Theses supervised by Prof. Dr. Tarlan Mammedov
16 theses · Akdeniz University
SARS-Cov-2 spike proteininin reseptör bağlanma bölgesinin (RBD), Fc bölge ile birleştirilmiş formunun Nicotiana Benthamiana btkisinde mühendisliği ve üretimi
Şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2'nin (SARS-CoV-2) neden olduğu koronavirüs hastalığı 2019 (COVID-19) pandemisi, küresel sağlık ve ekonomi için ciddi tehditler oluşturmuştur. COVID-19 salgını, SARS-CoV-2 enfeksiyonuna karşı güvenli ve etkili aşılara duyulan ihtiyacı öne çıkarmaktadır. Günümüzde birçok aşı hastalıkla mücadele için kullanılmakta ve geliştirilmektedir. SARS-CoV-2'nin spike proteinindeki reseptör bağlama alanı (RBD), virüsün konak hücredeki anjiyotensin dönüştürücü enzim 2 (ACE2) reseptörüne bağlanmasından sorumludur. Çoklu baskın nötralize edici epitoplar içerir ve COVID-19 aşılarının geliştirilmesi için önemli bir antijen görevi görür. Fc, füzyon proteininin doğru katlanmasını destekler ve antijen sunan hücrelere bağlanmayı arttırır. Bu tez çalışmasında RBD ve Fc bölgelerinin birleştirilmiş formunun (RBD-Fc) Nicotiana Benthamiana bitkisinde üretimi amaçlanmış olup bu bağlamda yapılan deneysel çalışmalar başarıyla gerçekleştirilmiştir. Sonuç olarak RBD-Fc proteini N. Benthamiana bitkisinde üretilmiştir. Ayrıca üretilen proteinin ACE2 reseptörüne bağlanma afinitesi olduğu belirlenmiştir.
Nicotiana benthamiana bitkisinde SUMO-G füzyon proteininin (small ubiquitin-like modifier domain ve rabies glycoprotein (G)) mühendisliği ve ekspresyonu
Kuduz, kuduz virüsünün neden olduğu, en yaygın onuncu ölümcül enfeksiyon hastalığı olup, merkezi sinir sisteminin akut bulaşıcı bir enfeksiyonudur. Hastalık evcil ve vahşi hayvanlar aracılığıyla yayılmakta ve her yıl dünya çapında tahmini 60.000 insanın ölümüne neden olmaktadır. Kuduz glikoproteini (G), viral patogenezde önemli bir rol oynar ve koruyucu bir antijen olarak işlev görür. Günümüzde kuduz hastalığına karşı insan ve hayvan aşıları mevcut olmasına rağmen, bunlar pahalıdır, üretimleri zahmetlidir ve nispeten zayıf bir immünojeniteye sahiptir. Protein translasyon sonrası modifikasyonlarından SUMOlasyon'un protein hücre altı lokalizasyonunu, protein-DNA bağlanmasını, protein-protein etkileşimlerini, transkripsiyonel düzenlemeyi, DNA onarımını ve genom organizasyonunu düzenlediği bildirilmiştir. Bir partner proteinin N-terminaline oldukça stabil bir yapının (SUMO gibi) eklenmesi, stabiliteyi artırarak verimi arttırır. İlgilenilen proteinlerle kaynaşmış SUMO, proteinlerin doğru katlanmasına yardımcı olarak ekspresyonu önemli ölçüde geliştirir ve çözünürlüğü destekler. Bitki bazlı geçici ekspresyon sistemi, aşı antijenleri, terapötik proteinler, antikorlar ve endüstriyel enzimler dahil olmak üzere çeşitli rekombinant proteinlerin üretimi için umut verici bir teknolojidir. Bu sistemler, hızlı üretim zaman çizelgesi, düşük maliyetli girdi, yüksek düzeyde ölçeklenebilir, yüksek üretim kapasitesi ve memeli patojenlerini barındırmayan diğer ifade sistemlerine göre üstün faydalar sunar. Bu çalışmada protein translasyon sonrası modifikasyonlarından Sumolasyona ait Sumo proteini ile kuduz virüsüne ait yüzey glikoproteini (GP) füzyon olarak (SumoGP) bitki geçici ekspresyon sisteminde kısa sürede başarıyla üretilmiştir. Sumo`ya özgü proteaz SENP1 enzimi de bitki geçici ekspresyon sistemiyle başarıyla ve yüksek saflıkta üretilmiştir. SENP1 ile SumoGP füzyon proteini koekspresyonları bitki geçici ekspresyon sisteminde açıkça ifade edilememiştir. Bununla ilgili SENP1 üzerinde aktivasyon çalışmaları devam etmektedir. ANAHTAR KELİMELER: Kuduz G proteini, Sumolasyon, SUMO, Bitki Geçici Ekspresyon Sistemi, Nicotiana Benthamiana, Kuduz
Yeşil mikroalg chlamydomonas reinhardtii'de piruvat, ortofosfat dikinaz (PPDK) kodlayan iki genin izolasyonu, klonlaması ve ekspresyon analizi
Günümüzde mikroalgler yenilenebilir enerji, ilaç, gıda ve kozmetik endüstrilerindeki geniş uygulama alanları nedeniyle dünya çapında büyük ilgi görmektedir. Yeşil alg Chlamydomonas reinhardtii, fotosentetik hücrenin kullanışlı bir modelidir ve bir dizi fizyolojik sürecin araştırılması için yoğun bir şekilde kullanılmaktadır. Son zamanlarda, C. reinhardtii' ye nükleer ve organel transformasyon (nükleer, kloroplast ve mitokondriyal) sistemleri, RNA etkileşimi, CRISPR vb. dahil olmak üzere birçok moleküler teknoloji uygulanmıştır. Bu nitelikler, C. reinhardtii' yi mikroalglerde lipit birikimini artırmak amacıyla C. reinhardtii' nin genetik ve metabolik mühendisliğini gerçekleştirmek için ideal bir alg organizması yapmaktadır. Şu anda mikroalglerde yağ birikimini kontrol eden moleküler mekanizmalar hakkında çok az bilgi mevcuttur. C4 fotosentez metabolik yolları (C4 metabolik yolu ile CO2 fiksasyonu) bitkilerde yüksek oranda karbondioksit fiksasyonu için gereklidir. Alglerin yüksek biyokütle birikimi için yüksek fotosentez oranları önemlidir. Bununla birlikte şaşırtıcı bir şekilde, C. reinhardtii' deki fosfoenolpiruvat karboksilaz genlerinin moleküler karakterizasyonuna odaklanan çabalar dışında, C4 yolu enzimleri ve düzenleyici faktörleri herhangi bir yeşil algde moleküler seviyede incelenmemiştir. Bu çalışmada, yeşil mikroalg C. reinhardtii' den iki Piruvat, ortofosfat dikinaz (PPDK) geni ilk kez izole edilerek klonlanmış ve farklı büyüme koşullarında ekspresyon analizi yapılmıştır. İki PPDK geninin C. reinhardtii' de fonksiyonel aktif PPDK enzimlerini kodladığını ve her iki genin de C- ve N-yanıt veren genler olduğunu ve büyüme sırasında [CO2] veya [NH4+]' deki değişikliklerle yukarı/aşağı regüle edildiğini gösterdik. PPDK1 ve PPDK2' nin ve diğer PPDK' lerin sayısının filogenetik analizi, üç genel grupta bir kümelenme ortaya çıkardı: (i) CrPPDK2, CrPPDK1 ve VcPPDK' nin (Volvox carteri, C. reinhardtii ile yakından ilişkili) uzak üyeler olduğu tipik vasküler bitki enzimleri; ii) bakteriyel ve iii) protozoal PPDK' ler. CrPPDK2, bitki PPDK' leri ile daha fazla benzerlik gösterirken, CrPPDK1 ise, VcPPDK ile daha fazla benzerlik göstermektedir. Bitki ve alg PPDK proteinleri, bakterilerden çok bazı protozoa ile yakından ilişkilidir. Kolektif bulgular, ökaryotik alglerde PPDK1 ve PPDK2 genleri ve karşılık gelen PPDK enzimleri hakkında temel moleküler bilgiler sağlamaktadır. Bu çalışmalar, alg biyokütlesini artırma ve yağ açısından zengin algler üretmek için alg hücrelerinde protein depolamaya karşı yağ depolama seviyelerini değiştirmeye yönelik uygulamalar üzerinde önemli bir etkiye sahip olacaktır.
Deglikolize kolisin M ve K formlarının bitkide ın vıvoüretimi, saflaştırılması, karakterizasyonu ve doğal gıda katkı maddesi olarak kullanım olanakları
Günümüzde gıdalarda yaygın olarak bulunan bakteriyel patojenlere karşı artan direnç, küresel halk sağlığı ve gıda güvenliği için kritik bir tehdit oluşturmaktadır. Ayrıca tüketicilerin kimyasal katkı maddesi içermeyen doğal gıdalara olan talebinin artması bilim insanlarını alternatif gıda koruyucuları bulmaya yöneltmiştir. Kolisinler, belirli Escherichia coli (E. coli) suşları tarafından üretilen, konakçı olmayan E. coli suşlarını öldüren ve diğer bakteri suşları ile rekabeti azaltmak için çevreye salınan antimikrobiyal proteinlerdir. Kolisin-M, dış hücre zarını tahrip ederek yakından ilişkili diğer bakteri suşlarına etki eden bu grubun bir üyesidir ve FDA tarafından güvenli (GRAS) olarak kabul edilmiştir, bu nedenle güçlü bir antimikrobiyal madde olarak büyük bir potansiyele sahiptir. Kolisin M (CM), geçici ekspresyon sistemi kullanılarak bitkilerde rekombinant olarak eksprese edilmiş ve antimikrobiyal aktivitesi gösterilmiştir. Bakteriyel protein olarak kolisin M, doğal konakçılarda glikozile edilmez ve bu nedenle bitkiler dahil herhangi bir ökaryotik sistemde anormal şekilde glikozile edilir. Bakteriyel Endo H deglikozilasyon enzimi ile ortak ifade yoluyla hedef proteinleri glikozile edilmemiş bitkiler de dahil olmak üzere ökaryotik sistemde proteinler üretmek için sağlam bir teknoloji geliştirilmiştir. Bu teknoloji, şarbona, sıtmaya, Covid-19'a, kuduza karşı aşı üretmek ve bazı terapötikler için başarıyla uygulanmıştır. Bu çalışmanın amacı, Nicotiana benthamiana (N. benthamiana)'da N-glikozile edilmemiş, doğal benzeri formda Endo H deglikozilasyon teknolojisi kullanılarak rekombinant Kolisin-M üretmektir. Bu çalışmada, enzimatik Endo H deglikozilasyon teknolojisi kullanılarak, N. benthamiana bitkisinde hem glikozile edilmiş (gCM) hem de-glikozile edilmiş (dCM) formda rekombinant kolisin M ürettik ve bunların antimikrobiyal aktivitesi ve stabilitesi karşılaştırmalı olarak incelenmiştir. Kolektif bulgularımız, dCM'nin glikozile edilmiş formuyla karşılaştırıldığında stabilitesinin ve aktivitesinin daha yüksek olduğunu gösterdi. Karşılaştırma için Kolisin K (CK), N. benthamiana'da hem Endo H ile hem de Endo H olmadan ifade yoluyla üretildi. CK'nin birkaç potansiyel N-glikozile edilmiş bölgesi olmasına rağmen, sonuçlarımız CK'nin N. benthamiana bitkisinde eksprese edildiğinde glikozile olmadığını doğruladı. Rekombinant bitki tarafından üretilen proteinler (hem Endo H ile ortak ifade ile hem de olmadan), Ni-kolon afinite kromatografisi kullanılarak kısmen saflaştırıldı ve stabilite ve aktivite açısından karakterize ettiğimiz kısmi saflaştırılmış CK proteinlerinde Endo H ile ifade edilen veya edilmeyen CK'ler arasında anlamlı bir fark gözlenmedi. Tez çalışmasından elde edilen sonuçlar; bitkide üretimi gerçekleştirilen gCM ve dCM proteinlerinin SDS-PAGE ve Western-Blot analizine göre, moleküler kütleleri sırasıyla ~29 ve 26 kDa olarak bulunmuştur. Hem gCM hem de dCM'nin stabilite analizi, +4 °C, +25 °C ve +37 °C'de uzun süre (sırasıyla 4 ay, 12 gün ve 6 gün) incelenmiş ve dCM, glikozile edilmiş muadilleriyle karşılaştırmada tüm sıcaklıklarda üstün stabilite göstermiştir. Bitkide üretilen CM proteinlerinin antimikrobiyal aktivite testleri, seçilen E. coli DH5α ve ATCC 25322, Salmonella ATCC 17028 ve Staphylococcus aureus (S. aureus) ATCC25923 suşları üzerinde gerçekleştirilmiştir. Tüm aktivite testlerinde dCM proteini, glikozile edilmiş muadilinden daha aktif sonuçlar vermiştir. Sırasıyla aralarında, 3,8, 1,7, 4,4 ve 2,4 katlık bir oran çıkmıştır. Ek olarak, dCM'nin ekspresyon seviyesi ve saflaştırma verimi, glikozile edilmiş muadili ile karşılaştırıldığında 2 kat daha yüksek çıkmıştır. Sonuç olarak, sonuçlarımız, deglikozile edilmiş Endo H teknolojisinin, glikozile edilmemiş diğer kolisinleri, doğal benzeri formlarında üretmek için kullanılabileceğini göstermektedir; bu, bu kolisinlerin bir gıda katkı maddesi olarak ticarileşme potansiyelini artırmak için önemli olacaktır
Nicotiana benthamiana bitkisinde ın vivo endo H ile deglikozile edilmiş PA83'ün diğer PA83 formları ile karşılıklı stabilite çalışmaları
Şarbon hastalığının etken organizması olan Bacillus anthracis, genellikle otçul hayvanların yaygın şekilde aşılanamadığı ülkelerde ortaya çıkmaktadır. Bu bakteri insanlara kutanöz, gastrointestinal veya sporlarının solunması ile ortaya çıkan inhalasyon formu ile bulaşabilmektedir. Bakterinin spor formu, sahip olduğu yüksek ölüm oranları ve uzun zamandır potansiyel bir biyolojik savaş ajanı olarak kabul edilmesiyle bilim adamlarını hızlı ve etkili bir şekilde koruyucu bağışıklık sağlayan, gelişmiş bir güvenlik profiline sahip, rekombinant aşılar geliştirmeye yöneltmiştir. Rekombinant protein ekspresyon sistemleri arasında yer alan bitkiler, diğer ekspresyon sistemlerine kıyasla düşük maliyetleri ve uygun güvenlik profilleri ile umut verici bir platformunu temsil etmektedir. Ancak B. anthracis PA'sı, ökaryotik sistemlerde ekspresyon sırasında anormal şekilde glikozile olabilen potansiyel N-bağlı glikozilasyon bölgeleri içermektedir. Daha önceki çalışmalar, glikozile edilmemiş bir pp-PA83 formunu, peptit-N-glikosidaz F (PNGase F) enzimi ile birlikte ekspresyonuna dayanan bir In vivo deglikozilasyon yaklaşımını Nicotiana benthamiana'da tasarlayarak üretmişlerdir (Mamedov vd. 2016). Laboratuvarımızda gerçekleştirilen çalışmaların sonraki aşamalarında başka bir deglikozile edici enzim olan Endo-β-N-asetilglukosaminidaz H (Endo H)'in, PNGase F enziminin katalizi sırasında meydana gelen deaminasyona sebebiyet vermeden proteini katalizlediği bulunmuştur (Mamedov vd. 2017). Bu tez çalışmasında Endo H tarafından bu şekilde In vivo olarak üretilen deglikozile PA83 proteini, PNGase F ile deglikozile edilen muadili ve proteinin glikozile formu saflaştırma deneylerinden sonra farklı zaman periyotlarında ve sıcaklıklarda uzun stabilite testlerine tabii tutulmuştur. Endo H ile deglikozile edilen PA83, uzun zaman dilimlerinde dahi diğer PA83 formlarından daha iyi bir stabilite gösterdiği kanıtlanmıştır. Elde edilen bu sonuçlar, bitki üretimli deglikozile PA83'ün şarbona karşı güvenli, etkili ve düşük maliyetli bir rekombinant alt ünite aşısı için iyi bir aday olabileceği göstermektedir.
N. benthamiana bitkisinin kurutulmuş yapraklarında Bacillus anthracis'in koruyucu antijeni'nin (PA83) deglikosile edilmiş ve mutant formunun stabilite ve fonksiyon aktivite değerlendirilmesi
Şarbon, hem insanları hem de hayvanları etkileyen Bacillus anthracis bakterisinin kaynaklanan akut bir hastalıktır. B. Anthracis sporlarının üretimi ve salımı nispeten kolaydır. Gram pozitif bir bakteri olan Bacillus anthracis'den kaynaklanan bir zoonotik bir hastalıktır. Rekombinant protein üretimi için birçok farklı sistem vardır. Bunlardan bazıları maya, bitki, böcek, bakteri ve memeli hücre kültürleridir. Bitki ekspresyon sistemi diğer ekspresyon sistemlerine göre birçok avantaja sahiptir. Ökaryotik translasyon sonrası modifikasyon mekanizmasına sahip oldukları için geçici gen ifadesi metodu kullanılır ve istenilen protein çok kısa bir sürede üretilebilmektedir. Bu yaklaşımdan yola çıkılarak PA koruyucu antijeninin deglikozile çalışması yapılmıştır. Bu çalışmada N. benthamiana da deglikozile dPA83-E ve pGR-MQ2 ile infiltre edilen kurutulmuş yapraklar kullanıldı. Ve elde edilen dPA83-E ve pGR-MQ2 deglikozile edilmiş mutantının özelliklerini, N. benthamiana bitkilerinde eksprese kurutulmuş dPA83-E ve pGR-MQ2 birçok yönde stabilizasyon ve karakterizasyon çalışmaların da kullanılma ihtimalleri üzerinde çalışılmıştır. Bu çalışmalar; in vivo deglikozile edilmiş PA83-E ve mutasyona uğramış versiyonlarının N. benthamiana bitkisinde yapılan çalışmada, kurutulmuş örneklerinin western blot ile ekspresyon kontrolü ve kurutulmuş yapraktan proteini çözündürme ve ezme yöntemiyle elde edilmesidir. Bu sonuçların SDS-PAGE ve WESTERN BLOT analizi yapılmıştır. Bu çalışmanın sonunda elde edilen bulgularla stabilizasyon değerlendirmesi, birçok yönde stabilizasyon ve karakterizasyon çalışmaların da kullanılma ihtimalleri üzerinde çalışılmıştır. Tüm sonuçlar incelendiğinde, kurutulmuş yapraklarda protein değerlerinin yaklaşık 1 yıldan fazla stabil kaldığı gösterilmiştir.
Farklı bitki ekspresyon vektörleri tarafından üretilen deglikosile edilmiş PA83 antijeninin ekspresyon seviyelerinin karşılaştırılması
Son yıllarda, rekombinant proteinler için üretim konakçıları olarak bitkiler seçilmektedir. Sebepler açıktır - bitkiler hayvan ve insan patojenleri içermez, N-bağlı glikosilasyon dahil olmak üzere ökaryotik tip posttranslasyonel modifikasyonlar sağlar ve protein üretimi için neredeyse sınırsız ölçeklenebilirlik sunar. Bu teknoloji, bitki bazlı üretimin ölçeklendirilebilirliği, saflaştırma maliyetleri, verim, istenen glikosilasyon modelinin mühendisliği ve diğer konular dahil olmak üzere, üretim konağı olarak bitkilerin ekonomik, teknik ve güvenlik yönlerini ele almaktadır. Bacillus anthracis'in ölümcül bir biyolojik silah olarak başarılı bir şekilde kullanılması şarbona karşı daha etkili aşıların geliştirilmesinde araştırma ilgisini yeniden başlatmıştır. Bitki bazlı aşılar aşı üretimi için güvenli bir alternatif sunar. B. anthracis'in koruyucu antijeni (PA) şarbon toksininin önemli bir bileşenidir, ancak bir glikoprotein değildir.Bununla birlikte, dizisinin dokuz potansiyel glikosilasyon sahası vardır ve Nicotiana benthamiana bitkilerinde eksprese edildiğinde anormal şekilde glikosile olduğu gösterilmiştir. Son zamanlarda PA83 antijeninin glikozillenmemiş versiyonları, ya in vivo deglikolizasyon stratejisi (PNGase F veya Endo H temelli), (Mamedov vd. 2012; Mamedov vd. 2016; Mamedov vd. 2017) ya da mutasyon (6 tane N-glikolizasyon bölgesine yönlendirilmiş mutagenez), (Mamedov vd. 2016) yaklaşımı vasıtasıyla üretilebilmiştir. Bu çalışmada, farklı bitki ekspresyon vektörleri tarafından üretilen deglikosile edilmiş PA83 antijeninin ekspresyon seviyeleri karşılaştırılarak yeni Şarbon aşısı adayları belirlenmiştir. Yedi N-glikosilasyon sahasının (Asn-39 dahil) koruyucu antijeninin mutasyonu ile tasarlanmış ve kodon optimizasyonu yapılmış olan mutant formu,( Mamedov vd. 2017) farklı bitki ekspresyon vektörleri tarafından eksprese edildi ve N. benthamiana bitkisinde üretildi.Üretilen PA83'ün deglikosile edilmiş antijenleri, IMAC afinite kolonu kromatografi yöntemi kullanılarak saflaştırıldı ve saflaştırılmış protein stabilite analizleri için değerlendirildi.
Endo H ile deglikozile edilmiş PA83 ve PA83 antijenlerinin farklı varyantlarının anti-PA83 monoklonal antikorları ile bağlanma afinite çalışmaları
Şarbon, Bacillus anthracis bakterisinin neden olduğu, hem insanları hem de hayvanları etkileyen ve tedavi edilmezse ölümle sonuçlanan bir hastalıktır. Şarbona karşı güvenli, düşük maliyetli, uzun süreli stabil ve yüksek oranda immünojenik bir aşı geliştirmek çok önemlidir. B. anthracis'in rekombinant koruyucu antijeni (PA), Şarbona karşı potansiyel bir aşı adayıdır. Rekombinant protein ekspresyon sistemleri arasında yer alan bitkiler, diğer ekspresyon sistemlerine kıyasla düşük maliyetli ve uygun güvenlik profillerine sahip büyük biyo-fabrikalar olarak kullanılabilir. Bitkiler ökaryotik bir translasyon sonrası modifikasyon mekanizmasına sahip olduklarından, rekombinant proteinler, geçici gen ekspresyon yöntemi kullanılarak üretilebilir. Bununla birlikte, koruyucu antijen, bakteriyel bir proteindir ve konağında bir glikoprotein değildir. Mamedov ve ark. 2017'de yapılan çalışmalarda, biyolojik olarak aktif deglikosile edilmiş PA, koruyucu antijen PA ve peptid-N-glikosidaz F (PNGase F) enziminin birlikte ekspresyonu ile üretildi. Bu çalışmada, Endo H ile deglikosile edilmiş koruyucu antijen PA'nın ve ayrıca diğer PA varyantlarının, laboratuvarımızda bitki tarafından üretilen anti-PA83 monoklonal antikoru ve ayrıca ticari olarak satın alınan anti-PA mAb ile bağlanma afinite çalışmalarını gerçekleştirdik. Bitki tarafından üretilen Endo H ile deglikosile edilmiş PA83, PA83'ün diğer varyantlarıyla karşılaştırıldığında güçlü afinite göstermiştir. Ek olarak, Nicotiana benthamiana'da Endo H ile deglikosile edilmiş PA83'e karşı üretilen anti-PA83 mAb, ticari anti-PA mAb'ye kıyasla daha yüksek afinite gösterdi.
Production and characterization of heptamerized form of PA83 of Bacillus anthracis in Nicotiana benthamiana plants as vaccine candidate against anthrax
Bacillus anthracis (B. anthracis) is the causative agent of anthrax, a gram-positive bacterium that is considered a weapon of biological terrorism in the world. It can be fatal for both animals and humans. Anthrax toxin comprises of three non-toxic proteins; Protective antigen (PA); Lethal factor (LF) and Edema factor (EF). PA is the central component of anthrax toxin and is responsible for the transition of EF and LF into the host cell. After proteolytic activation of PA83 (83 kDa), the PA20 (20 kDa) fragment is released; the remaining PA63 (63kDa) is rapidly self-assembled to form ring-shaped heptamers. The proteolytic cleavage is important for formation of heptamer structure, which allows binding with other two factors of LF /or EF. In the native host, B. anthracis PA83 protein is not a glycoprotein but has some potential glycosylation sites. These glycosylation sites can be abnormally glycosylated in eukaryotic expression systems as well as in plant expression systems. Abnormal glycosylation can mask important epitopes of proteins, leading to improper folding. Recently, Mamedov et al., showed the in vivo deglycosylation strategy in plant expression systems. Plant-based expression systems are an alternative platform for the production of recombinant proteins which enables an economical, scalable and safe product. In addition, plant-based expression systems have eukaryotic post-translational modifications (PTMs) that affect the biological properties of proteins. In studies, it has been shown that the in vivo glycosylated monomer form of PA83 produced in the plant is a highly active and stable protein for a vaccine candidate against anthrax. In this thesis study, we aim to demonstrate, the production of in vivo in heptamerized form of the PA83 protein using Nicotiana benthamiana (N. benthamiana) plant's transient expression system. Therefore, to produce the heptamerized form of PA63, the B. anthracis PA83 gene was first co-expressed with the deglycosylation enzymes Endo H and PNGase F and then in vivo cleaved with human furin. Our plan was in this thesis; i) to confirm the heptamer form of PA63 with gel filtration system, ii) to optimize high level heptamerized form production, to purify, characterize and iii) examine proteins for immunogenicity and animal testing. Thus, using all these deglycosylation and furin processing strategies, the in vivo-deglycosylated, heptamerized form of the PA83 protein could be a new potential immunogenic vaccine candidate for mass vaccination against anthrax. Also the heptamer form of deglycosylated PA83 can be more stable because of its heptameric structure. In addition, the study confirms the use of plant expression systems to get target proteins is a useful tool to produce safer and cheaper products in a short period, which is crucial for mass vaccination during the pandemic.
N. benthamiana'da P. falciparum Pfs48/45 R0.10C varyantlarının tasarlanması, üretimi ve karakterizasyonu
Günümüzde sıtmaya karşı birçok aşı geliştirilme aşamasında olmasına rağmen yeterli derecede koruma sağlayan etkili bir aşı henüz bulunmamaktadır. Doğal Pfs48/45 proteini Nbağlı glikan taşımamaktadır, fakat bitki ekspresyon sistemleri de dahil olmak üzere herhangi bir ökaryotik sistemde anlatımı yapıldığında anormal şekilde glikosilasyona uğrayan yedi potansiyel N-bağlı glikosilasyon bölgesi içermektedir. Anormal glikosilasyon problemini çözmek için geçici gen anlatımı yöntemi aracılığıyla N. benthamiana da ilgili hedef gen ile bakteriyel deglikosilasyon enzimleri olan PNGase F (Mamedov vd. 2012; Mamedov vd. 2013; Mamedov vd. 2016) veya Endo H enzimlerinin (Mamedov vd. 2017) birlikte ekspresyonu stratejisi geliştirildi. Bu çalışmada, geçici gen anlatımı yöntemi ile N. benthamiana bitkisinde Pfs48/45 proteininin 10C domaininin farklı versiyonları (glikosillenmiş ve deglikosillenmiş) başarılı bir şekilde üretildi. Üretilen 10C varyantları saflaştırıldı ve karakterize edildi. Pfs48/45-10C varyantlarının MRA-26 antikorları (iletim bloklama antikoru olarak bilinen bir konformasyonel spesifik antikor) kullanılarak gerçekleştirilen western blot analizleri, indirgenmemiş anormal şekilde glikosilasyona uğramış Pfs48/45-10C proteininin MR-26 antikoru tarafından çok az ya da hiç tanınmadığını; bitkide PNGase F veya Endo H in vivo olarak üretilen indirgenmemiş deglikosile Pfs48/4510C proteininin antikorlar tarafından güçlü bir şekilde tanındığını göstermiştir. Bu sonuçlar bitkide Endo H veya PNGase F aracılığıyla in vivo deglikosilasyona uğramış Pfs48/45-10C proteinlerinin doğru katlandığını ve Pfs48/45-10C proteinlerinin doğal Pfs48/45 proteini üzerinde bulunan epitopları içerdiğini desteklemektedir. Elde edilen sonuçlar, bitkide üretilmiş Endo H in vivo deglikosillenmiş Pfs48/45 ve Pfs48/45-10C antijenlerinin Pfs48/45 tabanlı iletim bloklama sıtma aşısının geliştirilmesi için potansiyele sahip olduğunu desteklemektedir.
Bitkiden üretimli deglikozile Pfs48 / 45 varyantlarının ifadesi, üretimi ve karakterizasyonu
Plasmodium falciparum is one of the deadliest parasite in human history and therefore, developing safe, low-cost and highly efficient malaria vaccine with long-term stability is urgently needed. Many recent studies have shown that the plant-based transient expression system is most promising technology that enables safe, rapid and inexpensive production of valuable, recombinant proteins with high expression capacity. Pfs48/45 is one of the leading candidates for transmission blocking (TB) vaccine development and plays a key role in parasite fertilization. Plant produced Pfs48/45 of P. falciparum could be a great potential as a TB vaccine candidate for a safe, effective, and low-cost vaccine against malaria. Pfs48/45 protein has seven potential glycosylation sites and is aberrantly glycosylated when expressed in Nicotiana benthamiana plants. Recently, to avoid the aberrant glycosylation, a strategy was developed to produce non-glycosylated proteins in plants by co-expression of target proteins of interest with bacterial enzymes PNGase F or Endo H (Mamedov et al. 2013, 2016, 2017). In this study, non-glycosylated variants of Pfs48/45 protein, was engineered, expressed and produced in N. benthamiana plant using PNGase F or Endo H in vivo deglycosylation strategy. Glycosylated and deglycosylated variants of Pfs48/45 were purified and purified protein were characterized using a conformational specific Pfs48/4 monoclonal antibody (MRA-26, IIC5-B10), a known TB antibody. We demonstrate that, in contrast to the glycosylated form, plant produced in vivo Endo H deglycosylated Pfs48/45 was recognized by conformational specific Pfs48/45 monoclonal antibody, in a manner like its PNGase F deglycosylated counterpart. This suggest that plant produced Pfs48/45 protein contain epitopes present on native Pfs48/45 and therefore, have a great potential for the development of a Pfs48/45-based TB malaria vaccine.
Chlamydomonas reinhardtii purivat ortofosfat(pi) Dikinase(PPDK) 1 geninin Escherichia coli'de klonlanması, karakterizasyonu ve heterolog ekspresyonu
Given that fossil fuel resources are limited, the researchers look for alternatives. Algae is the most promising alternative and offers distinct advantages over traditional oil crops. However, studies on lipid metabolism in eukaryotic, single-celled, photosynthetic microalgae are limited. Chlamydomonas reinhardtii is a well-studied representative of eukaryotic microalgae that has been used as a model organism for a number of physiological, biochemical and genetic studies for more than a decade. However, surprisingly enzymes of C4-metabolism and regulatory factors have not been studied in C. reinhardtii at the molecular level, except the recent effort, which was focused on the molecular characterization of phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) genes(Ppc 1 and Ppc2) in C. reinhardii (Mamedov et al., 2005; Moellering et al., 2007; Mamedov and Chollet, 2010). Thus, study of enzymes of C4-metabolism in the photosynthetic model organism C. reinhardtii would be very important for algal biomass accumulation, hence for biofuel. Pyruvate, phosphate dikinase (PPDK, EC 2.7.9.1) is important enzyme in the pathway of photosynthetic CO2 fixation in C4 plants and in some CAM plants, which catalyzes the ATP- and Pi-dependent formation of phosphoenolpyruvate (PEP), the primary CO2 acceptor molecule, from pyruvate. In this study, for the first time, we successfully isolated and cloned PPDK (CrPPDk) gene from cDNA of Chlamydomonas reinhardtii. Our results confirmed that CrPPDK gene transcribed in vivo and encodes a fully active, recombinant PEPC in E.coli. Gene expression analyses demonstrate that CrPPDK gene is CO2 or NH4 + responsive gene and its steady-state transcript levels are up-/down-regulated by varying levels of CO2 or NH4 + supplied to the growth medium.
N. benthamiana'da üretilmiş insan fix'nın hafif ve ağır zincirlerinin tasarlanması, üretimi ve karakterizasyonu
Hemofili B kandaki faktör IX proteini eksikliğine neden olan X kromozomu mutasyonunun neden olduğu kalıtsal bir hastalıktır. Faktör IX proteini aktive olmak için iki aşamalı proteolitik kesime maruz kalmaktadır. Arg145 bölgesinde ki kesilme ile iki zincirli inaktif FIXa oluşur. Bu işlemin ardından Arg180 bölgesinde hidroliz meydana gelir ve hafif zincir (LC) içeren N-terminal ile ağır zincir (HC) içeren C-terminal arasında disülfit bağları oluşarak aktif proteaz Faktör IXab meydana gelir. Aktif Faktör IX, dört yapısal domain içerir: N-terminustan başlayarak γ-karboksiglutamik asit (Gla) domaini, iki tane epidermal büyüme faktör-benzeri domain ve son olarak proteolitik domainidir. Halen, hemofili B'li hastalar ya insan kanından plazmada FIX elde edilerek ya da CHO (Çin hamsteri yumurtalık) hücrelerinde üretilen rekombinant FIX'le tedavi edilmektedir. Bununla birlikte, bu sistem son derece pahalı ve ölçeklendirilmesi zor bir sistemdir. Bitki ifade sistemi ise umut verici bir ifade yöntemi olmuştur ve diğer ifade sistemlerine kıyasla birtakım avantajlara sahiptir. Bu çalışmanın amacı, in vivo olarak bağlanması mümkün olmak üzere bitkide geçici gen ekspresyon sistemi kullanılarak faktör IX'un hafif ve ağır zincir domainlerinin üretimini denemektir. Bu çalışmada, HC ve LC genleri N. Benthamiana kodonları kullanılarak tasarlanmış ve kodon optimizasyonu yapılmıştır. Kodon optimizasyonu yapılmış HC ve LC genleri sentezlenmiş ve daha sonra bitki ekspresyon vektörüne klonlanmıştır. Klonlanmış plazmidler, elektroporasyon yoluyla Agrobacterium tumefaciens'in soyu olan AGL1'e aktarılmıştır. Nicotiana benthamiana bitkileri, HC ve LC genlerini barındıran agro ile infiltre edilmiştir. Ekspresyon ve optimizasyonun onaylanmasından sonra her iki gen, HC ve LC'nin muhtemel bağlanmaları için agro-infiltrasyon yoluyla bitki hücrelerine aktarılmıştır. LC ve HC genleriyle infiltre edilen bitki toplanıp, ekstre edilmiş ve saflaştırılmıştır. Son olarak FIX aktivitesi gerçekleştirilmiştir. Aktivitenin, insan Furine göre %10'dan daha yüksek olmadığı saptanmıştır.
Chlamydomonas reinhardtii fosfoenolpirüvat karboksikinaz 1 geninin A ve B kesim varyantlarının izolasyonu, karakterizasyonu ve Escherichia coli'de heterolog ekspresyonu
Yürütülen bu çalışmada, alglerde yağ oranı seviyesiyle ilişkili olduğu düşünülen Pck1 geninin Chlamydomonas reinhardtii'den klonlanması, ilk defa olarak tanımlanması, karakterizasyonu ve ekspresyon analizlerinin yapılması amaçlanmıştır. Elde edilen bulgular, bir sonraki çalışmalarda alglerde yağ oranının arttırılarak, alglerden endüstriyel olarak yüksek verimli yağ elde edilmesi amacıyla kullanılabilecektir. Yapılan analizlerde, Chlamydomonas reinhardtii 2137 (CC-4886) suşu kaynak olarak kullanılmıştır. Mikroalgler, sabit sıcaklık ve ışıklı ortam şartlarında TAP besiyerinde büyütülmüştür. Moleküler analizler, mikroalg kütlesinin sıvı azot yardımıyla ekstrakte edilmesiyle elde edilen nükleik asit ve proteinlerle yapılmıştır. Pck1 geninin, Pck1a ve Pck1b olmak üzere, iki farklı alternatif kesimi vardır, her iki kesim varyantı, PZR amplifikasyonları ile elde edilmiş ve E. coli'ye klonlanarak, enzim aktivasyon ölçümleriyle aktiviteleri belirlenmiştir. Ayrıca SDS-PAGE ve Western Blot yöntemleriyle de proteinlerin boyutları gösterilmiştir. Mikroalg hücreleri TAP besiyerinde farklı azot ve karbondioksit oranlarında büyütülmüş, besiyerinde azalan azot oranlarıyla beraber enzim aktivitesinin azalmasıyla, PCK1 enziminin susuturlması halinde algal yağ oranının artabileceği gösterilmiştir. Karbondioksit oranı arttıkça enzim aktivitesinin arttığının saptanmasıyla da PCK1 enziminin fotosentetik bir enzim olabileceği gösterilmiştir, bu şekilde model bir organizma olan Chlamydomonas reinhardtii'de fotosentez sisteminin anlaşılmasına katkı sağlanmıştır. Ayrıca Pck1'in fotosentez sistemiyle ilişkili olması, susturulmasının algal yağ oranının artımına sebep olacağının diğer bir işareti olarak ortaya koyulmuştur. PCK1 enziminin, mikroalglerde aktif bir enzim olduğunun gösterilmesi ve alglerde hücresel yağ oranıyla ilişkisinin ortaya çıkarılmasıyla, alglerde yağ oranının artırılmasına yönelik yapılacak çalışmalara önemli bir katkıda bulunulmuştur. Ayrıca bir model organizma olan Chlamydomonas reinhardtii'de fotosentez sistemiyle ilgili bu karakterizasyonun yapılması, bu çalışmayı referans alarak, diğer yakın türlerde ilgili enzim genlerinin karakterizasyonunun yapılması yönünde bir başlangıç olmuştur.
N. benthamiana bitkisinde aktif insan faktör IX rekombinant proteininin varyantlarının klonlanması, ekspresyonu, saflaştırılması ve karakterizasyonu
Yürütülen bu çalışmada, insan FIX geni kodon optimize edildi, klonlandı ve N.benthamiana bitkisinde yalnız veya modifiye edilmiş enzimler, VKD-GC ve Furin ile birlikte eksprese edildi. İlaveten, bitki glikolizasyonunun bitkide üretilmiş FIX'nın aktivitesi ve stabilitesi üzerindeki spesifik etkisini çalışmak için FIX, deglikolizasyon enzimleri olan PNGase F veya Endo H ile ko-eksprese edildi. Bitkide üretilmiş FIX varyantları IMAC kolon kullanılarak kısmen pürifiye edildi ve kıyaslamalı enzimatik aktiviteleri hesaplandı. Bitkide üretilmiş ve kısmen pürifiye edilmiş FIX varyantlarının aktivitesi kromogenik yöntemle belirlendi. Sonuçlar, bitkide üretilen FIX'nın insan FIX'a kıyasla %10 göreceli aktiviteye sahip olduğunu gösterdi. Buna rağmen, yalnız üretilen ve Furin veya VKD-GC ile ko-eksprese edilen FIX proteinlerinin aktiviteleri arasında küçük farklılık ya da herhangi bir farklılık gözlemleyemedik. Furin veya Furin ve VKD-GC ile birlikte ko-eksprese edilen FIX proteininin insan FIX proteinine kıyasla yaklaşık olarak %12'lik göreceli aktiviteye sahip olduğunu gözlemledik. İlaveten, biz bitkide üretilen FIX'nın farklı varyantlarının aktivite ve stabilite analizini yaptık. FIX'nın Endo H ve PNGase F deglikolize varyantlarının insan FIX'a kıyasla göreceli aktiviteleri sırasıyla 13.6 ve 12.5'dir. FIX'nın bitkide üretilmiş glikozillenmiş ve in vivo deglikozillenmiş formlarının stabilitesi 37°C'de 24 saatlik inkübasyondan sonra belirlendi. Glikozillenmiş FIX'nın (%50'nin kalma süresi), PNGase F in vivo deglikozillenmiş ve Endo H in vivo deglikozillenmiş formlarının in vitro yarı ömrü Western blot analiziyle protein bantları analiz edilerek, sırasıyla 25.80, 37.99 ve 80.57 saat olarak hesaplandı. Bu sonuçlar FIX'nın bitkide üretilmiş Endo H in vivo deglikolize formunun glikolize FIX ve PNGase F in vivo deglikolize formuna kıyasla yüksek sıcaklıkta daha stabil olduğunu gösterdi. ANAHTAR KELİMELER: Geçici gen anlatımı, Hemofilia B hastalığı, in vivo deglikolizasyon, Karboksilasyon, Proteolitik kesilme.
Şarbon aşı adayı olarak PA83'ün yeni mutant formunun N. benthamiana bitkisinde tasarlanması, ekspsresyonu, saflaştırılması ve karakterizasyonu
Bacillus anthracis potansiyel biyolojik savaş ajanı olarak bilindiğinden beri, güvenli, düşük maliyetli, etkinliği yüksek ve uzun süreli stabiliteye sahip şarbon aşısını geliştirebilmek oldukça yüksek önem taşımaktadır. Son yıllardaki çalışmalar yüksek ekspresyon kapasitesi ve değerli rekombinant proteinlerin güvenli, hızlı ve ucuz üretimine olanak sağlaması nedeniyle bitki temelli transient ekspresyon sisteminin umut vaad edici teknoloji olduğunu göstermektedir. B. Anthracis'in bitkide üretilen koruyucu antijeni (PA) şarbona karşı güvenli, etkili ve düşük maliyetli aşı geliştirmede büyük potansiyele sahiptir. B. Anthracis'in koruyucu antijeni glikoprotein değildir. Buna rağmen, dizisi 9 tane olası potansiyel glikolizasyon bölgesine sahiptir ve Nicotiana benthamiana bitkilerinde eksprese edildikleri zaman aşırı derecede glikozillenme gösteriyorlar. Son zamanlarda PA83 antijeninin glikozillenmemiş versiyonları, ya in vivo deglikolizasyon stratejisi (PNGase F veya Endo H temelli), (Mamedov vd. 2012; Mamedov vd. 2016; Mamedov vd. 2017) ya da mutasyon (6 tane N-glikolizasyon bölgesine yönlendirilmiş mutagenez), (Mamedov vd. 2016) yaklaşımı vasıtasıyla üretilebilmiştir. PA83'ün bu mutant formunu analiz ettiğimizde, bir önceki çalışmada mutasyon yapılmamış bölge olan fakat glikozillenme düzeyine sahip olan bir bölge olan Asn-39'u bulduk. Bu çalışmada, koruyucu antijeninin Asn-39 dahil 7 tane N-glikolizasyon bölgesinin mutasyonu ile oluşturulmuş yeni mutant formu tasarlandı, kodon optimize edildi, eksprese edildi ve N.benthamiana bitkisinde üretildi. Kıyaslama yapabilmek amacıyla PA83'ün 6 olası N-glikolizasyon bölgesinde nokta mutasyonu taşıyan versiyonu N.benthamiana bitkisinde üretildi. PA83'ün her iki mutant formu IMAC afinite kolon kromatografisi yöntemi kullanılarak saflaştırıldı ve saflaştırılmış protein stabilite analizi için değerlendirildi. ANAHTAR KELİMELER: Geçici gen anlatımı, in vivo deglikolizasyon, Koruyucu Antijen, Şarbon aşı adayı.