değerinde de EAI ve ESI değerlerini önemli derecede arttırken pH 3,5'da kremalaşma indeksini önemli derecede düşürerek kazeinomakropeptidin emülsiyon özelliklerini önemli düzeyde iyileştirmiştir. Sonuç olarak, kazeinomakropeptidin emülsiyon özelliklerinin en fazla 20 U enzim kullanımı ile pH 3,5'da iyileştiği saptanmıştır. Enzim kullanımının emülsiyon kapasitesi 1 U Tgaz/g KMP kullanımı ile artarken daha yüksek miktarlardaki enzim uygulamaları emülsiyon kapasitesini etkilememiştir. Enzim inaktivasyonu için uygulanan ısıl işlemin emülsiyon özelliklerine etkisini belirlemek için ise, işlem uygulanmayan KMP çözeltisi, sadece ısıl işlem uygulanan KMP çözeltisi, sadece enzim uygulanan KMP çözeltisi ve enzim ve ısıl işlem uygulanan KMP çözeltisi kullanılarak oluşturulan emülsiyonların özellikleri incelenmiştir. İncelenen tüm pH değerlerinde 20 U Tgaz/g KMP enzim kullanılan ve inaktivasyon işlemi uygulanan emülsiyonların özelliklerinin diğer emülsiyonların özelliklerinden daha iyi olduğu saptanmıştır. Sodyum kazeinat ve peyniraltı suyu protein izolatı ile karşılaştırıldığında KMP'nin emülsiyon kapasitesinin yüksek olmasına rağmen aktivite ve stabilite özelliklerinin farklı olmadığı saptanmıştır. 20 U Tgaz/g KMP enzim ile muamele edilen KMP emülsiyonu sodyum kazeinat ve peyniraltı suyu protein izolatı emülsiyonları ile kıyaslandığında ise EAI ve ESI değerlerinin en fazla olan örnek olduğu görülmüştür. Enzimli ve enzimsiz KMP'nin kremalaşma indeksi değerleri diğer emülgatörlerden farksız bulunmuştur. Sonuç olarak 20 U Tgaz/g KMP enzim kullanımı ile kazeinomakropeptidin emülsiyon özellikleri önemli ölçüde iyileştirilmiştir.