58
Archived Theses
0
DOIs Assigned
0%
DOI Rate
Discipline
KDELR1 ve COPE genlerinin multipl miyelom patogenezindeki rolü
Multipl miyelom, terminal olarak farklılaşmış plazma hücrelerinin malignitesidir. Hematolojik maligniteler arasında ikinci sırada yer almaktadır. Kemik iliğinde kontrolsüz monoklonal plazma hücrelerinin çoğalması, hücrelerde fonksiyonel olmayan immünoglobulinlerin veya immünoglobulin zincirlerinin aşırı üretilerek birikmesi ile karakterizedir. Önceki çalışmalarımızda KDELR1 ve COPE genlerinin anlatımının hastalarda arttığını gösterdik. Bu genler endoplazmik retikulm ve golgi arasında proteinlerin taşınmasında rol alan genlerdir. KDELR1 bir reseptördür ve ilgili diziye sahip proteinlerin bağlanmasını sağlar. Proteinlerin COPI aracılı retrograd taşınması için COPI veziküllerine paketlenmesinde rol oynar. COPE geni COPI yapısına katılan epsilon alt birimidir. Çalışmamızda, KDELR1'in multipl miyelomdaki etkisini anlamak için U266 ve RPMI8226 hücrelerindeki gen ifadesi siRNA aracılığı baskılandı. Kontrol grubu ve KDELR1 siRNA uygulanan gruplarda apoptoz tayini için konfokal lazer taramalı mikroskopta floresan boya ile boyanan hücreler görüntülendi. Hücre proliferasyonuna olan etkiyi belirlemek için MTT testi yapıldı. KDELR1 geninin baskılanmasının COPE geni üzerindeki etkisi qRT-PZR yöntemi ile belirlendi. Tüm deney grubu çalışmaları 24 ve 48 saat zaman diliminde gerçekleştirildi. KDELR1 geni baskılanmış U266 hücrelerinde 24 saat diliminde COPE gen anlatımının kontrol grubuna göre arttığı bulunurken RPMI8226 hücrelerinde değişim bulunmadı. Apoptotik hücre oranının her iki hücrede de kontrol grubuna kıyasla siRNA grubunda arttığı bulundu. Hücre canlılığı da özellikle 24 saat diliminde her iki hücre hattında azaldığı belirlendi. KDELR1 geninin baskılanmasının hücre canlılığını azalttığı ve apoptozu tetiklediği gösterildi. Bu çalışma U266 ve RPMI8266 hücrelerinde KDELR1 geni ile yapılan ilk fonksiyonel çalışma özelliğine sahiptir.
Bifenotipik akut lösemi hastalarının genetik karakterizasyonu
Akut lösemi gelişiminde merkezi bir rol oynayan yapısal kromozomal değişiklikler, DNA kopya sayısı değişiklikleri ve mutasyonlar ile ilişkili olarak tanımlanan birçok alt tip bulunmaktadır. Günümüzde, genomik araştırmaların ilerlemesiyle lösemilerde yeni genetik alt gruplar belirlenmiştir. Bifenotipik akut lösemiler (MPAL), blastların hem lenfoid hem de miyeloid soy spesifik belirteçlerini birlikte ifade ettiği nadir bir lösemi türüdür. Bifenotipik akut lösemi hastalarının risk sınıflandırması, ALL ya da AML hastaları gibi, klinik ya da immünfenotipik özelliklere göre yapılmaktadır ancak hastalar hem genetik ve fenotipik olarak oldukça heterojendirler. Hastaların moleküler sınıflandırması yetersizdir ve kötü prognoz göstermektedirler. MPAL'leri sınıflandırmadaki zorluklar, terapötik sonuçlarla ilgili ileriye dönük olarak toplanan verilerin eksikliği ve nadir insidans oranı, hastalar için en iyi tedavi yaklaşımı konusunda belirsizliğe yol açmaktadır. Ayrıca son yıllarda olarak MPAL hastalarında hematopoetik hücrelerde soy değişiminden sorumlu transkripsiyon faktörlerinin anlatımlarında bozulmalar bildirilmektedir. Bu tez projesi kapsamında, MPAL hastaları özel bir genomik altyapıya sahiptir hipotezinden yola çıkarak, 46 çocukluk çağı MPAL olgusunun kemik iliği örneklerinde PZR, qPZR, Sanger dizileme yaklaşımları ve enformatik analizler kullanarak aday gen varyasyonları araştırılmıştır. Saptanan varyasyonların hastaların klinik parametreleri ile ilişkisi araştırılmıştır. Çocukluk çağı MPAL hastaların %39'unda (18/46) IKZF1, DUX4r, ZNF384r, t(9;22) ve t(12;21) genlerinden en az birinde varyasyon saptanmıştır. IKZF1 ve t(9;22) varyasyonların sağkalım üzerine kötü etkisi belirlenirken, DUX4r, ZNF384r varyasyonları orta risk/standart risk belirteçleri olarak saptanmıştır. Soy değişimi sürecinde kritik öneme sahip olan genlerin anlatımları incelendiğinde, MPAL alt fenotiplerine spesifik bir anlatım görülmemekle beraber MPAL hastalarının sahip oldukları varyasyonların doğrudan ya da dolaylı mekanizmalar ile gen anlatımlarını etkilediği ve değiştirdiği gösterilmiştir. MPAL hastalarında gerçekleştirilmiş çalışma sayısı yok denecek kadar azdır. Bu tez projesinde elde edilen verilerin büyük kısmı ilk defa ortaya çıkartılmış özgün verilerdir ve gen varyasyonlarının sıklığı ve birlikte görülmeleri bakımlarından BCP-ALL den farklılıklar görülmüştür. Bu çalışma, İstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir. Proje No:36661
Primer immün yetersizlik hastalarında belirlenen yeni varyantların validasyonu
Primer immün yetersizlikler (PİY), immün sistemin gelişimini, fonksiyonunu veya her ikisini de etkileyen 130'dan fazla farklı bozukluğu içeren hastalıklar grubudur. PİY fenotipleri her biri nadir hastalık grubuna girerler ve yaklaşık 1:10000 canlı doğum prevalansına sahiptirler. Ancak Türkiye gibi akraba evliliğinin yüksek olduğu veya genetik olarak izole popülasyonlarda daha yüksek bir oran gözlenmektedir. Klasik olarak, PİY'ler Mendel kalıtım ilkelerini izleyen hastalıklardır. Hastalığın geniş fenotipik değişkenliğinin olması nedeniyle PİY tanısının konulması gecikmektedir. Bu sebeple Primer immün yetersizlik sendromlarının temelinde yatan moleküler bozuklukların belirlenmesinde, immünolojik ve genetik testler büyük önem taşımaktadır. Grubumuzun önceki çalışmalarında PİY hastalarında yeni nesil dizileme temelli gen panelleri ve ekzom analizleriyle bilinen ve bilinmeyen gen varyasyonları saptanmıştır. Bu tez çalışması kapsamında, saptanan varyasyonlar indeks olguda Sanger dizilime ile doğrulanması yapılmış ve ailevi segregasyonu gösterilmiştir ve doğrulanmış varyasyonlarda in-silico tahmin araçları kullanılarak olası hasarların öngörülmesi ve saptanan varyasyonun özelliğine göre gen anlatımı (kantitatif PCR) ve protein anlatımının (Western blot, ELISA) araştırılması yapılmıştır. Çalışma sonucunda, çalışılan altı varyasyon/gen'in iki tanesi Sanger dizileme ile doğrulanamamıştır. RAG2 geninde tespit edilen varyantın ekspresyon analizlerine dayalı çalışması sonucu sağlıklı bireylere göre azalmış ekspresyonu bulunmuştur. Bu varyanta ek olarak hastadaki lenfoma bulgularını açıklayan başka bir gende tespit edilmiştir. Çalışma ileri fonksiyonel analizler ile devam ettirilecektir. PİY fenotipi için yeni bir aday gen olan TM4SF4'ün hastalıkla genotip- fenotip ilişkisinin kurulması için çalışılmıştır. Çalışmada tanısı net olarak konulamayan bir hasta da tespit edilen MASP2 genindeki varyantın hastalıkla ilişkisi belirlenmeye çalışılmıştır. Hastaya özgü genetik değişikliklerin bilinmesi klinisyen için hastalığın prognozu ve tedavi yaklaşımı bakımından yol gösterici olacaktır. Anahtar Kelimeler: Primer immün yetersizlik, varyasyon, kantitatif PCR, akım sitometrisi, Sanger dizileme.
Kronik miyeloid lösemi hastalarında farklı T(9;22) kırıklarının tespiti ve tedavi yanıtı ile ilişkisinin araştırılması
Kronik miyeloid lösemi (KML), miyeloid hücrelerin anormal olarak çoğalmasıyla oluşan bir kök hücre hastalığıdır. Kronik miyeloid lösemide 9. ve 22. kromozomlar arasında görülen ve 22. kromozomun q11 bandı (BCR geni) ile 9. kromozomun q34 bandının (ABL1 geni) katıldığı translokasyon sonucu Philadelphia kromozomu (Ph) oluşur. Ph pozitif hücre, klonunun çoğalmasına ve lökositoza neden olur. KML'de kromozomların farklı noktalarında kırıklar oluşabilmektedir ve bu değişik kırıkların füzyonları sonucunda farklı onkogenik ürünler ortaya çıkmaktadır. Farklı BCR::ABL1 füzyonları sonucunda oluşan farklı RNA transkriptlerinin translasyonu, hastalığın biyolojik özelliklerini ve tedavi yanıtını etkileyebilecek farklı protein tirozin kinazların (PTKs) üretimi ile sonuçlanır. Bu çalışma ile farklı BCR::ABL1 transkriptlerinin tanı, tedavi, hastalığın seyri ve nüks durumları üzerindeki etkisinin belirlenmesi hedeflenmiştir. Çalışmaya KML tanısı almış n=125 hastaya ait örneklem zamanları bulunan toplam 182 örnek dahil edilmiştir. Bu örneklerin 111 tanesi tanı sonrası Ph (+) olan takip, 72 tanesi ise direnç anı kan örnekleridir. Tüm örnekler p210 (e14a2, e13a2, e14a3, e13a3), p190 (e1a2, e1a3), p230 (e19a2, e19a3) füzyonları açısından ters transkriptaz PZR yöntemiyle taranmıştır. İlk geliş örneklerinde e14a2 %48,6, e13a2 %35,1, e14a2/e13a2 birlikteliği %15,3, e13a2/atipik birlikteliği %0,9 olarak saptanmıştır. Direnç anı örneklerinde e14a2 %59,2, e13a2 %22,5, e14a2/e13a2 %8,4, e14a2/e1a2 %1,4 e13a2/e1a2 %1,4, e14a2/e19a2 %4,2, e14a2/e13a2/e1a2/e19a2 %1,4 ve e13a2/e18a2 %1,4 olarak belirlenmiştir. İlk geliş örnekleri, direnç anı örnekleri ile karşılaştırıldığında; direnç anı örneklerinde e13a2 ve e14a2/e13a2 sıklığının azaldığı, e14a2 füzyonunun sıklığının arttığı ve atipik nadir transkriptlerin varlığı görülmektedir. Buna göre, e14a2 füzyonunun ve atipik nadir transkriptlerin KML'de direnç ve düşük tedavi yanıtı ile ilgili olduğu düşünülmektedir.
MİR-7-5P ile akut myeloid lösemi (AML) ilişkisinin incelenmesi
Akut Myeloid Lösemi (AML) blast hücrelerinin farklılaşarak aşırı çoğalması ile karakterizedir. Kanser patogenezinde önemli rolü bilinen miRNA'lar, 18-22 nükleotid uzunluğunda kısa kodlanmayan RNA'lardır. Bu tez çalışmasında, çeşitli kanserlerde tümör supresör olarak görev aldığı bilinen miR-7-5p'nin AML'deki rolü ve olası hedef genleriyle ilişkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaçla HL60 ve NB4 AML hücrelerine miR-7-5p mimiği Lipofektamin aracılı yöntemle transfekte edilmiştir. Transfeksiyon validasyonu için TaqMan primer-problar kullanılarak qRT-PZR gerçekleştirilmiştir. miR-7-5p'nin proliferasyona etkisi WST-8 yöntemi ile, apoptoza etkisi ise Kaspaz 3 miktar tayini ile incelenmiştir. miRDB, miRTarBase, Targetscan ve miRWalk veritabanları kullanılarak miR-7-5p'nin olası hedef genleri olarak belirlenen BCL2, SKP2, OGT, KLF4, EGFR genlerinin ve EMT belirteci olarak bilinen VIM geninin rölatif gen ekspresyonları karşılaştırmalı olarak qRT-PZR tekniğiyle değerlendirilmiştir. Transfeksiyonun başarılı bir şekilde gerçekleştiği anlaşılan hücrelerde miR-7-5p transfekte edilen grupta kontrol grubuna kıyasla hücre proliferasyonunun anlamlı düzeyde azaldığı apoptoza eğilimin ise arttığı tespit edilmiştir. miR-7-5p transfekte edilen grupta kontrol grubuna kıyasla SKP2, KLF4 ve OGT genlerinin ekspresyon seviyelerinin istatistiksel olarak anlamlı düzeyde azaldığı; BCL2, EGFR ve VIM genlerinin ekspresyon seviyelerinin ise istatistiksel olarak anlamlı seviyede değişmediği tespit edilmiştir. Sonuç olarak; miR-7-5p'nin AML'de proliferasyonun azalması ve apoptozun artmasıyla ilişkisi olabileceği tespit edilmiştir. Ayrıca miR-7-5p'nin AML'de kanser sürecine SKP2, KLF4 ve OGT genlerini hedefleyerek etki edebileceği düşünülmüştür. AML için erken tanı ve tedavide yeni bir belirteç olabilme potansiyeline sahip miR-7-5p'nin hedef genlerinin tespit edilmesi ve doğrulanması oldukça önem taşımaktadır. Bu yüzden mRNA düzeyinde elde edilen verilerimizin ileri çalışmalarla doğrulanması gerekmektedir.
Mitokondri metabolizmasında rol alan AMPK yolağı ile ilişkili mikroRNA ve aday genlerin anlatım düzeylerinin koroner arter hastalarında incelenmesi
Koroner arter hastalığı (KAH), yüksek mortalite prevalansı ile küresel sağlık sorunlarından biridir. KAH'ın önlenebilmesi için, KAH'ın temel nedeni ateroskleroz oluşumunda etkisi olan moleküler mekanizmaların aydınlatılması önemlidir. Bu bağlamda, ateroskleroz oluşumunda oksidatif stres nedeniyle değişen mitokondri biyoregülasyonunda etkili genlerin ve mikroRNA'ların (miRNA) anlatım düzeylerinin araştırılması amaçlanmıştır. Bu tez çalışmasında, PRKAA2, PPARGC1A, SIRT1, RELA ve TNFA gen anlatımları epikardiyal yağ dokusunda (EYD) ve miR-155-5p, miR-30a-5p, miR-1247-5p, miR-326 anlatım düzeyleri EYD ve viseral yağ dokularında (VYD) incelenmiştir. 63 KAH'lı ve 30 KAH olmayan bireye ait EYD örneklerinde ve 65 kişinin (46 KAH ve 19 KAH olmayan) VYD örneklerinde kantitatif gerçek zamanlı PZR ile gen ve miRNA'ların anlatım düzeyleri değerlendirilmiştir. KAH'lı bireylerin EYD örneklerinde TNFA anlatım düzeyleri kontrol grubuna göre yüksek bulunmuştur (p=0,006). KAH gruplarına ek olarak diyabet ve obezite durumlarına göre alt gruplar (Diyabet, KAH-Diyabet, Obezite, KAH-Obezite) oluşturulmuştur. Tüm grupların hasta bireylerinde PRKAA2, PPARGC1A, SIRT1 ve TNFA genlerinin EYD örneklerinde gruplar arası değişen anlatım düzeyleri belirlenmiştir (p < 0,050). MiR-1247-5p anlatım düzeyinin obez ve obez KAH'lı bireylerde ilgili kontrollere göre azaldığı belirlenmiştir (Obez, p=0,040; KAH-Obez, p=0,021). Seçilen miRNA'ların incelenen alt gruplarda biyokimyasal parametreler ile korelasyonları gözlenmiştir (p < 0,050). Bu tez çalışması, seçilen gen ve miRNA'ların KAH, obezite ve diyabet patogenezi için viseral ve epikardiyal yağ dokusunda birlikte incelendiği ilk çalışma olması yönünden önem arz etmektedir. Çalışmada elde edilen sonuçlar, incelenen gen ve miRNA'ların KAH patogenezinin önlenmesi ve tedavisinde potansiyel bir hedef olabileceğini göstermektedir. Ateroskleroz patogenezinde oksidatif stresin araştırılmasını hedefleyen bu çalışma ile oksidatif streste rolü olabilecek yeni hedefler belirlenmiştir.
Adenosin deaminaz 2 eksikliği hastalığında ADA2 mutant allelin ekspresyon düzeylerinin hastalığın şiddeti üzerindeki etkisinin araştırılması
DADA2, ADA2 geninde fonksiyon kaybına neden olan mutasyonlardan kaynaklanan otozomal resesif bir hastalıktır. DADA2'de aynı kurucu mutasyon için hastalığın başlangıç yaşı, sıklığı ve semptomların şiddeti değişkenlik göstermektedir. Daha önce yaptığımız bir çalışmada ADA2 geninde ekzon 7'nin atlanmasına neden olan splice site mutasyonunu (c.973-2A>G) homozigot olarak taşıyan bireylerde kısa ADA2 ifade seviyelerinde farklılık saptandı. Bu tez çalışmasında hastaların farklı hücre tiplerinde mutant allelin ifade seviyeleri ve hastalığın şiddetinin değişkenliğinin nedenini araştırmak amaçlandı. Hastalardan elde edilen hücrelere Lipopolisakkarit (LPS) uygulanarak inflamasyon tetiklendi. qRT-PZR yöntemi ile mutant ve normal mRNA ifade seviyeleri analiz edildi ve ADA2 enzim aktivitesi ölçüldü. Hastaların plazmasında ADA2 enzim aktivitesinin azaldığı bulundu. Hücre kültüründe ise ADA2 enzim aktivitesi saptanamadı. Hücrelere LPS uygulanmasının ADA2 ifadesinde belirgin bir farka neden olmadığı tespit edildi. Hastalara ait lenfosit ve nötrofil hücrelerinde ekzon 7 atlanan mutant ADA2, monosit hücrelerinde ise yabanıl tip ADA2 espresyonu görüldü. Heterozigot sağlıklı bireyin PBMC ve nötrofil hücrelerinde yabanıl tip ADA2 ekspresyonu gözlemlendi. Bu sonuçlar, hastalığın şiddeti ve klinik fenotipin mutant ADA2'nin eksprese olduğu hücre tipine bağlı olarak değişkenlik gösterebileceğini düşündürmektedir. Bu çalışma farklı hücrelerin kullanılarak ADA2 gen ifadesi ve ADA2 enzim aktivitesinin araştırıldığı ilk çalışma olma özelliğine sahiptir. Anahtar Kelimeler: DADA2, CECR1, ADA2, LPS, mRNA
İnsan bağırsak mikrobiyotasının farklı DNA izolasyon yöntemleri kullanılarak incelenmesi
İnsan mikrobiyotası en yoğun olarak bağırsakta bulunur. İnsan bağırsak mikrobiyatasının (İBM) homeostatik yapısının insan sağlığını olumsuz etkileyebilecek yönde değişimi bağırsak disbiyozisi olarak adlandırılır. Çalışmalarda son yıllarda yeni nesil dizileme (YND) yöntemleri, özellikle 16S rRNA amplikon dizileme hassas, düşük maliyetli ve yüksek çıktılı veri sunmasıyla oldukça yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır. Bu tez çalışmasında gönüllülerden (n=3) alınan dışkı örneklerinden üç farklı (Fenol-Kloroform, QIAamp Powerfecal DNA Kit, ZymoBIOMICS Miniprep Kit) yöntem ile bakteriyel genomik DNA izolasyonları gerçekleştirilip ürünlerinin 16S rRNA geni V3-V4 bölgeleri PZR işlemi ile çoğaltılarak Illumina Miseq cihazında dizilendi. 16S amplikon dizileme sonucunda ortalama 83.633 okuma başarısı sağlandı. Ancak taksonomik olarak sınıflandırılabilen ortalama okuma sayısı ise 40.603 olarak belirlendi ve bu okuma derinliğinde elde edilen en anlamlı veri filum düzeyinde gerçekleştirildi. En kapsamlı veri filtreli ticari kitlerle Qiagen (7 filum) ve Zymo (6 filum) elde edilen örnekler ile sağlanmıştır. Fenol klorofom (5 filum) ile elde edilen DNA miktarları çok olmasına rağmen bakteri temsiliyeti bakımından filtreli kitlere göre daha başarısız olduğu görüldü. Örnekler arası karşılaştırmalarda Bacteroidetes filumunun tespitinin filtreli (Qiagen) izolasyonlarda daha etkin olduğu görülmüştür. Bu çalışmanın sonuçlarına göre bakteriyel genomik DNA izolasyon yönteminin bakterilerin tümünün DNA izolasyonunu gerçekleştirmedeki başarısı, biyolojik parametrelerden bağımsız olarak doğrudan mikrobiyal kompozisyonu etkilemektedir.
Metabolik sendromlu sıçanlarda vitamin D'nin aterogenezle ilişkili aday genlerin ifade düzeyine etkisi
Hipertansiyon, santral obezite, dislipidemi, hiperglisemi gibi metabolik durumların birlikte bulunduğu Metabolik Sendromda(MetS), yüksek yağlı ve fruktozlu beslenmenin neden olduğu aterosklerozda, moleküler patogenez halen net değildir. Bu çalışmada, MetS sıçan modelinde, ateroskleroz gelişim sürecinde Vitamin D'nin (VitD) aort doku morfolojisi ve endotel hasarı üzerine etkisinin belirlenmesi amaçlandı. Yüksek yağlı-fruktozlu(%17 yağ ve %17 fruktoz içeren yem + %20 fruktozlu su) diyetle MetS oluşturulan ve normal(standart) yemle beslenen 10-12 haftalık Sprague Dawley erkek sıçanların (n=32) aort dokularına VitD'nin etkisi, miR-21-5p ve miR-146a-5p ifade düzeylerindeki değişimler kantitatif RT-PZR ile, doku morfolojisindeki histolojik değişimler Hematoksilen-Eosin, Masson üçlü boyası ve Von Kossa boyamaları ile, miR-21-5p'nin hedef gen ürünü TIMP3 ile ayrıca α-SMA, p16, AMPK aort dokularında immunohistokimyasal olarak araştırıldı. Kontrol ve MetS gruplarının yarısına, 12 hafta boyunca VitD(170 IU/ hafta, oral) uygulaması yapıldı. Tüm sıçanların deri kalınlığı, bel çevresi, ağırlık ve kan glukozu takipleri yapıldı. Sonuçlar istatistiksel olarak değerlendirildi. Deney sonunda, gruplar arasında VitD'nin kan glukozu ve bel çevresi değerlerine başlangıca göre anlamlı bir etki gösterdiği belirlendi(p≤0.05). Gruplar arasında miR-146a-5p'in ifade düzeylerinin VitD ile arttığı belirlendi(p≤0.05). Histopatolojik incelemede, MetS grubunda düz kas hücrelerinin bazı alanlarda vakuolize olduğu ve sağlıklı görünümünden uzaklaştığı ve damar yapısının bozulduğu saptanarak VitD ile bu hasarın büyük ölçüde düzeldiği gözlendi. MetS grubunda diğer gruplar ile kıyaslandığında p16, α-SMA ve AMPK immün pozitif hücrelerin sayısında artma, miR-146a-5p'in ifade düzeylerinde istatistiksel olarak bir fark gözlenmese de TIMP3 immün pozitif hücrelerin sayısında azalma olduğu görüldü. Sonuç olarak yüksek yağlı-fruktozlu diyet ile oluşturulan metabolik sendromun damar yapısını bozduğu vitamin D'nin oluşan hasarı büyük ölçüde düzelttiği saptandı.
Endometrioziste uzun kodlamayan RNA'ların inflamasyonla ilişkilendirilmesi
Endometriozis, uterus kavitesi dışında endometrium dokusu ve stromanın varlığı ve çoğalması ile karakterize edilen, üreme çağındaki kadınlarda sıklıkla görülen jinekolojik bir hastalıktır. Uzunluğu 200 nükleotitten daha büyük olan az karakterize edilmiş bir molekül sınıfı olan uzun kodlamayan RNA'lar (lncRNA) çeşitli biyolojik işlemlerde önemli roller oynamaktadır. Bu çalışmada, endometriozis hastalarının lökositleri ve dokularında uzun kodlamayan RNA'ların ifade düzeylerinin analizi ve hastalık ile ilişkilerinin belirlenmesi amaçlandı. Bu amaçla, endometriozis tedavisi amacı ile başvuran ve operasyon planlanan hastalardan (n:32) endometriozis dokusu (n:23) ve periferik kanları (n:28), kontrol grubu olarak sağlıklı kadınlardan periferik kan örnekleri (n=27) ve iki bireyden normal over dokusu temin edildi. Ayrıca hastalardan 1. aylık takip döneminde periferik kan örnekleri (n:20) alındı. Bu örneklerde aday lncRNA'ların ifade düzeyleri kantitatif RT-PZR ile belirlenerek, endometriozis ile ilişkisi istatistiksel olarak değerlendirildi. Bu çalışmada, endometriozis hasta grubunda kontrollere kıyasla BAT5 ifade düzeyinin lökositlerde 3 kat (p=0.103), dokularda ise 20,70 kat (p=0.329) arttığı, MALAT1 ifade düzeyinin ise lökositlerde 4,3 kat (p=0.005), dokularda 1,21 kat (p=0.443) arttığı ve ayrıca UBOX5 ifade düzeyinin lökositlerde 1,08 kat (p=0.029) azalırken, dokularda 5,35 kat (p=0.749) arttığı bulundu. Bunun yanında operasyon sonrası birinci aylık takip hastalarında operasyon öncesi durumlarına kıyasla, lökositlerde, BAT5 ifade düzeyinin 2,07 kat (p=0.414) ve MALAT1 ifade düzeyinin 2,64 kat (p=0.048) azaldığı, UBOX5 ifade düzeyinin ise 2,02 kat (p=0.594) arttığı bulundu. Yapılan ROC analizlerinde lökositlerde değişen ifade düzeyleri ile seçilen aday lncRNA'ların endometriozis tanısı için aday biyobelirteçler olabileceği belirlendi. Sonuç olarak bu çalışmada seçilen lncRNA'ların endometriozis patogenezinde inflamasyonla ilişkili olabileceği ve tanı için biyobelirteç olabilme potansiyeli olduğu gösterildi.
Ailevi akdeniz ateşinde kaspaz1 izoformlarının ekspresyon analizi
Ailevi Akdeniz ateşi (AAA) otozomal resesif geçiş gösteren kalıtsal bir hastalıktır. Hastalık pirin proteininin kodlanmasından sorumlu MEFV geninde meydana gelen mutasyondan kaynaklanmaktadır. Mutant pirin tarafından oluşturulan inflamazom kaspaz1'i aktive ederek kontrolsüz İnterlökin 1-beta (IL-1b) salınımını tetikleyip inflamasyona neden olur. Bu çalışmada ataklı ve ataksız dönemdeki hastalarda kaspaz1 izoformlarının ekspresyonları kantitatif PZR ve western blot yöntemleriyle incelendi. Nötrofillerde Kaspaz1 alfa izoformu mRNA ekspresyonu ataklı hastalarda ataksızlara göre daha yüksek olsa da istatistiksel olarak anlamlı farklılık bulunmadı (p=0,835). Nötrofillerde delta-gama ve epsilon izoformları ataklı hastalarda ataksızlara göre istatistiksel olarak anlamlı düzeyde azalmış bulundu (sırasıyla, p=0.0047 ve p=0,004). Western blot sonuçlarına göre yalnızca kaspaz1 alfa izoformunun eksprese olduğu gösterilirken ataklı ve ataksız hastalar arasında ekspresyon açısından belirgin bir fark görülmedi. Periferik kan mononükleer hücrelerinde kaspaz1 izoformlarının (alfa, deltagama ve epsilon) mRNA ekspresyonu ataklı hastalarda ataksız hastalara göre daha yüksek bulunsa da istatistiksel olarak anlamlı fark bulunamadı (sırasıyla p=0,0583 p=0,0712 ve p=0,0549). Western blot sonuçlarına göre ataklı hastalarda daha çok alfa izoformunun, ataksız hastalarda ise beta, delta ve gama izoformunun eksprese olduğu gösterildi. Ayrıca THP-1 hücrelerinde LPS uygulamasının kaspaz1 izoformlarının ekspresyonunda farklılığa neden olmadığı gösterildi. Çalışmamız kaspaz1 izoformlarının ekspresyonunu ataklı ve ataksız hastalarda değerlendiren ilk çalışma niteliğindedir. Kaspaz1 izoformlarının ekspresyonunun daha geniş hasta popülasyonunda değerlendirilmesi gerekmektedir.
Tüm genom yaklaşımlarıyla epilepsi genlerinin incelenmesi
Nadir görülen nörolojik bir hastalık olan Epilepsi, günümüzde bile tam olarak aydınlatılamamış kompleks bir etiyolojiye sahiptir. Bu durum tıp alanında son yıllarda yaşanan gelişmelere rağmen hala bazı hastaların tedavi görememesine neden olmaktadır. Bu sebeple epilepsi ile ilgili yapılacak yeni çalışmalar, özellikle bu hastaların tedavi görmesi ve tedavi gören hastaların tedavisine katkı sağlanması için hala çok büyük önem arz etmektedir. Yeni Nesil Dizileme'deki (NGS) son gelişmeler bu ihtiyacı karşılayabilecek yeni bir bakış açısını ortaya çıkarmıştır. Tüm genom perspektifinde NGS yöntemlerinden biri olan Tüm Ekzom Dizileme (WES) ile elde edilen yüksek çıktılı verilerin analizi, kompleks hastalıklarda bile patojenik varyantların keşfedilmesine olanak sağlamıştır. Bu tez çalışmasında, bir ailedeki Ailesel Yetişkin Miyoklonik Epilepsi'den (FAME) etkilenmiş 3 çocuk, anne, baba, teyze ve dayının bulunduğu 7 birey incelenmiştir. Etkilenmiş 3 çocuğa yapılan WES çalışması datasının analizi ile elde edilen varyantların tüm ailedeki segregasyonu ve epilepsiyle ilişkisi incelenmiştir. Çalışmanın sonucunda, 3 kardeşin WES verisinde de ortak olarak SLC6A19, SCN3A, ADAMTS2, CPO, LAD1, CSF1R ve RNF44 genlerinde tahmin araçları tarafından patojenik olarak nitelendirilen yanlış anlamlı (missense) bazı varyantlar saptanmıştır. Bu varyantlar geniş ailenin diğer bireylerinde de Sanger dizileme yöntemiyle taranmış ve varyantların segregasyonu belirlenmiştir. Ek olarak, bu varyantların bulundukları genlerin epilepsi patogenezi açısından nöronlarda elektriksel uyarıların üretimi ve yayılımı, nörotransmitter taşıma, hücresel bölünme, büyüme veya farklılaşma vb. temel hücresel süreçlerin düzenlenmesi gibi rollerinin olduğu tespit edilmiştir. Elde edilen bulgularla, NGS yöntemlerinin tüm genom ve ekzom perspektifi ile farklı segregasyon modelleriyle kalıtılan kompleks hastalıklarda, hastalıkla ilişkili genlerin tespit edilebileceği ortaya konmuştur. Bu çalışmayı, pentamer ekspaniyonu ile öne çıkan FAME kliniğinde intronik tekrar dizilerinin inceleneceği devam çalışmaları takip edecektir.
Sıcak su epilepsisinde tüm ekzom analizi
Sıcak Su Epilepsisi (SSE), genellikle banyo sırasında vücudun sıcak su ile teması sonucu ortaya çıkan nöbetler ile karakterize nadir bir epilepsi türüdür. Günümüzde, SSE'nin etyopatogenezini açıklama adına yapılan genetik çalışma sayısı kısıtlıdır. Ayrıca, nadir varyantların bu tür kompleks hastalıklardaki önemi yapılan çalışmalarla gün geçtikçe anlaşılmaktadır. Bu nedenle, çalışmada SSE'nin etyopatogenezini aydınlatmaya katkı sağlayacak nadir varyantların bulunması amaçlanmıştır. Tez çalışması kapsamında, Epi25 konsorsiyumu tarafından tüm ekzom dizileme (WES) ve SNP array dizileme işlemleri gerçekleştirilen bağımsız 10 SSE bireyinin verileri ile biyoinformatik analiz yapılmıştır. Analiz sürecinde, ham olarak elde edilen WES verisi kendi iş hattımızdan geçirilip çeşitli filtreleme işlemlerine tabii tutularak ham veriden yanlış anlamlı novel varyantlar tespit edilmiştir. Devamında, yine WES verisi kullanılarak fonksiyonel anotasyon analizi gerçekleştirilmiştir ve varyantların bulundukları genlerin kümülatif bir halde biyolojik sistemdeki etkileri belirlenmiştir. Son olarak, SNP verisi ile CNV analizi yapılarak, genom üzerindeki kopya sayısı değişiklikleri incelenmiştir. WES analizi neticesinde, SLC1A2, KCNB1, UBA5, ADAM22, PIGP, SCN2A, SCN9A, RELN, ABCA2, CACNA1A ve DIAPH1 genlerinde olmak üzere hastalık ile ilişkili olabilecek toplam 12 novel varyant tespit edilmiştir. Fonksiyonel anotasyon analizinde kullanılan gen kümeleri, hücresel süreçler, sinyal iletimi, madde taşınımı gibi bulgular ile ilişkilendirilmiştir. CNV analizi sonuçlarında, önem arz eden kopya sayısı değişikliği tespit edilememiştir.
MİR-638-5P ve akut myeloid lösemi ilişkisinin araştırılması
Akut Myeloid Lösemi (AML), yetişkinlerde en sık görülen lösemi çeşididir, çocuklarda ise lösemilerin %20'sinden sorumludur. MikroRNA (miRNA) molekülleri küçük, protein kodlamayan RNA'lardır fakat hedefledikleri mRNA translasyonunu baskılarlar. Bu sayede biyobelirteç olma potansiyeli taşımaktadırlar. Son çalışmalarda miRNA'ların birden fazla hedef gen üzerinden işlev gördüğü ve birçok hastalıkla ilişkili oldukları gözlemlenmiştir. miR-638-5p, çeşitli kanser türlerinde tümör boyutu, prognoz gibi kanserin klinik özellikleriyle ilişkilendirilen önemli bir tümör supresör miRNA'dır. Kanser hücrelerinde azalan miR-638-5p ekspresyonunun, azalan sağkalım oranı ve kötü prognozla ilişkilendirildiği düşünüldüğünde, hedef genlerinin aydınlatılması önem taşımaktadır. Bu tez projesinde insan AML hücre hatlarına (HL-60 ve NB4) miR-638-5p mimiği Lipofektamin yardımıyla transfekte edildikten sonra miR-638-5p'nin hücre canlılığına etkisi WST-8, hücre ölümüne etkisi Kaspaz-3 yöntemi aracılığıyla incelenmiştir. miR-638-5p'nin olası hedef genleri miRWalk, miRDB, Targetscan, miRTarBase gibi in-silico araçlar kullanılarak, literatürde AML dışında çeşitli kanser türleriyle yapılan çalışmalarda miR-638-5p'nin hedeflediği gözlemlenen fakat AML için araştırılmamış genlerden seçilmiştir. Seçilen PGK1, HOXA9, PIM1, MECP2, MEF2C, SP1 ve SPAG1 genlerinin ifade düzeylerinin miR-638-5p ve non-targeting miRNA transfekte edilen AML hücrelerinde qRT-PZR tekniğiyle araştırılmıştır. miR-638-5p transfekte edilen hücre hatlarının ikisinde de kontrol hücrelere kıyasla PGK1 ve PIM1 ifadelerinin istatistiksel olarak anlamlı seviyede baskılandığı tespit edilmiştir. Buna karşın MECP2, MEF2C ve SPAG1 genlerinin ekspresyonlarında anlamlı bir istatistiksel değişim saptanmamıştır. Sonuçta, HL-60 ve NB4 hücrelerinde hücre canlılığını ve hücre ölümünü etkileyebildiği tespit edilen miR-638-5p'nin PGK1 ve PIM1 genlerini hedefleyerek AML kanser patogenezinde rol oynayabileceğine dair ön bulgular elde edilmiştir. AML olgularının yönetiminde faydalı olabilecek mRNA düzeyinde tespit ettiğimiz bulguların, in-vitro ve in-vivo ileri çalışmalarının yapılması önem arz etmektedir.
Oksidatif fosforilasyon sistemi hastalıklarında mitokondriyal DNA varyantlarının veri madenciliği ile araştırılması
Mitokondrinin halka biçimindeki genomunda (mtDNA) çeşitli patojenik alellerinin heteroplazmik oranı varyant-yükünü belirler ve mitokondriyal hastalıkların klinik heterojenitesinden sorumludur. Bu tez çalışmasının ilk basamağında dokular-arası varyant-yükü karşılaştırmaları yapılarak tanısal testlerde kullanılan örnek etkinliğine öngörü sağlanması amaçlandı. Altı gönüllünün farklı dokularından eş zamanlı elde edilen mtDNA yeni nesil dizi teknolojisiyle araştırıldı. Kasta saptanan varyantların sayısı kana göre yüksek bulundu. Varyant tipi açısından, SNV sayısı kasta daha fazla iken, indellerde sayı yaklaşıktı. Ortak varyantlarda indel sayısı fazla idi. Ortak varyantların frekansı kasta, 1,2 kat, ortak SNV'lerin 3,7 kat, ortak indellerin 1,1 kat yüksek bulundu. Kandaki varyantların %28'inin kasta, kastakilerin %36'sının kanda saptanamadığı belirlendi. Bulgular, kan gibi mitoz hızı yüksek hücrelerde varyantlı mtDNA'ların eleniyor olması, kas gibi bölünmeyen hücrelerde ise bu avantajın oluşmadığı görüşünü destekledi. Ayrıca sonuçlar, mitokondride indellerin yeni oluşan SNV'lerin tamiri sürecinde oluştuğu, bu nedenle indel tipli varyantların kanda daha fazla beklenebileceği görüşüyle örtüştü. Üç doku karşılaştırması için gönüllü sayısı yetersiz bulundu. İkinci basamakta, klinik çeşitlilik ve kas patojenik varyant yükü arasında ilişki kurmak ve kas heteroplazmi oranı tahmini yapabilen çoklu-doğrusal regresyon modeli oluşturmak hedeflendi. 445 yayın incelenerek, m.3243A>G patojenik varyantına sahip hastaların özellikleriyle oluşturulan veri setinin, eksik heteroplazmi oranı bilgileri sebebiyle, yarısı kullanılarak (421 satır, 26 sütun) Model-1, yarısı Model-1'le tamamlanmış veri setiyle (744 satır, 26 sütun) Model-2 oluşturuldu. Bu modellerin ilişkilendirme başarı ölçeği olan ayarlanmış R-kare değerleri sırasıyla 0,47 ve 0,72'ydi. Bu değerdeki artış, veri sayısının artmasıyla ilişkilendirildi. Sonuç olarak, regresyon modelinin geliştirilebilmesinin, satır sayısının arttırılmasıyla, eksik değerlerin, optimize edilmiş klinik formlarıyla giderilmesiyle mümkün olabileceği düşünüldü. Anahtar Kelimeler: Mitokondriyal DNA, heteroplazmi, mitokondriyal hastalıklar, m.3243A>G, çoklu-doğrusal regresyon
Benzer klinik bulgular gösteren birden fazla etkilenmiş olgu bulunan ailelerde genetik etiyolojinin tüm ekzom dizileme yöntemi ile araştırılması
Genetik hastalıklar, Mendel ve non-Mendel hastalıklar olarak iki büyük grup altında incelenir. Nadir hastalıkların yaklaşık %80'inin genetik kökenli olduğu düşünülmekte olup birçoğunun monogenik Mendel kalıtım modeli ile uyumlu olduğu bildirilir. Klinik bulgular genetik etiyolojisi bilinen bir sendroma yönlendirirse, bu olgularda hedefe yönelik genetik testler uygulanarak tanıya katkı sağlanmaktadır. Klinik bulgularla tanısal bir yaklaşım kurulamayan olgularda ise klasik genetik testler uygulanmakta ancak tüm bu uygulamalara karşın olguların yaklaşık yarısı tanı alabilmektedir. Böyle durumlarda 'reverse tanı' olarak nitelendirilen testten tanıya ulaşım sağlayan yeni nesil dizi teknolojilerinden yararlanılmaktadır. Bu tip teknolojilerin pratikte en sık kullanılanı tüm ekzom dizileme (TED)dir. Tez kapsamında, aynı ailede benzer klinik bulgulara sahip en az iki etkilenmiş olgu bulunan, klinik bulguları bilinen bir sendromla uyumlu olmayan, mikroskobik ve submikroskobik herhangi bir kromozomal değişim saptanmayan üç aileden üç indeks olgu ile beş aile bireyine TED uygulanarak etiyolojide rol oynayan olası değişimler araştırıldı. Yapılan analizler sonucunda indeks olgularda klinik bulgularıyla olası ilişkili dört farklı gende (CCDC88C, FLNA, RP1L1, NUP188) varyantlar saptandı. Sanger dizileme yöntemiyle doğrulanan ve aile çalışmaları yapılan bu varyantlardan ikisi herhangi bir hastalık ilişkisi daha önce bildirilmeyen yeni değişimlerdi (FLNA'da c.1829-1G>T (p.(?)) ve NUP188'de c.124C>T (p.Arg42Ter), ikisi ise daha önce bildirilmiş olan (CCDC88C'de c.1915C>T (p.Arg639Ter) ve RP1L1'de c.455G>A (p.Arg152Gln) varyantlardı. Çalışmaya dahil edilen olguların tümünde bir değişim saptanmış olsa da, örnek sayısının azlığı ve seçim kriterleri nedeniyle TED tekniğinin her olguda benzer tanı katkısı sağlayacağını iddia etmek fazla iyimser olacaktır, ancak çalışmamız 'yöntemden tanıya' giden yolda yaklaşımsal aşamaları sunması bakımından, tanıları kesinleşen ailelere genetik danışma verilmesi ve hastalığı önleyici stratejiler konusunda bilgilendirilmeleri bakımından önemli olmuştur. Sonuç olarak çalışmamız TED'in hastalık ilişkili bilinen genlerde olduğu kadar, yeni varyasyonları tespit etmek ve hastalık ilişkili yeni genleri araştırmaya yönelik katkısını da göstermektedir.
Tanı konulamayan kalıtsal metabolik hastalıklarda tümekzom dizi analizinin katkısı
Kalıtsal Metabolizma Hastalıkları (KMH), biyokimyasal yolaklardaki bozuklukları kapsayan, klinik ve genetik olarak heterojenliği nedeniyle tanısal güçlükleri olan genetik hastalıklardır. En büyük payı, nükleer ve mitokondriyal patojenik varyantlarla ilişkili mitokondriyal hastalıklar oluşturur. DNA dizi teknolojilerindeki gelişmeler tanı güçlüğü olan bu tip hastalıkların genetik etiyolojisinin aydınlatılmasına önemli bir ivme kazandırmıştır. Bu tezin amacı, tanı konulamayan KMH'da görülen klinik fenotiplerin, moleküler etiyolojilerinin aydınlatılmasında, tüm ekzom dizileme (TED) yönteminin katkısını araştırmaktır. Çalışmaya, on dördü mitokondriyal hastalık olmak üzere 20 aileden 26 etkilenmiş olgu dahil edildi. Özgün tasarlanan fragmantasyon tabanlı mtDNA dizileme ve TED analizi için Thermo Scientific™ IonGeneStudio S5 Sistemi ve IonReporter analiz programı kullanıldı. Kültüre edilen kas/kan hücrelerinden transkript çalışmaları yapıldı. On dört farklı aileden, on sekiz etkilenmiş olguda TK2, POLG, EARS2, MICOS13, ECHS1, NDUFAF6, FBXL4, CAPN3, DYSF, ALG8, OXCT1, DHTK2, SMARCAL1 genlerinde on sekiz farklı patojenik/olası patojenik varyant gösterilirken altı ailede genetik etiyoloji aydınlatılamadı. Sanger dizileme yöntemiyle doğrulanan ve aile çalışmaları yapılan bu varyantlardan sekizi, novel veya hastalık ilişkisi daha önce bildirilmeyen çok nadir değişimlerdi; EARS2'de c.1283delC (p.(Pro428Leufs*)) ve c.319C>T(p.Arg107Cys), ALG8'de c.479A>T(p.His160Leu), ECHS1'de c.202G>A (p.Glu68Lys), NDUFAF6'da c.479delA (p.(Asn162Ilefs*27)), OXCT1 c.1370C>T (p.Thr457Ile), c.1173-139G>T SMARCAL1'de c.1027_1034delTTCGAGGC (p.(F343Rfs*13)) idi. Olguların klinik, radyolojik, biyokimyasal ve histopatolojik sonuçları gen ve varyant ilişkilerini destekledi. TED analizi ile tüm aileler için %65, mitokondrial grup için %50 oranında moleküler genetik tanı sağlandı. Tüm ailelere prenatal/preimplantasyon genetik tanı olanaklarını içeren kapsamlı genetik danışma verildi. TK2 eksikliği olan iki olgu ilaca erken erişim programına yönlendirildi. Tanı konulamayan altı ailede ise gelecek projeler dahilinde tüm genom dizi analizi yapılması planlandı.
Kronik venöz yetersizlikte kodlamayan RNA düzeylerinin belirlenmesi ve hastalık ciddiyetine etkisi
Kronik venöz yetersizlik (KVY), patolojik kapak yetersizliği veya venöz tıkanıklık nedeniyle venöz hipertansiyona bağlı gelişen ve telenjiektazilerden ağrılı variköz venlere ve hatta cilt ülserleri gibi ciddi komplikasyonlara sebep olan önemli bir sağlık problemidir. Bu çalışmada, KVY tanısı olan hastaların lökositleri ve variköz damarlarındaki kodlamayan RNA'ların ifade düzeylerinin analizi ve hastalık ile ilişkilerinin belirlenmesi amaçlandı. Bu amaçla, KVY gelişmiş orta ve ciddi semptomları olan hastalardan pake ekzisyonu uygulaması esnasında alınan variköz ven dokuları ile kan örneklerinde (n= 56) ve kontrol grubundan alınan normal safen ven dokuları (n=8, koroner "by-pass" orerasyonu esnasında) ile kan örneklerinde (n=37) aday kodlamayan RNA'ların ifade düzeyleri kantitatif RT-PZR ile belirlendi ve klinik veriler ile istatistiksel olarak karşılaştırıldı. Bu çalışmada, KVY hasta grubunda kontrole göre lncRNA-AK021444 ifade düzeyinin, lökositlerde 4,5 kat artarken (p=0.015), venöz dokularda 12,8 kat azaldığı bulundu (p=0.0001). Ayrıca, KVY'li hastaların venöz dokularında miR-222 ifade düzeyinin 7,4 kat arttığı belirlendi (p=0.016). Ek olarak, KVY hasta grubunun lökositlerinde kontrole göre, miR-202 ifade düzeyinin 32 kat (p=0.0001), lncRNA-GAS5'in ise 51 kat azaldığı (p=0.0001) belirlendi. Kodlamayan RNA'ların ifade düzeyleri cinsiyete göre alt gruba ayrıldığında tüm grup ile benzer profilde olduğu belirlendi. Yapılan ROC analizlerinde lökositlerde azalan ifade düzeyleri olan miR-202 ve GAS5 ile artan ifade düzeyi olan AK021444'in KVY'nin tanısı için aday biyobelirteçler olabileceği belirlendi. Sonuç olarak, ilk defa bu çalışmada araştırılan dört aday kodlamayan RNA'dan üçünün (miR-202, AK021444 ve GAS5) tanıda kullanılabilecek biyobelirteç adayları olabileceği gösterildi. KVY'li venöz damar dokularında değişen ifade düzeyleri nedeniyle miR-222 ve AK021444 kodlamayan RNA'ların hastalık patogenezindeki rolünü belirlemek için daha detaylı analizlere ihtiyaç duyulmaktadır.
Santral erken puberte olgularında yeni nesil dizileme ile moleküler patolojinin aydınlatılması
Kızlarda sekiz, erkeklerde dokuz yaşından önce ikincil cinsiyet özelliklerinin gelişmesi erken puberte (EP) olarak tanımlanır. Gerçek/Santral erken puberte (SEP), gonadotropin salgılayan hormonun hipotalamik-hipofiz-gonadal ekseni erken etkinleştirmesiyle ortaya çıkar. Kızlarda daha sık gözlenen SEP'in etiyolojisinde %60-80 genetik bir köken olduğu ve yaklaşık %27,5'inde otozomal dominant kalıtım bildirilmektedir. Günümüzde puberte yolaklarında 40'dan fazla gen tanımlanmış ancak pek azı (KISS1, KISS1R, MKRN3, DLK1 ve PROKR2) SEP ile ilişkilendirilmiştir. Çalışmamızda, 18 ailevi SEP olgusunda bildirilen genlerin Sanger Dizileme (SD) ile taranması, ilişkili değişim saptanmayan iki ailede tüm ekzom dizileme (TED) ile yeni genlerin araştırılması amaçlandı. DLK1'de, iki farklı kız olguda iki farklı tanımlanmamış varyant (c.67+78C>T ve c.357C>G;p.(Tyr119Ter)) ve MKRN3'de bir kız olguda daha önce SEP ilişkisi bildirilmiş bir değişim (c.982C>T;p.(Arg328Cys)) gösterildi. Aile çalışmasında DLK1 ve MKRN3 varyantlarının maternal imprited özellik ile uyumlu olarak anlatım yapan paternal allelde yer aldığı gösterildi. DLK1 ve MKRN3'ün olgularımızdaki SEP'in %17'sinden sorumlu olduğu saptandı. TED uygulanan iki aileden birinde ilişkili bir gen gösterilemezken diğerinde CDHR3'de evolüsyonel olarak korunmuş intronik bölgede (splicing acceptor) c.1225-1G>A saptandı ve değişimin diğer aile bireylerinde klinikle uyumlu segrege olduğu gösterildi. Hücre zarında kalsiyum-bağımlı adhezyon yapısı ile hücre-hücre etkileşiminde ve hücre-iskeleti kompleksinin düzenlenmesinde rolü olan cadherin protein ailesinin bir üyesi olan CDHR3'ün günümüzde herhangi bir fenotiple ilişkisi bildirilmemiştir. İleride CDHR3'ün SEP ile ilişkisinin fonksiyonel olarak araştırılması ve bilinen genlerde mutasyon saptanmayan diğer olgu ve ailelerimizde TED yapılması planlandı. SEP'te yeni genlerin tanımlanarak puberte yolaklarının daha iyi anlaşılmasının prepubertal çocukların, presemptomatik tanı ve tedavisinde yeni stratejilerin geliştirilmesine katkı sağlayabileceği düşünüldü.
Behçet hastalığının erken teşhisi için semptom temelli bir karar destek aracı
Behcet's disease (BD) is an inflammatory disorder that belongs to the systemic vasculitic syndromes and affects all types of vessels and sizes. BD in Turkey has the highest incidence among other countries (between 20 upto 420 per 100,000 people). Since no definitive test is available for BD, general basis for detection of this disorder is looking for physical manifestations. As time progresses the symptoms get worse, Therefore, early detection of the disease is important and could make patients' condition less painful. Nowadays, several studies with focus on developing clinical decision support system for early diagnosis of various diseases have been performed. In this thesis, we intended to work on a pre-diagnosis method of Behcet's disease and develop a mathematical model based on Bayes' theorem and conditional probability for patients, who are suspicious of BD. By performing the model in MATLAB program, we created a clinical decision support system that is able to detect BD cases based on physical symptoms. Our proposed system was able to detect BD cases with high frequency and also could exclude cases with diseases other than BD. We believe, this model could provide support for people in early diagnoses of Behcet's disease and help refer them to the proper expert
PERK ve HRI aracılı entegre stres yanıtın Behçet hastalığındaki rolü
Behçet Hastalığı (BH) tekrarlayan oral ve genital ülserler, üveit ve deri lezyonları ile karakterize, sistemik bir inflamatuar hastalıktır. BH etiyolojisi hala tam olarak bilinmemektedir; bu, varsayılandan çok daha kompleks bir hastalık olduğuna işaret etmektedir. Entegre stres yanıtı (ISR), çeşitli uyaranlara karşı hücresel tepkilerin kontrolünde anahtar bir rol oynayan ökaryotik translasyon başlatma faktörü 2 alfa'nın (eIF2α) fosforilasyonunu tetikleyen oldukça korunmuş bir yoldur. ISR yolağında streslerin tespiti dört kinazla gerçekleştirilir: Protein kinaz R (PKR), Genel kontrol baskılanamaz 2 (GCN2), PKR-benzeri endoplazmik retikulum kinaz (PERK) ve Hem düzenleyici inhibitör (HRI). ISR'deki ana mekanizma, eIF2α'nın, ISR kinaz ailesinin dört üyesinden biri ya da birkaçı tarafından fosforilasyonudur; bu, global protein sentezinde bir düşüşe neden olurken, aktive edici transkripsiyon faktör 4'ün (ATF4) dahil olduğu bir grup seçili genin ifadesinin yukarı düzenlenmesine yol açmaktadır. Tez çalışmamızın amacı, ISR yolağındaki eIF2α, PERK, HRI, HSPB8 ve ATF4'ün BH'deki gen ifadesi değişimlerini araştırmaktır. Tez çalışması için gerekli olan hasta örnekleri İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi İç Hastalıkları Anabilim Dalı Romatoloji Bilim Dalı'na başvuran BH tanısı konulmuş 83 hastadan ve 33 sağlıklı gönüllüden sağlandı. Çalışmada, kan ve eklem sıvısı örneklerinden izole edilmiş RNA materyalinde, hedef genlerin gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PZR) ile ifadeleri analiz edildi. Sonuçlarımız, eIF2α, PERK, HRI, HSPB8 ve ATF4 gen ifadelerinin BH hastalarında değiştiğini gösterdi. Bulgularımız doğrultusunda, ISR yolağının BH patogenezinde önemli bir rolü olduğu; bununla birlikte hastalık tanı ve tedavisinde yeni yaklaşımlar olarak hedeflenebileceği düşündesindeyiz. Ayrıca ilgili genlerin ISR yolağında BH patogenezindeki rollerinin aydınlatılması için daha geniş çapta araştırmalara gereksinim olduğu kanaatindeyiz. Anahtar Kelimeler: Behçet Hastalığı, ISR, PERK, HRI, ATF4 Bu çalışma, İstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir. Proje No: 36168
Pediatrık akut lenfoblastik lösemı olgularında minimal rezidüel hastalığın moleküler düzeyde değerlendirilmesı
Akut Lenfoblastik Lösemi (ALL), lenfoid progenitör hücrelerin kemik iliği ve ekstramedüller bölgelerde klonal proliferasyonu ile karakterize bir hematolojik malignitedir.ALL pediatrik (ortalama 5 yaş) ve erişkin (ortalama 50 yaş) olmak üzere yaşa bağlı iki farklı dağılım gösterir.ALL ağırlıklı olarak çocukları etkilerken yetişkinlerdeki oranı yaklaşık %20'dir. Lösemide tedaviden kaçan ve nükslere yol açan hücreler minimal rezidüel hastalık (MRD) olarak tanımlanır. Nüks, akut lösemilerde oldukça ciddi bir sorundur. Günümüzde lösemi tedavisi sonrası nükslere neden olan en önemli faktörün MRD olduğu düşünülmektedir. Bundan dolayı MRD'nin takibi hastalıksız yaşam açısından önem taşımaktadır. Tez çalışmasının amacı nüks olan/olmayan Pediatrik Akut Lenfoblastik Lösemi (ALL) olgularından alınan kan ve kemik iliği örneklerinde CXC Kemokin Reseptörü tip 4 (CXCR4), Platelet Türevi Büyüme Faktörü Beta (PDGFRB), Kemokin Ligandı-5 (CCL5/RANTES), Sarmal- İlmek-Sarmal Proteini 38 (TWIST1) ve Vasküler Endotelyal Büyüme Faktör Reseptörü 2 (KDR/VEGFR2) gen ifade düzeylerinin pediatrik ALL'de ve MRD'de klinik tablolara bağlı olarak biyobelirteç olarak kullanılabilirliği olup olmadığını araştırmaktır. Tez çalışması için gerekli olan hasta örnekleri , Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Anabilim Dalı Pediatrik Hematoloji Bilim Dalı servisinde tanı konmuş 46 pediatrik ALL hastalarından ve 10 sağlıklı kontrol grubundan sağlandı. Toplanan kan ve kemik iliği örneklerinden öncelikle RNA izolasyonu işlemi yapıldı. Ardından RNA örneklerinden Real Time PZR yöntemi ile söz konusu genlerin ifade düzeylerine bakıldı. Sonuçta, pediatrik ALL'de RANTES ifade düzeyinin değiştiğini saptadık. Bulgularımız ışığında RANTES geninin ALL patogenezinde önemli rolü olduğu ve biyobelirteç olarak değerlendirilebileceği düşüncesindeyiz. RANTES'in ALL ve MRD'de biyobelirteç olarak kabul edilmesi için daha geniş kohortlarda yapılan destekleyici çalışmalara ihtiyaç olduğu kanaatindeyiz.
NMRAL1 proteininin HTATIP2 üzerine etkisi ve baş-boyun kanserinde biyobelirteç olarak incelenmesi
Baş-boyun kanserlerinden en sık görülen skuamöz hücreli baş-boyun kanseridir. Kanser hücreleri artmış oksidatif stresi azaltmak, redoks dengesini korumak için NADPH'a ihtiyaç duyar. NADPH, Htatıp2 ve Nmral1 gibi proteinlerle etkileşime girerek işlev gösterir. Çalışmanın amacı; Nmral1'in yokluğunda Htatıp2'nin ifade düzeyinin ve hücresel yerleşiminin değişip değişmediğini belirlemektir. Htatıp2 ile etkileşimi gösterilmiş olan c-Myc ve siklin D1 genlerinin Nmral1 yokluğunda ifade düzeylerini incelemektir. Kanserli ve normal hücre hatlarında Nmral1 geni siRNA ile susturularak HTATIP2, c-MYC ve CCND1 gen ifade düzeylerine bakılmıştır. İmmunsitokimya ile Nmral1 ve Htatıp2'nin hücresel yerleşimi belirlenmiştir. Ayrıca larenks kanserli 50 hastanın tümör ve normal dokularında mRNA ve protein ifadelerine bakılmıştır. NMRAL1 geni normal baş-boyun hücre hattında %62, kanser hücre hattında %74 susturuldu. Susturma sonrası; kanser hücre hattında HTATIP2 ve CCND1 mRNA ifadesi değişmezken, c-MYC ifadesi azalmıştır. Normal hücre hattında HTATIP2 mRNA ifadesi azalırken, c-MYC ve CCND1 ifadesi değişmedi. NMRAL1 susturması sonrası; Htatıp2 protein miktarı ve yerleşimi kanserli hücre hattında değişmezken, normal hücre hattında sitoplazmada yoğunlaşmıştır. NMRAL1 ifade düşüklüğü her iki hücre hattında hücre canlılığını ortalama %60 oranında azaltmıştır. Larenks tümör dokularında NMRAL1(p=0,001) ve c-MYC (p<0,001) mRNA ifadesi azalmıştır. HTATIP2 ifadesi artan hastaların %85,2'sinde c-MYC ifadesi, %65,9'unda CCND1 ifadesi azalmaktadır. NMRAL1 mRNA ifadesi azalan hastaların %85,7'sinde c-MYC ifadesi azalmaktadır. Sonuç olarak; Normal baş-boyun hücre hattında NMRAL1 geni yokluğunda Htatıp2 proteininin sitoplazmada daha yoğun olması sitoplazmik görevlerinin arttığını düşündürmektedir. HTATIP2 larenks kanserinde c-MYC ve CCND1gen ifadesi üzerine baskılayıcı etkisi söz konusudur. Ancak NMRAL1 genininc-MYC ile aynı yönlü, CCND1 ile ters yönlü korelasyon göstermektedir. Öngörülen bu ilişkileri belirlemek için ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. Anahtar Kelimeler: Baş-Boyun kanseri, NMRAL1, HTATIP2, siRNA, Western Blot
Pediatrik akut lenfoblastik lösemili hastalarda prognostik moleküler belirteçlerin analizi
Akut lenfoblastik lösemi (ALL) pediatrik kanserler arasında en sık görülen hastalık grubudur. Pediatrik ALL hastalarında sağkalım oranları her ne kadar yüksek olsa da hastalığın tekrar etmesine (%15-20) bağlı ölümlerin gerçekleştiği bilinmektedir. Günümüzde ALL'nin genomik profili hakkında önemli gelişmelerin tanımlanması, hedefe yönelik tedavi protokollerinin uygulanmasına olanak sağlamaktadır. Yapılan çalışmalar ile yeni genetik değişiklikler tanımlanmıştır. BCR-ABL1-benzeri ALL (Ph-like ALL) B-ALL'de özel bir alt grup olup bu hastalarda gen aktivasyonundan sorumlu birçok tirozin kinaz ve sitokin reseptörlerinin yer aldığı gösterilmiştir. CRLF2 (Cytokine Receptor-Like Factor 2) geni sitokin reseptör ailesinin bir üyesi olup bu yeni alt grubun yaklaşık yarısında IGH-CRLF2 ve P2RY8-CRLF2 şeklinde görülmektedir. CRLF2 geninin artmış anlatımı, ALL hastalarında olumsuz klinik tabloya katkı sağladığı ve kötü prognozla ilişkili olduğu bilinmektedir. Bu tez çalışmasında, 59 pediatrik B-ALL ve 11 pediatrik T-ALL hastasının tanı zamanı materyalleri kullanılarak, gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile relatif CRLF2 mRNA anlatım düzeylerinin belirlenmesi ve prognostik etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Yüksek anlatım eşik değeri ΔCt=8,02 olarak belirlenmiştir. B-ALL hastalarının %15'inde (n=11) yüksek CRLF2 (Y-CRLF2) mRNA anlatımı saptanmıştır. ΔCt≥8,02 olan 48 B-ALL 11 T-ALL hastasında normal CRLF2 (N-CRLF2) mRNA anlatımı olduğu belirlenmiştir. Y-CRLF2 ile N-CRLF2 grupları, BFM protokolü klinik parametreleri göz önünde bulundurularak yapılan istatistiksel analizlerde anlamlı sonuç tespit edilmemiştir. Benzer şekilde, CRLF2 medyan üstü ve altı ekspresyon gösteren hastaların klinik verileri arasında anlamlı fark belirlenmemiştir. Y-CRLF2 gen anlatımına sahip hastaların yaş medyan değeri 4, %6,3'ü sağ, %6,3'ünde nüks gözlenmediği, %5,4'ün tedaviye cevap verdiği, tanı lökosit <100.000(x109/L) olduğu, %0.4'ü yüksek risk ve %0.6'sının düşük risk grubunda olduğu, MSS tutulumunun olmadığı tespit edilmiştir. Genel sağkalım (cox p=0.88) ve olaysız sağkalım (cox p=0.81) analizlerinde anlamlı sonuç belirlenmemiştir. Pediatrik ALL'de prognostik moleküler belirteç olarak gösterilen CRLF2 geni aşırı artmış anlatım düzeylerinin kantitatif PZR yaklaşımları ile tespiti eşik değer belirlemedeki farlılıklar nedeni ile güçlükler barındırmaktadır. Bu nedenle ilave olarak gendeki yapısal değişiklikerin de belirlenmesi hastaların doğru ayrıştırılması için önemlidir. Bu çalışmada her ne kadar Y-CRLF2 saptanan olgularda klinik olarak anlamlı ve prognostik farklılıklar saptanmasa da Ph-benzeri hastaların seçiliminde Y-CRLF2 olguların belirlenmesi önemlidir. Ayrıca Y-CRLF2 hastalar JAK inhibitörleri ile tedaviye aday hastalardır.
Miyeloproliferatif neoplazilerde JAK2 ve JAK2V617F MRNA hedefli nanopartikül uygulamasının cgas-sting yolağına etkilerinin araştırılması
Çalışmada miyeloproliferatif neoplaziler ile özdeşleşmiş JAK2V617F mutasyonu varlığında, bir sitozolik DNA tespit sinyal yolağı olan cGAS-STING yolağının etkinliğinin araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaçla JAK2V617F mutasyonu taşıyan HEL ve SET2 hücre hatları ile yabani tip JAK2'ye sahip K562 hücre hattında, cGAS-STING yolağı, mutant ve yabani tip JAK2 mRNA'sıyla eşleşerek çift zincirli yapıların oluşmasını sağlayan Nanoflare partikülleriyle uyarıldı. Nanopartiküllerle farklı sürelerde muamele edilmiş hücrelerde, cGAS-STING ve JAK-STAT yolaklarıyla ilişkili genlerin anlatımları gerçek zamanlı kantitatif PZR uygulamasıyla test edildi. Çalışmada cGAS, STING, TBK1, IRF3, TLR9, JAK2, STAT1 ve STAT2 genlerinin anlatımları her üç hücre hattında incelendi. HEL ve SET2 hücrelerine nanopartiküllerle yapılan uyarım sonucu test edilen genlerin anlatımlarında değişimler gözlendi. K562 hücre hattında ise değişimlerin sınırlı olduğu gözlendi. Gen anlatımlarının kısa süreli inkübasyonlarda, yarım saatlik dilimlerde değişkenlik gösterdiği gözlendi. Genel olarak mutant JAK2 mRNA'sına özgü nanopartiküllerin cGAS-STING yolağındaki genlerin anlatımını yabani tipe göre daha yüksek seviyelere çıkardığı gözlendi. Bu sonuçlar nanopartiküller ile mutant JAK2 mRNA'sının bloklanmasının cGAS-STING yolağının aktivasyonunu pozitif yönde etkilediğini göstermiş oldu. Bu durum MPN'lerde sürekli aktif halde olan JAK2 proteinin cGAS-STING yolağında baskılayıcı etkisinin göstergesi olarak yorumlandı.
Multiple myeloma tüm genom transkriptom datasının biyoenformatik analizi ile belirlenen olası ilişkili genlerin araştırılması
Plazma hücre diskrazileri grubunda yer alan Multiple Myeloma (MM), kemik iliğinden köken alarak kontrolsüz çoğalan malign plazma hücreleriyle karakteristiktir. Önemi bilinmeyen monoklonal gammopati (MGUS), ise asemptomatik premalign bir plazma diskrazisidir. Multiple Myeloma hastaları ile sağlıklı kemik iliği kontrollerinin hücre havuzlarından transkriptom yapılarak genlerin ekspresyon düzeyleri bir önceki çalışmamızda araştırılmıştır.Transkriptom verilerinden belirlenen 13 aday gen oldukça kıymetli ve özgündür. MM patogenezinde bu genlerin doğrudan ya da dolaylı ilişkilerinin ortaya çıkarılması için yeni hasta ve kontrol gruplarında validasyonlarının yapılması amaçlanmıştır. Çalışmamızda yeni tanılı, tedavi görmemiş 38 MM hastasından ve 23 MGUS ile 16 kontrol grubunun kemik iliği materyallerinden aday genlerin ekspresyon seviyeleri qRT-PCR yöntemi ile incelenmiştir. Sonuçlar SPSS.25 istatistik programında analiz edilmiştir. MM, MGUS ve kontrol grubuna göre ERAP1, HYOU1 ve OTUD1 genlerinin ifadesi istatiksel olarak anlamlı bulunmamıştır. Myeloma patogenezinde ilişkisini araştırdığımız geriye kalan 10 aday genimizin ekspresyon seviyeleri ise kontrol grubuna göre yüksek seviyede eksprese olup istatistiksel analizde anlamlı bulunmuştur (p<0,05 ve p<0,001). Özellikle MGUS'tan MM'e malign hale dönüşümde COPE ve ISG20'nin erken tanı belirteci olabileceğini öneriyoruz.Literatürdeki veriler doğrultusunda ekspresyonunu yüksek bulduğumuz pekçok aday genin MM patogenezinde ER stres yolu ile ilişkisinin olabileceğini düşünmekteyiz.MM'de son yıllarda proteozom yolağı üzerinden çeşitli tedaviler uygulansa da halen yeni teröpatik hedeflere oldukça ihtiyaç duyulmaktadır.Bu çalışma ile aday genlerin validasyonu yapılarak halen aydınlatılmayan MM patogenezine katkıda bulunulmuştur. Ayrıca MM tedavisinde ihtiyaç duyulan TRIB1 gibi yeni terapötik hedefler içermesi ve MM tanısında prognostik değere sahip olabilecek TMED9 gibi aday genlerin olması açısından umut verici özellik taşımaktadır. Anahtar Kelimeler: Multiple Myeloma, MGUS, Transkriptom, qRT-PCR, Plazma Hücre Diskrazileri
Nörofibromatozis tip1 olgularında NF1 gen mutasyonlarının yeni nesil dizileme teknolojisi ile araştırılması
Von Recklinghausen hastalığı olarak da bilinen Nörofibromatosis Tip1 (MIM # 162200), etnik ve ırksal kökenden bağımsız, dünya genelinde 3000 ila 4000 kişide 1 prevalansına sahip yaygın bir Ailevi kanser sendromudur. Bu hastalık, kromozom 17q11.2'de lokalize tümör baskılayıcı bir gen olan NF1 genindeki dominant mutasyonlardan kaynaklanan kalıtsal bir bozukluktur. NF1 geni, nörofibromin (NM_000267) olarak adlandırılan sitoplazmik bir protein kodlar. Nörofibromin, esas olarak GTPaz aktive edici protein GAP olarak işlev görür ve RAS (rat sarkom proteini) aktivitesini inhibe eder. Yapilan araştırmalar, NF1 ile ilişkili tümörlerde, nörofibromin ekspresyon kaybının yüksek seviyelerde aktif RAS ile ilişkili olduğunu göstermektedir. NIH tarafından belirlenen NF1 tanı kriterleri arasında çoklu cafe-au-lait lekeleri, iriste Lisch nodülleri, aksiller ve inguinal çillenme ve nörofibrom adı verilen benign periferik sinir kılıfı tümörleri, optik gliom, özgün kemik lezyonları ve aile hikayesi bulunmaktadır. NF1 ile ilişkili diğer klinik komplikasyonlar arasında nörolojik, renal, kardiyovasküler, gastrointestinal, endokrin ve ortopedik tutulum, öğrenme ve entellektüel yetersizlik, dikkat eksikliği ve perferik sinir kılıfı veya merkezi sinir sistemi maligniteleri bulunmaktadır. NF1 hastalarının yaklaşık dörtte biri önemli morbidite ve mortaliteye neden olan bu klinik komplikasyonlardan birini veya birkaçını göstermektedir. Genel olarak farklı hastalardan elde edilen tümör dokularında saptanan germline ve somatik mutasyonların karakterizasyonu, NF1 gen mutasyonunun tipi, doğası ve sıklığı hakkında bilgiler sağlamış olsa da, NF1'de tümör oluşumunun moleküler mekanizmaları hakkındaki mevcut bilgimiz halen sınırlıdır. Bunun yanı sıra birçok sendrom nörofibromatozisi ile ortak klinik bulgular göstermekte ve bu durum özellikle antenatal dönemde kesin tanı açısından zorluklara yol açabilmektedir. Bu nedenle, nörofibromatozis ile benzer sendromların sıklıklarının ve moleküler etiyopatogenezlerinin bilinmesi, prenatal ve postnatal olguların izlemi açısından önem kazanmaktadır. NF1'nin klinik heterojenliği, hastalığın tanısıda sorumlu NF1 genin tüm ekzonlarını eş zamanlı dizilenmesini, delesyon/duplikasyon araştırılmasının yapılmasını gerektirmektedir. Çalışmamızda, klinik tanı olarak NF1 düşünülen olgularda, ilişkili NF1 geninin tüm ekzonları ve ekzon-intronsınır bölgelerini içeren, tasarlanmış NF1gen testi ile YND; Ion Torrent platformunda yapılan araştırmadan elde edilen varyantlar incelendi. Klinik kesin tanıda önemi belirlenen varyantlara özgün Primerler tasarlanarak Sanger dizileme ile doğrulandı, olanaklı olgularda segregasyon analiz sonuçları araştırıldı, herhangi bir varyant ilişkisi saptanmayanlarda yöntemin tasarımı gereği kapsanmayan bölgeleri Sanger dizileme ile incelendi. Sanger dizilemede patojenik varyant saptanmayan olgularda MLPA yöntemi ile delesyon/duplikasyon analizi yapıldı. Del/dup analiz sonucu pozitif olgularda array-CGH yöntemi ile NF1 mikrodelesyonu sendromu araştırıldı. Sonuç olarak toplalm 27 ailede klinik kesin tanılı olgularda NF1 geninde tanımlanmış 11 yeni variant ve literatürde bildirilmemiş 11 olası ilişkili variant saptandı ve tanı oranı % 94 olarak belirlendi. Çalışma sonuçlarımızın, Türk toplumunda NF1 geni mutasyon tipleri ve frekanslarının saptanmasına, taşıyıcı bireyleri belirlenerek iyi ve kötü huylutümörler açısından erken dönemden itibaren takip olanağının sağlanmasına, genetik danışmada, prenatal veya pre-implantasyon öncesi genetik tanıda yardımcı olmasına katkı sağlaması beklenir.
Nadir iskelet displazilerinde yeni genlerin tanımlanması ve ilişkili proteinlerin fonksiyonlarının araştırılması
GİRİŞ: İskelet displazileri kemik ve/veya kıkırdak dokunun etkilendiği çoğunlukla orantısız boy kısalığı ile karşımıza gelen geniş bir hastalık grubudur. Bugüne kadar 450'den fazla iskelet displazisi sendromu tanımlanmış ve ilişkili 437 farklı gen bildirilmiştir. Halen bir kısım iskelet displazisinin ise genetik nedeni aydınlatılamamıştır. İskelet displazileri, klinik ve genetik olarak çok heterojen bir hastalık grubudur. Farklı genlerdeki mutasyonlar benzer fenotiplere neden olabildiği gibi, aynı gendeki mutasyonlar birbirinden çok farklı fenotiplere neden olabilmektedir. Klinik olarak tanı koyması bu nedenle zordur ve tecrübe gerektirir. Yeni nesil dizileme yöntemleri ile genomunun tamamının veya belirli bir bölümünün eşzamanlı dizilemesi mümkün hale gelmiştir. İskelet displazileri gibi örtüşen bulguların olduğu durumlarda, bu yöntem ile pek çok hastalığın moleküler temellerinin aydınlatılması mümkün olmuştur. AMAÇ: Çalışmamızda klinik ve/veya moleküler olarak kesin tanı konulamayan iskelet displazisi olgularında tüm ekzom dizileme ile ilişkili genlerin araştırılması, iskelet displazine neden olabilecek yeni aday genlerin belirlenmesi ve bilinen sendromlarla ilişkili genlerde mutasyon saptanan hastalarda yeni bulguların tanımlanarak fenotipik genişlemeye katkı sağlanması amaçlanmıştır. YÖNTEM ve BULGULAR: Çalışmamıza 68 aileden 87 olgu dahil edildi. Osteogenezis imperfekta ve azalmış kemik mineralizasyonu ile seyreden sendromlar, primordial cücelik ve slender kemik displazi grubu hastalıklar, kraniosinositoz, ektrodaktili sendromları ve fankoni anemisi tanılı hastalar çalışma grubuna dahil edilmedi. Tüm ekzom dizileme yöntemi ile 46 ailede (%67) klinik tanı kesinleştirildi, 7 (%10) ailede hastalığa yol açabileceği düşünülen yeni aday gen belirlendi. 15 ailede ise hastalığın moleküler nedenini açıklayacak bir sebep saptanamadı. TARTIŞMA ve SONUÇ: Bu çalışmada tüm ekzom dizilemenin nadir iskelet displazisi sendromlarında tanı koyma başarısı %67 olarak saptanmıştır. Çalışmamızda tanı koyma başarısı literatürde bildirilenden daha yüksek saptanmıştır. Bunun nedeni; kliniğimizin iskelet displazileri için referans merkezi olması, çalışmaya alınan hastaların büyük titizlik ile seçilmesi, hastalarda klinik ve radyolojik bulguların çok detaylı tanımlanması ve verilerin bu doğrultuda incelenmesidir.
Hipokomplementemik ürtikeryal vaskülit sendromlu hastalarda AGBl3 mutasyonu analizi
Hipokomplementemik Ürtikeryal Vaskülit Sendromu (HUVS), ürtikeryal vaskülitin alt tipi olan otoimmün bir hastalıktır. Oldukça nadir görülen HUVS için literatürde 200'den az vaka bildirilmiştir. Bu hastalık kadınlarda erkeklere oranla daha sık görülürken çocuklarda daha nadir görülmektedir. Düşük kompleman seviyeleri, serumda anti-C1q çökeltileri ve bunlara eşlik eden ateş, halsizlik, yorgunluk, kas romatizması, tekrarlayan ürtiker gibi sistemik bulgularla karakterize olan HUVS'nin patofizyolojisi ve genetik etiyolojisi tam olarak aydınlatılamamıştır. HUVS'li çocuğu olan trio bir ailede yaptığımız tüm ekzom dizileme çalışması analizlerinde AGBL3 aday gen olarak belirlenmiştir. AGBL3 proteini tubulinlerin post-translayonel modifikasyonlarında görevlidir ve ∆2-tubulin oluşturur. Tubulinlerin otoinflamatuar ve otoimmün hastalıklar ile olan ilişkili olduğu bildirilmiştir. Bu durum AGBL3'ün mikrotubuller üzerinden inflamasyonla ilişkili olabileceğini düşündürmektedir. Tüm ekzom dizileme çalışmasında AGBL3 genindeki c.769.C>T mutasyonu HUVS'li çocukta homozigot, Mukokütöz Behçet öykülü babada ve sağlıklı annede heterozigot olarak görülmüştür. Bu tez çalışmasında 2 HUVS'li hastada AGBL3 geni ekzon bölgeleri Sanger dizileme yöntemi ile incelenmiştir. Dizileme sonucunda hastalarda farklı intron ve ekzon bölgelerinde varyasyonlar bulunmuştur. Ayrıca, c.769.C>T bölgesindeki mutasyonun sebep olduğu p.Gln257Ter protein değişikliği için çeşitli biyoinformatik araçlar kullanılarak tahminlerde bulunulmuştur. Sonuçlar HUVS'nin genetik etiyolojisinin heterojen olduğunu ve AGBL3 geni mutasyonlarının HUVS ile ilişkili olabileceğini göstermektedir. Anahtar Kelimeler: HUVS, AGBL3, CCP3, AGBL3 Mutasyonu, Ürtikeryal Vaskülit Bu çalışma, İstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir. Proje No: 36201
Tekrarlayan gebelik kayıpları olan çiftlerde ilişkili tek gen mutasyonlarının araştırılması
Tekrarlayan gebelik kaybı öykülü (≥2) çiftlerde bilinen klasik faktörler için yapılan testlerle olguların yaklaşık %50'sinde etiyoloji saptanabilmektedir. Tez kapsamında kromozom anomalisi ve bilinen genetik/nongenetik faktörlerin dışlandığı ≥3 fetal kayıp öykülü kadınlarda 'tüm ekzom dizileme (TED)' yöntemi ile olası monogenik faktörlerin rolü araştırıldı. İlk aşamada, İÜ, İTF, Tıbbi Genetik AD'na başvuran 973 olguya ait dosya verileri retrospektif olarak değerlendirildi. İkinci aşamada tüm klasik testleri normal sonuçlanan çiftlerden 35 kadın seçilerek tüm ekzom dizi analizi için bilgilendirildi ve onamları alındı. TED ıslak laboratuvar çalışmaları hizmet alımı ile yapıldı. Farklı yolaklardaki varyantların analizi, konfirmasyon ve segregasyon çalışmaları laboratuvarımızda gerçekleştirildi. 34 olguda ilişkili olabilecek doksan üç varyant tespit edildi. İki olguda etiyoloji açıklanırken (%5,7), 18 olguda (%51,4) diğer aile bireylerinin de (eş, kız kardeş ve anne) davet edilerek segregasyon çalışmalarının genişletilmesi ve 10 olguda (%28,5) varyantların etkisinin aydınlatılabilmesi için fonksiyonel çalışmaların yapılması planlandı. Yedi olguda (%20) poligenik kalıtım öngörüldü. Bu çalışmada tespit edilen varyantlar, metabolizma (n=8), siliya aktivitesi (n=8) ve embriyogenez (n=7); hücre bölünmesi (n=5), oosit olgunlaşması ve gelişimi (n=6) ve fetomaternal iletişim gibi gebeliğin erken dönemlerinde aktif (n=8) yolaklardadır. Şu ana kadarki bilgimize göre bu çalışma, tekrarlayan gebelik kayıpları olan kadınlarda TED sonuçlarını paylaşan üçüncü uluslararası ve ilk ulusal seri çalışmasıdır.
Hücre dışı genom materyallerinin hematopoetik kök hücreler üzerindeki etkisi
Amaç: Bu tezin ana amacı HKH'leri(Hematopoetik kök hücreler) başarıyla transfekte etmek ve bunlarda oluşan hücresel fonksiyon değişimlerini saptamaktır. Tüm biyolojik sıvılarda buluna hücre dışı genom materyallerinin(hdGM), hücrelerden salınarak komşu ve distal hücrelere entegre olabildiği bilinmektedir. Onkogen taşımaları halinde, hdGMler normal hücreleri onkojenik olarak transformasyona uğratabilir ve sonuçta genometastaz gelişebilir. Hücreler arasındaki etkileşimindeki bu rolleri nedeniyle, bu çalışmada hdGMler transfeksiyon için kullanılmış ve HKH'lerin kanser kök hücrelerine farklılaşabildikleri gösterilmeye çalışılmıştır. Yöntem: Sağlıklı bireylerden kordon kanları toplanarak mononükleer hücre izolasyonu yapıldı. Ardından CD34+/- hücreler seçildi. HEL hücre hattı JAK2V617F nokta mutasyonunu biallelik taşıması nedeniyle, K562 hücre hattı ise BCR/ABL pozitif olması nedeniyle kullanıldı. CD34+/- hücreleri ise, bu kültürden elde edilen serumlar ile transfekte edildi. Bu transfekte hücrelerde gerçekleşen değişimleri saptamak amacıyla, progenitör hücre koloni deneyleri, apoptoz ve hücre proliferasyon deneyleri ve immünfenotipleme yapıldı. Bulgular: CD34+/- hücreleri HEL serumuyla 24 saat boyunca muamele edildiğinde JAK2V617F mutasyonunu monoallelik geliştiği, süre 48 saat olduğunda mutasyonun biallelik geliştiği saptandı. BCR/ABL1 taşıyan K562 hücrelerinden elde edilmiş serumla transfeksiyon sonrasında HKH'lerin BCR/ABL1 pozitifliğinin tüm örneklerde geliştiği (%100) belirlendi. Hematopoietik progenitor kolonilerinde transfekte HKH kolonilerinde, JAK2V617F mutasyonu %XX oranında gösterildi. Kolonilerde, BCR/ABL1 füzyon geni ise %XX oranında gösterildi. Transfeksiyon sonrasında yapılan hücre fonksiyon analizleriyle, apoptozda tutarlı değişiklik olmadığı, ancak HEL serumu uygulandığında STAT5 ekspresyonun arttığı, K562 serumu eklendiğinde ise CD45, CD16+56, CD14'de artış görüldü. Sonuç: Bulgularımız, hdGM'lerin taşıdıkları onkogenleri, salındıkları hücrelerden farklı hücrelere lateral olarak transfer edebildiği ve bu hücrelere onkojenik özellik kazandırarak hücrenin biyolojik özelliklerini değiştirebildiğine dair literatür bilgisini desteklemektedir. Bu çalışma ile ilk defa olarak, JAK2V617F mutasyonu ve BCR/ABL1 füzyon genlerinin HKH'lere hdGM aracılığıyla entegrasyonunun mümkün olduğunu gösterdik. Bu veriler, hdGM'lerin hücreler arası iletişimde rolü olduğunu ve genometastaza katkıda bulunduğunu göstermektedir.
Miyeloproliferatif neoplazi kökenli hücre dışı genomik materyallerin endotel hücrelere etkisinin incelenmesi
Miyeloproliferatif Neoplaziler (MPN) kan hücre oluşumunu etkileyen hematopoetik kök hücrelerin (HKH) sebep olduğu bir hastalık grubudur. Bu hastalık farklı HKH hatlarını etkileyebilir ve farklı alt gruplarda incelenebilir. MPN için en kritik mutasyonlar BCR-ABL1 ve JAK2V617F'dir. Bu mutasyon MPN hasta endotel hücreler (EH)'de tespit edilmiş ve hastalıkta sıklıkla görülen trombo-embolik olaylarda rolü olduğu düşünülmüştür. Ancak henüz oluş mekanizması tam bilinmemektedir. Genometastaz, bir onkogenin kanser hücresinden salınarak dolaşım yoluyla farklı bir bölgeye taşınması ve bu bölgede bulunan bir hücreye girmesiyle metastaza sebep olmasını temel almaktadır. Bu çalışma, EH'de tespit edilmiş mutasyonun genometastaz yoluyla oluştuğunu ve genometastaz sonrasında EH'de bir takım değişikliklere sebep olduğunu göstermeyi amaçlamaktadır. Bunun için ilk olarak biallelik JAK2V617F taşıyan insan eritrolösemi(HEL) ve BCR-ABL1 taşıyan K562 hücre hatlarından toplanan serumlardan DNA izolasyonu yapıldı ve hücrelere ait mutasyonlar tespit edildi. Ardından, insan umblikal ven EH(HUVEC) hattı, toplanan serumlar ile ayrı ayrı 48 saat süresince kültür edildi. Kültür sonucunda transfekte HUVEC hücreleri toplanarak DNA izolasyonu yapıldı ve EH'lerde JAK2V617F ve BCR-ABL1 mutasyonları tespit edildi. Mutant HUVEC'ler; apoptoz, proliferasyon ve trombotik olaylarda rolü olan EH yüzey proteinleri (CD106, CD141, CD146, CD309, CD54, CD31 ve CD142) açısından akım ölçerde incelendi. Mutant EH'lerde kontrole göre CD141 (Trombomodulin)'de azalma ve CD142 (Doku faktörü)'de artma istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0.05). Mutant HUVEC'ler çoğaltıldı ve pasajlanarak her iki mutasyonun hücre genomuna entegrasyonu tespit edildi. Sonuç olarak, literatürde ilk defa serumda bulunan JAK2V617F, EH genomuna entegre oldu ve EH'lerde fonksiyonel değişikliklere neden oldu. Bu çalışma ile genometastasın kanserogenezdeki önemine ışık tutulmuştur.
Osteosarkom tanılı hastalarda genetik ve kromozom değişimlerinin metastaz ile ilişkisinin incelenmesi
Osteosarkom (OS) primitif osteojenik mezenkimal hücrelerden köken alan primer kemik tümörüdür. OS'ler çoğunlukla kötü prognoz ve yüksek mortalite ile seyretmektedir. Metastaz varlığı, yüksek nüks oranı ve fiziksel hareket kısıtlılığı OS'nin önemli bulgularındandır. Tedavide esas kemoterapi olmasına rağmen, etkinliği yetersizdir. Metastatik OS (MOS) hastalarında ise, tedavi etkinliğinin düşük olmasının yanında prognoz da kötü seyretmektedir. Bu nedenle, OS ve MOS'daki moleküler mekanizmalarının aydınlatılarak farklı tedavi yaklaşımlarının belirlenmesi, hastaların klinik seyirlerinin iyileştirilmesinde oldukça önemlidir. Bu amaçla; siklin bağımlı kinaz inhibitörü 3 (CDKN3), sitokinezin protein düzenleyicisi 1 (PRC1), ribonükleotit redüktaz katalitik alt ünitesi M1 (RRM1), fibulin benzeri ekstrasellüler matriks protein-2 içeren epidermal büyüme faktörü (EFEMP2), ökaryotik translasyon başlatıcı faktör 4 gama 2 (EIF4G2) ve melanoma ilişkili antijen 3 (MAGEA3) genlerinin OS ve MOS olgularındaki gen ekspresyon seviyeleri incelendi. Rölatif ekspresyon seviyeleri karşılaştırıldığında PRC1 ve EFEMP2 gen ekspresyonlarındaki değişim istatistiksel olarak anlamlı bulundu (sırasıyla; p<0,0001 ve p=0,0008). PRC1'in rolünün daha iyi anlaşılması için olgularda protein seviyeleri immünohistokimya ile ve diğer yandan 15. kromozomun sayısal anomalileri ise fluoresan in situ hibridizasyonu metodu ile incelendi. MOS grubunda yüksek PRC1 protein ekspresyonu kısa sağkalım süresi ile ilişkilendirildi. Aynı zamanda, MOS grubunda 15. kromozomun kopya sayısı artışlarının anlamlı şekilde yükseldiği bulundu. Saos-2 hücre hattında in vitro RNA interferans deneyleriyle PRC1 baskılandığında, hücrelerde canlılığın azaldığı, G2/M fazında birikme olduğu ve apoptozun indüklendiği gösterildi. Sonuç olarak, PRC1'in klinikopatolojik ve özellikle metastaz ile olan ilişkisi nedeniyle hastalığın patogenezindeki rolü gösterilerek, prognostik bir belirteç olarak OS'nin tedavisinde yüksek potansiyel taşıdığı bulundu.
Miyelodisplastik Sendromda ve lösemilerde MİR-146A'nin TGF-β sinyal regülasyonundaki rolü ve 5q delesyonu ile i̇lişkisinin i̇ncelenmesi
Miyelodisplastik sendrom, verimsiz hematopoez nedeniyle displastik hücreler ve periferik kanda sitopeni ile karakterize, heterojen bir klonal hematopoetik kök hücre malinitesidir. Hastaların %30-50'sinde klonal kromozomal anomaliler gözlenmektedir. Bununla birlikte MDS ile ilişkilendirilen çok sayıda gen mutasyonu ve ifade düzeyi değişen miRNA tanımlanmıştır. Çalışmamıza dahil edilen hastalarda, sitogenetik ve moleküler bulgular arasında ilişki kurmak amacıyla MDS'de sık gözlenen 5q delesyonuna ve bu bölgeden kodlanan miR-146a/miR-145 ifadesine odaklanıldı. Hematopoezde baskılayıcı bir sitokin olan TGF-β sinyalizasyonunun alt yolağında görevli SMAD2 ile bahsedilen miRNA'lar arasındaki ilişki incelendi. MDS ön tanısı almış 24 hastanın kemik iliği aspirasyon materyaline ve 20 sağlıklı kontrol örneğine sitogenetik, FISH ve GZ-PZT yöntemleri uygulandı. Olguların %43,4'ünde klonal sitogenetik anomali saptandı, del(5q) anomalisi hem sitogenetik hem de FISH yöntemiyle birlikte değerlendirildi ancak olgularda istatistiksel olarak anlamlı delesyon bulgusuna rastlanmadı. Yapılan miRNA ifade analizi çalışması sonrasında tüm olgularda miR-146a ifadesinin azaldığı (p=0,0003), bununla birlikte olguların %41,6'sında SMAD2 ifadesinin arttığı belirlendi. miR-145 ve SMAD2 ifadelerinde istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde artış veya azalış gözlenmezken aralarındaki ilişkinin anlamlı olduğu tespit edildi (p=0,04). Olgu sayısınn arttırılması MDS'de hastalığın moleküler etiyopatogenezinin aydınlatılmasına yardımcı olabilir.
Multiminicore hastası ikiz kardeşin tüm ekzom dizileme verisinden hastalık etkeni varyantların tespiti, konfirmasyonu ve gen ekspresyonu çalışmaları
Multiminicore hastalığı (MmD), konjenital miyopati grubunda olup, nadir bir genetik hastalıktır. MmD'nin görülme sıklığı bilinmemektedir. Ancak, epidemiyolojik bir çalışmada, konjenital miyopati sıklığı, canlı doğumların %0.006'sı olarak belirtilmektedir. MmD'nin kalıtım modeli, sorumlu olduğu gen ve mutasyona göre değişebilmektedir. Hastalığın tanısı genellikle, klinik ve kas dokusundaki histopatolojik bulgularla konulmaktadır. Kas dokusunda histopatolojik incelemede, kas lifleri arasında; oksidatif aktivite azlığı ya da yokluğu, çok sayıda, küçük çaplı kor yapıları önem taşımaktadır. Hastalığın klinik bulguları değişkenlik gösterebilmektedir; ancak solunum bozukluğu, motor gelişim geriliği, kas zayıflığı ortak klinik bulgulardır. MmD hastalığının moleküler temeli, henüz tam olarak aydınlatılamamıştır. Bugüne kadar hastalığın fenotipi ile ilişkili RYR1, SEPN1, MYH7, TTN, MEGF10 ve ACADS genlerinde çeşitli genetik varyantlar belirlenmiştir. Bu çalışmada, akraba evliliği olan anne ve babanın, çoklu düşüklerinin ardından in vitro fertilizasyon ile dünyaya gelen, klinik ve histopatolojik bulgularla MmD hastalığı tanısı konulan ikiz çocuklarının, önceden yapılmış tüm ekzom dizileme sonuçlarının, analiz edilmesi ve hastalıkla ilişkili varyantların belirlenmesi amaçlandı. Tüm ekzom dizileme veri analizi sonucunda SEPN1 geninde daha önce MmD ile ilişkilendirilmiş bir varyant (c.817G>A/p.G273R) ilk defa ikiz çalışmasında belirlendi. ACMG standartlarına ve bilgisayar ortamındaki araçların değerlendirmelerine göre, bu varyant muhtemel patojenik etkili olarak bulundu. Belirlenen varyantın Sanger dizileme ile ebeveynlerde ve hasta çocuklarında doğrulaması yapıldı. Ayrıca aile üyeleri ve sağlıklı kontrollerin (n=3) lökositlerinde SEPN1 gen ekspresyon düzeyleri araştırıldı. Ekspresyon düzeylerinin (p= 0.1810, p<0.05) istatistiksel olarak anlamlı olmadığı belirlendi. Bu çalışma sonucunda SEPN1 geninde, MmD hastalığı için varyant belirlenmiş olup, bu bilgi ile aileye genetik danışma verilebilecektir. Ayrıca çalışmamız MmD hastalığının moleküler patogenezi ile ilgili çalışmalara katkıda bulunmaktadır.
Akut lösemi hastalarında "Zinc Finger Protein 384" (ZNF384) geni füzyonlarının tespiti
Akut lösemiler kemik iliği kaynaklı olgunlaşmamış kan yapıcı hücrelerin aşırı proliferasyonu sonucu oluşan hastalık grubudur. 2016 yılında Dünya sağlık örgütü akut lösemi sınıflandırmasına göre akut lösemiler akut lenfoblastik lösemi (ALL), akut miyeloid lösemi (AML) ve miks fenotip akut lösemi (MPAL) olarak üç sınıfa ayrılmaktadır. ALL, B hücreli prekürsör (BCP-ALL) veya daha az yaygın olarak, T hücreli prekürsör soy (T-ALL) şeklinde sınıflandırılmaktadır. Her ikisi de, tanı veya prognoz için yararlı belirteçler olan kromozomal değişikliklerle karakterizedir. ZNF384 geni yeniden düzenlemeleri, çocukluk çağı BCP-ALL vakalarının %1-6'sının ve yetişkin BCP-ALL vakalarının %5-15'inde görülen yeni onkojenik alt tiplerinden biridir. Ayrıca ZNF384 yeniden düzenlemeleri bulunan vakalarda MPAL özelliği gösteren anormal miyeloid belirteç ekspresyonu bulunmaktadır. Klinik etkisi ile ilgili sınırlı sayıda çalışma bulunmaktadır ve ZNF384 füzyonları taşıyan hastalar genel olarak orta risk grubuna sınıflandırılır. Bu füzyona sahip farklı fenotipte hastaların incelenmesi, yeni belirteçlerin klinik etkilerini anlamamıza yardımcı olacaktır. Bu çalışmada BCP-ALL ve MPAL hastalarında ZNF384 ile ilgili füzyon genlerin sıklığı belirlenerek sonuçların klinik açıdan değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Çalışmaya, ALL ön tanısı almış toplam n=127 (K:53, E:74) pediatrik hasta (medyan yaş 4 olan) dahil edilmiştir. Hastaların kan ve/veya kemik iliği örneklerinden total RNA elde edilmiştir ve RNA'lar, rastgele heksamerler ve MMLV ters transkriptaz enzimi kullanılarak komplementer DNA'ya (cDNA) çevrilmiştir. Dört farklı kırılma noktası içeren en yaygın füzyonlar (ZNF384-TCF3, ZNF384-EP300 ve ZNF384-TAF15), ters transkriptaz PZR yöntemi kullanılarak varlığı/yokluğu araştırılmıştır. Saptanan translokasyonlar ile hastaların klinik bulguları ile olan ilişkisi araştırılmıştır. Pediatrik ALL hastalarında ZNF384 geninin yeniden düzenlenmesi %7,8 olarak bulunmuştur. ZNF384 füzyonları MPAL'de %8,3 ve BCP-ALL gruplarında ise %7,7 olarak belirlenmiştir. TCF3- ZNF384 füzyonunda beklenilen kırık bölgesi dışında farklı bir noktada yeni bir kırılma noktası tanımlanmıştır.
Valproik asit ile indüklenen PANC-1 hücrelerinde WNT sinyal yolağının incelenmesi
Pankreas duktal adenokarsinoma (PDAK), tüm dünyada 5 yıllık sağ kalım oranı %8'in altında gözlemlenen en agresif kanser türlerinden biri olarak tanımlanmaktadır. Hastalığın çoğu bireyde sergilediği agresif tümör davranışı ile konvansiyonel tedaviye direnç göstermesi ve erken tanıya uyumlu belirteçlerden yoksun olması, güncel etkin tedavi yaklaşımlarını uygun hastalarda cerrahi müdahale ile kısıtlamaktadır. Bu nedenle, hastalığın tedavisinde yeni stratejilerin geliştirilmesine yönelik çalışmalar, tüm dünyada önem kazanmıştır. Bu doğrultuda yapılan çalışmalar, duktal pankreas kanser modellemeleri aşamasında PANC-1 hücrelerini kullanmıştır ve bu hücrelerde VPA'nın apoptozu indüklediğini göstermiştir. Çalışmamızda, PANC-1 hücrelerine uygulanan VPA'nın, hücre proliferasyonunu %50 baskıladığı konsantrasyonu gösteren IC50 değerinin CFSE boyama yöntemi ile hesaplanmıştır. Bunu takiben Annexin V/PI boyası ile yapılan apoptoz ölçümü ile bulunan IC50 değeri desteklenmiştir. Daha sonra, IC50 değeri olarak tespit edilen VPA dozuna maruz kalmış PANC-1 hücrelerindeki Wnt/Beta katenin sinyal yolağı ana komponentlerinden olan LEF1, AXIN1, CCND1 ve CTNNB1 genlerinin anlatım düzeyleri kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (kRT-PZR) metodu kullanılarak ve 2-ΔΔCT analiz yöntemi incelenmiştir. 48. saatte elde edilen proliferasyon analizleri sonucunda IC50 değeri, 2,5 mM olarak hesaplanmıştır. Apoptoz ölçümleri sonucunda, 2,5 mM'lık VPA dozuna maruz kalan hücrelerde erken apoptozun belirginleştiği tespit edilerek, bulunan IC50 değerinin etkinliği onaylanmıştır. VPA uygulanması sonucu AXIN1 ve CTNNB1 genlerinin anlatım düzeylerinde anlamlı bir fark gözlemlenmemiştir. CCND1 ve LEF1 genlerinde ise anlatım düzeylerinin anlamlı bir şekilde arttığı gözlemlenmiştir. Bu bulgular ile ilk kez IC50 değerinin, CFSE ve annexin V/PI metotlarının birleştirilmesiyle hesaplanabileceği gösterilmiştir. Ayrıca VPA'nın kanser hücrelerindeki bölünmeyi durdurarak apoptozu indüklediği teyit edilmiştir.
Hematopoetik ve kanser kök hücrelerin hipoksik koşullardaki fonksiyonel ve genomik yanıtları
Amaç: Miyeloproliferatif Neoplazi (MPN), miyeloid seri hücrelerinde somatik mutasyonlar nedenli artmış proliferasyon ile karakterize bir kök hücre hastalığıdır. Polisitemia vera, Esansiyel trombositemi ve Primer Miyelofibroz klasik MPN alt tipleridir. Bu araştırma ile MPN'deki miyeloproliferatif bozukluğa kemik iliği mikro çevresinin hipoksik koşulları (~%1 pO2) kaynaklı HIF1α ve NOS3 gen anlatımındaki bir değişimin yol açıp açmadığının gösterilmesi amaçlanmaktadır. Yöntem: Kemik iliği mikroçevre koşulları oksijen basıncına sahip hücre kültürü ortamında CellASIC ONIX cihazı kullanılarak farklı oksijen basıncı değerleri (%0, %1, %20) 16 MPN tanılı hastaya ve kontrol olarak 2 kordon kanına (KK) ait Hematopoetik ve Kanser Kök Hücrelerin (HKH-KaKH) CD34+ ve CD34- alt gruplarına uygulanmıştır. 24 saatlik hücre kültürü sonrası RNA izolasyonu ve cDNA sentezi gerçekleştirilmiştir. Kantitatif Gerçek Zamanlı PZR tekniği ile gen ifadelerindeki değişimler ve fonksiyonel test olarak da hipoksik koşullara KaKH ve KK'nın apoptoza yanıtı incelenmiştir. Bulgular: MPN hastalarına ait KH'lerin CD34+ alt grubundan CD34- gruplarına kıyasla daha yüksek konsantrasyonlu RNA örnekleri izole edildi. HIF1α ve NOS3 gen anlatımları MPN alt grupları arasında farklılık göstermekte olup kontrol grubu hücrelerine göre artış göstermiştir. JAK2V617F heterozigot (monoalelik) ve yabanıl tip alel taşıyan hücreler arasındaki farklılıklar anlamlı değildir. MPN türü tespit edilememiş grupta hipoksik koşullarda JAK2V617F heterozigot (monoalelik) olguda NOS3 anlatımı kontrole göre azalmış olarak bulunmuştur. Sonuç: Kemik iliği mikro çevresi veya kök hücre nişi, hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin fonksiyonunu destekleyen kompleks bir sistemdir. Yapılan çalışma ile kanser tipine göre KaKH'nın hipoksi ve anoksiye yanıtlarının değerlendirilmesi gerektiği görülmüştür. MPN genotipi ve hipoksiye yanıtı hastalık tipine göre değerlendirilmelidir. Bu konuda daha kapsamlı çalışmalara ihtiyaç olduğu açıktır.
Alzheimer hastalığında rolü olduğu düşünülen aday gen(ler)in fonksiyonel analizi
Ferroptoz yeni keşfedilen ve lipid peroksitleriyle tetiklenen demire bağımlı bir hücre ölümü şeklidir. Ferroptozun düzenlenmesi için birçok yolak ve ilgili gen tanımlanmıştır. Bu genlerden bazıları çeşitli hastalık patogenezleriyle ilişkilendirilmiştir. Alzheimer hastalığı (AH) son yıllarda dünyada prevelansı büyük oranda artan, demansla kendini gösteren nörodejeneratif bir hastalıktır. AH patogenezinde görülen hücre ölümlerinin mekanizması tam olarak çözülememiştir. Bu çalışmada HEPG2 hücre hattında ferroptoz indükleyicisi olan erastin ve inhibitörü olan ferrostatin-1 ile yapay ferroptoz ortamı oluşturulmuştur. Ferroptozun doğrulanması için hemositometre ile hücre sayımı ve akım sitometri deneyleri yapılmıştır. Hücre kültüründe ferroptozun başarılı bir şekilde oluşturulmasından sonra ferroptozla ilişkili olduğu bilinen GPX4, SLC7A11, ACSL4 ve HMOX-1 genlerinin yanısıra AH ile ilgili BNIP3L, TM2D1, RAD21 genlerinin HEPG2 hücre hattında nasıl etkilendiği kantitatif GZ-PZR (qPZR) ile incelenmiştir. Aynı zamanda ferroptoz ile ilişkili genlerin (GPX4 ve SLC7A11) anlatım düzeylerindeki değişimler 25 Alzheimer hastası ve 21 kontrolde kantitatif GZ-PZR ile değerlendirilmiştir. Bu kapsamda hücre kültüründen elde edilen örneklerle yapılan qPZR sonuçlarına göre erastin eklenen koşulda negatif koşula göre göre RAD21 ve GPX4 gen ifadelerinde azalma görülürken SLC7A11, BNIP3L ve HMOX-1 gen ifadelerinde artış görülmüştür. Ancak erastin ve ferrostatin-1'in birlikte eklendiği koşulda ilgili gen ifadelerinin etkilenmediği gözlenmiştir. Ferroptozla ilişkili genlerin hasta gruplarında yapılan qRZR sonucunda ise anlamlı bir değişim olmadığı belirlenmiştir. Sonuç olarak, in vitro deney şartlarında erastin ve ferrostatin-1 ile hücre kültüründe başarılı bir şekilde ferroptoz oluşturulmuştur. Ancak ilgili gen ifadelerinde anlamlı bir değişim gözlenmemiştir. Anahtar Kelimeler: ferroptoz, erastin, ferrostatin-1, Alzheimer hastalığı, hücre ölümü
Koroner arter hastalığında rolü olduğu düşünülen aday gen(ler)in fonksiyonel analizi
Kalbe besin ve oksijen taşıyan arterlerde aterosklerotik plak oluşumuyla karakterize olan koroner arter hastalığı hem ülkemizde hem de dünyada en önemli halk sağlığı sorunlarından biridir. Ateroskleroz çoğunlukla önlenebilir bir hastalık olduğundan temelinde yatan mekanizmaların ve dolayısıyla risk faktörlerinin aydınlatılması büyük önem taşımaktadır. Yeni tanımlanan bir programlı hücre ölüm şekli olan ferroptozun temel etmenlerinden olan aşırı demir yükü ile artan lipid peroksitler ve doku hasarının ateroskleroz ve diyabete yol açabileceği düşünülmektedir. Bu nedenle bu tez projesi kapsamında, ferroptoz ile hücre ölümünün ve koroner arter hastalığının oluşumunda rol oynayan mekanizmaların araştırılması amaçlanmış ve bunun için RTN3, CAT, SLC25A1, HMOX-1, GPX4, ACSL4 ve SLC7A11 genleri seçilerek bu mekanizmalardaki rolleri incelenmiştir. Bu tez çalışmasında, in vitro ortamda HEPG2 hücrelerinde ferroptoz hücre ölüm mekanizması, belirlenen en uygun konsantrasyonda erastin ile indüklenmiş ve ferrostatin-1 ile inhibe edilmiştir. İndüklemenin yapıldığı koşullar ile birlikte, indükleyici ve inhibitörün bir arada bulunduğu koşullarda da hücre canlılık oranları ve aday genlerin anlatım düzeylerindeki değişimler incelenmiştir. HEPG2 hücrelerinde çalışılan koşullarda, kantitatif gerçek zamanlı PZR ile anlatımları incelenen genlerden, RTN3, CAT, SLC25A1 ve GPX4 ifadelerinin azaldığı gözlemlenirken, HMOX-1 ve SLC7A11 gen anlatımları artmış ve ACLS4 anlatımı değişmemiştir. Koroner arter hastası ve hasta olmayan bireyler arasında aday gen anlatımları incelendiğinde ise RTN3, CAT ve SLC25A1 ifadelerinin anlamlı olarak değiştiği gözlemlenmiştir. Erastin ile ferroptotik hücre ölümünün indüklenmesinin ardından seçilen genlerin anlatımlarında görülen değişimler, bu genlerin ferroptoz mekanizması için önemli adaylar olabileceğini göstermektedir. Ateroskleroz patogenezinde ferroptozun etkisinin araştırılmasını amaçlayan bu çalışma ile mekanizmalarda rol oynuyor olabilecek yeni hedefler belirlenmiştir.
Behçet hastalığı-genom analiz çalışmasında belirlenen IL23r-IL12RB2 bölgesindeki varyantın (RS924080), IL23R ve IL12rb2 genlerinin ekspresyonları ile ilişkisinin araştırılması.
Behçet hastalığı (BH), etiyolojisi bilinmeyen, tekrarlayan inflamatuar ataklar ile seyreden, artmış sitokin cevabına neden olan inflamatuar bir hastalıktır. 2010 yılında Remmers ve arkadaşlarının Türk toplumundaki Behçet hastalarında yürüttüğü GWAS çalışmasının sonuçlarına göre; IL23R-IL12RB2 lokusunda rs924080 SNP'leri BH ile ilişkili varyantlar olarak tespit edilmiştir (P <0.0001) ve Xavier ve arkadaşları tarafından 2012'de bir diğer çalışma ile konfirme edilmiştir. Bu tez projesinde Behçet Hastalığı-genom analiz çalışmasında belirlenen A risk alleli için Heterozigot (AG) (n=6) ve homozigot (AA) (n=4) taşıyan ve bu varyanta sahip olmayan sağlıklı kişilerin (GG) (n=4), IL23R-IL12RB2'nin intergenik bölgesinde yer alan varyantın (rs924080) artmış proinflamatuar cevaplarla ilgisi araştırılmıştır. Bu kişilerin periferik kanlarından elde edilen mononükleer hücrelerden hem hücre kültürü öncesi hem de hücre kültüründe IL23R ve IL12RB2 ekspresyonları için uyarıldıktan sonra RNA'ları elde edilmiş ve cDNA'ya çevrilmiştir. Real Time PZR ile IL-12RB2 ve IL-23R genlerin rölatif ekspresyonları araştırılmıştır. Her örnek Gliseraldehid-3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH) referans geni ile karşılaştırılmıştır. Data analizi Ct metodu ile yapılmış olup, rölatif mRNA seviyeleri, az sayıdaki örnek grupları nedeniyle non-parametrik Kruskal-Wallis testi kullanılarak hesaplanmıştır. Bu çalışmada ilk kez BH ile ilişkili varyant olarak tespit edilen IL23R-IL12RB2 lokusundaki rs924080 tek nükleotid polimorfizminin, IL23R veIL12RB2 genlerine etkisi incelenmiştir. Bu yanıtlarda önemli olmasından dolayı, hastalık risk allelini taşıyan kişilerin (A), AA ve AG gruplarının IL-23R stimulasyon endeksleri GG grubuna göre anlamlı olarak yüksek bulunmuştur (p=0.042). Bu sonuçlara dayanarak, Risk A alleli, LPS ile uyarı sonucunda IL-12RB2, IL-23R, IFN- and TNF-'nın bazal ekspresyonunu etkilemiyor fakat IL-23R and TNF-'nın ekspresyon kapasitesini arttırarak yanıta neden oluyor ve baseline IL-6 üretimini arttırıyor. LPS stimulasyon sonuçlarına dayanarak, rs924080 A alleline sahip bireylerin bakteriyel patojenlere aşırı ve abartı inflamatuar yanıtlar veriyor olmaları da BH gelişimine destek oluyor diyebiliriz. Sonuçlarımız rs924080 lokusunun Th 17 ve IL-6 cevaplarında modulator bir yeri olduğunu göstermektedir.
Yarık el/ayak yapısal bozukluğunun genomik teknikler ve biyoenformatik yaklaşımlar ile incelenmesi
Yarık el/ayak bozukluğu, gelişim sırasında el ve ayaklardaki orta parmakların eksikliği ile meydana gelen nadir genetik bir bozukluktur. Akraba evliliği oranının yüksek olduğu bölgelerde Mendelyen otozomal resesif (OR) kalıtım modeline göre kalıtılan hastalıkların görülme sıklığının artmasına sebep olmaktadır. Yeni nesil dizileme ve dizilim teknolojileri ile OR kalıtım gösteren birçok genetik hastalığın altında yatan gen ve bölge belirlenebilmiştir. Tez kapsamında OR kalıtım modeline uygun 4 aileye mensup toplam 41 birey incelenmiştir. Ailelerde SNP dizilimi, homozigot haritalama, bağlantı analizi ve ekzom dizileme yöntemlerinin farklı kombinasyonları kullanılarak ilişkili aday varyantların tespiti amaçlanmıştır. MA134 ailesinde daha önce hastalık ile ilişkilendirilmiş WNT10B geninde NM_003394.4::c.994C>G:p.Arg332Gly patojenik varyantı belirlenmiştir. MA136 ailesinde yine WNT10B geninde NM_003394.4:c.343C>T:p.Arg115Ter patojenik varyantı belirlenmiştir. MA154 ailesinde kromozom 10q24 bölgesinde kopya sayısı varyasyonu açısından tek kopya bir patojenik artış tespit edilmiştir. MA135 ailesinde yapılan çalışmalar sonucu patojenik bir varyant ya da bölge tespit edilememiştir. Çalışma kapsamında yukarıdaki 4 ailenin analizinin yanı sıra yeni nesil dizileme veri analizlerinin basamak basamak yapılandırarak akış hattı oluşturan ve ham veri analizleri sonrası elde edilen VCF formatının nitelendirilmesini, filtrelenmesini ve aile içi analizlerin yapılmasını sağlayan iki yazılım geliştirilmiştir. Bağlantılar: https://pypi.org/project/seq-pigeon/ ve https://pypi.org/project/seq-dove/ Anahtar Kelimeler : Yarık El/Ayak Yapısal Malformasyonu, Gelişim Genetiği, Biyoenformatik, Yeni Nesil Dizileme, SNP dizilimi, WNT10B
Progresif miyoklonik epilepsilerde tüm ekzom dizileme yöntemi ile ilişkili genlerinin araştırılması
Progresif Miyoklonus Epilepsisi (PME) aksiyon ile tetiklenen miyoklonus, tonik-klonik nöbetler ve ilerleyici nörolojik bulgular ile kendini gösteren genellikle resesif geçişli bir hastalık grubudur. PME alt grupları arasında ayırıcı tanıyı koymak güçtür, çünkü çoğu PME türü klinik olarak benzer özelliklere sahip olsalar bile genetik olarak heterojendirler. Hastaların bilişsel işleyişleri değerlendirildiğinde PME'ler klinik olarak iki ana grupta incelenebilir. Bilişsel işleyişin normal seyrettiği PME'ler arasında Unverricht-Lundborg Hastalığı (ULH) ve Aksiyon miyoklonus-renal yetmezlik sendromu sayılabilir. Lafora Hastalığı (LH) ve Nöronal Seroid Lipofusinoz (CLN) gibi PME alt gruplarında ise hastalık bilişsel işleyişte zayıflama ile seyreder. Çalışmamızın amacı klinik olarak örtüşen özelliklere sahip PME hasta grubunu yüksek çıktılı yöntemlerle inceleyerek bu hastalarda moleküler altyapıyı aydınlatmak, yeni PME genleri bulmak ve bu pilot çalışma ile ülkemize özgü bir PME genetik profili çıkarılmasına katkı sağlamaktır. PME nadir bir hastalık olduğundan ötürü proje çıktılarımız nadir hastalık araştırmaları ile de örtüşmektedir. Çalışmamızda, PME ön tanısı almış 18 farklı aileden 21 hastada hastalıkta genetik analizler gerçekleştirilmiş ve hastalığın kaynağı olan genler araştırılmıştır. Bu kapsamda kademeli bir analiz strateji tercih edilmiştir: (i) PME'nin nispeten yaygın bir sebebi olan Lafora Hastalığı ile ilgili EPM2A ve NHLRC1 genlerinin Sanger dizileme yöntemi ile incelenmesi (ii) hem bilinen hem de yeni PME genlerinin kolektif olarak araştırılması için tüm ekzom dizileme yapılması. Bu çalışmada hedefe yönelik veya yüksek çıktılı yöntemler ile PME hasta grubundaki yoğun genetik heterojenliğin hastalara özgü bireysel sonuçlar verecek şekilde analizini planladık. Çalışma sonucunda, farklı alt gruplar ile ilişkilendirilmiş EMP2A, NHLRC1, SCARB2 ve KCTD7 genlerinde hastalık ile ilişkilendirilebilecek varyantlar tespit edilmiş ve tek bir kişide hastalıkla ilişkili olabilecek bir gende varyantlar tespit edilmiştir. Dört hastada ise hastalık ile ilişkili veya ilişkili olabilecek bir varyant tespit edilememiş, aday genler belirlenmiştir.
Diyete bağlı endotel hasarı oluşturulan ratlarda rankL/OPG sinyal yolağı aktiviteleri
Endotel hasarı ateroskleroz ve diyabet gibi pek çok hastalığın başlangıç patolojilerinden biridir. Enflamatuvar bir süreç olan endotel hasarının gelişiminde, Nükleer Faktör κB (NF-κB) sinyal yolağı ve bu yolaktaki moleküller önemli rol oynamaktadır. Reseptör Aktivatör NF-κB Ligandı (RANKL) ve onun reseptörü (RANK) ile osteoprotegerin (OPG), endotelde tanımlanan hasar sonucu oluşan kalsifikasyonun belirleyici molekülleridir. Deneysel çalışmalarda OPG/RANK/RANKL yolağının inflamasyon, vasküler ve kemik sistemi yanısıra glikoz homeostazının düzenlenmesinde de rol oynadığı, OPG ve Tip 2 Diabetes Mellitus arasında güçlü bir ilişki olduğu belirlenmiştir. Transgenik fare çalışmaları ile aterosklerozda plazma RANKL ve OPG düzeyleri gösterilse de vasküler hastalıklardaki rolleri henüz tam olarak bilinmemektedir. Bu tez çalışmasında, ateroskleroz gelişiminin ilk basamağı olan endotel hasarında, OPG/RANKL sinyal yolağının rolü ve Vitamin D tedavisi ile bu yolakta rol alan genlerin ifade düzeylerindeki değişimlerin belirlenmesi amaçlandı. Bu nedenle, Sprague Dawley erkek ratlarda oluşturulan Tip 2 Diyabet Mellitus (T2DM) Modeli kullanılarak OPG/RANKL yolağındaki aktivitelerin endotel hasarı üzerine etkisi araştırıldı. Endotelyal hasara bağımlı mikrovasküler etkileri belirlemek için, damardaki kalsifikasyon ve enflamatuvar süreçlerde rol alan Opg, Rankl, Runx2, Bmp-2, Il-1ß, Tnfα, Nos3, Icam-1 gen ifade seviyeleri değerlendirildi. Buna göre diyabetli sıçanlarda diğer deney gruplarına kıyasla Opg, Il-1ß, Bmp-2 mRNA ifade seviyeleri ile endotel hasarı belirteci olarak seçilen Icam-1 gen ifade seviyesinin diyabetli sıçan grubunda arttığı belirlendi. Ayrıca çalışma kapsamında, OPG/RANKL yolağındaki düzenleyicilerden biri olan vitamin D3 uygulamasının diyabet varlığında yolakla ilişkili genler üzerine etkisi araştırıldı. Vitamin D3 uygulanan diyabetli sıçanlarda 4 hafta sonunda kan şekeri düzeylerinde anlamlı bir azalma olduğu (p<0,01) deney sonunda ise diyabet grubunda diğer gruplara kıyasla çok anlamlı bir artış olduğu tespit edildi (p<0,001). Diyabetli sıçanların aort dokusunda, vitamin D3 uygulaması sonucunda Opg ve Il-1ß mRNA ifade seviyelerinde anlamlı bir azalma gözlemlendi. Sonuç olarak çalışma bulguları, vitamin D3 takviyesinin diyabet varlığında endotel dokuyu olumlu yönde etkilediğini ve OPG'nin vasküler homeostaza aracılık eden sitokinlerin düzenlenmesinde rol oynadığını destekler niteliktedir.
Osteogenezis imperfekta hastalarında yeni nesil dizileme teknolojisi ile ilişkili genlerin taranması ve bilinmeyen genlerin araştırılması
Osteogenezis imperfekta (Oİ) tekrarlayan kemik kırıkları ile karakterize kemiğin sık görülen kalıtsal hastalığıdır. Klinik ve genetik olarak oldukça heterojendir. Tip-1 kollajeni kodlayan genlerdeki heterozigot mutasyonlar sonucu oluşan klasik dört tipin yanı sıra, son yıllarda çoğunluğu otozomal resesif olarak kalıtılan yeni tipleri tanımlanmıştır. Bu çalışmanın amacı Oİ hastalarında yeni nesil dizileme teknolojisi ile COL1A1/COL1A2 ve otozomal resesif genlerin incelenmesi ve bilinmeyen genlerin tüm ekzom dizileme (TED) yöntemi ile araştırılmasıdır. Oİ tanılı 79 hasta çalışmamıza dahil edildi. Hastalarımızın 47'si erkek ve 32'si kadın idi. Öncelikle COL1A1/COL1A2 genleri dizilendi ve COL1A1 genindeki del/dup'lar MLPA yöntemleri ile incelendi. Oİ ile ilişkili genlere özgün tasarlanmış bir Panel-gen analizi yapıldı. Biyoinformatik analizler sonucunda hastalıkla ilişkilendirilen değişiklikler ve segregasyon analizleri sanger yöntemi ile konfirme edildi. Hastalığa neden olan gen bulunamayan 10 hastada TED yapıldı. Akraba evliliği ailelerin %40,5'inde mevcuttu. Hastaların %57'de COL1A1/COL1A2 genlerinde heterozigot mutasyon, %22,8'inde otozomal resesif kalıtımla ilişkili genlerde (P3H1, FKBP10, CRTAP, SPARC, SERPINF1) biallelik homozigot mutasyon bulundu, %20,2'sinde ise mutasyon bulunamadı. COL1A1/COL1A2 genlerde mutasyon oranı (%75.5'i COL1A1, %24.5'i COL1A2) literatüre göre düşüktü. Bunun nedeni otozomal resesif tiplerin daha fazla olmasıydı. COL1A1/COL1A2 genlerinde bilinen mutasyon oranı %71, yeni mutasyon oranı %29 idi. Bu genlerdeki protein sentezini durduran mutasyonların (%18) hafif fenotipe (tip 1), glisin serin dönüştüren missense mutasyonların (%20) ağır fenotipe yol açtığı gözlendi. Otozomal resesif kalıtım gösteren hastalarda ise orta/ağır klinik mevcuttu. Bu çalışma sonucunda ülkemizde Oİ'ya neden olan genlerin sıklığının, mutasyon tiplerinin ve fenotiple ilişkisinin belirlenmesi, hastalığa özgü genetik tanı algoritmasının oluşturulabilmesinde ve hastalara doğru genetik danışma verilmesinde önemli katkılar sağlamıştır.
Mikrosefalinin eşlik ettiği zihinsel yetmezlik hastalarında ilişkili gen varyantlarının araştırılması
Nadir nörogelişimsel hastalık grubunun önemli bir bileşeni olan sendromik zihinsel yetmezliğe sıkça, mikrosefali bulgusu da eşlik eder. Mikrosefali ve azalan beyin hacmine bağlı bilişsel ve iletişimsel kısıtlılığın yanı sıra gelişim geriliği, hipotoni ve çeşitli dismorfik bozukluklar gibi ek fenotipik özellikler de bu vakalarda gözlemlenmektedir. Zika virüsünün son yıllarda artan görülme sıklığı, dikkati aslında yüzlerce farklı sendromda yer alan primer mikrosefaliye çekmiştir. Bu olguların yarısından fazlası genetik tanıdan yoksundur. Son derece genetik ve klinik heterojenite gösteren hastalıklarda Sanger gibi klasik dizileme yöntemleriyle hastalık ilişkili varyant tespiti mümkün olamayabilir. Yeni nesil dizileme yöntemlerinden biri olan WES, bu tür hastalıklarda yüksek çıktılı veri analiziyle tüm kalıtım modellerinde patojenik varyant keşfini kolaylaştıran güncel bir tekniktir. Ebeveyn akrabalığının ülkemiz gibi yaygın olduğu toplumlarda özellikle resesif etkili genlere bağlı doğumsal anomalilerin görülme riski yükselir. Bu tez çalışmasında akraba veya aynı yöre evliliği bulunan ailelerden toplam 9 sayıda mikrosefali tanısını prenatal veya doğum sırasında almış hastalarla tüm genom genotipledirme ve WES tekniğiyle özellikle nadir ve resesif patojenik değişikliklerin tespiti hedeflenmiştir. Diğer bir hedef de de novo değişimler olmuştur. Çalışmanın neticesinde iki bağımsız ailede MCPH2 ilişkili yeni ve fonksiyon kaybı yaratan WDR62 patojenik varyasyonu tespit edilmiştir. Sonuçlarımız bu varyasyonun ortak bir kurucu ata kaynaklığı olduğunu düşündürmektedir. Farklı bir hastada, literatürde SPG50'yle bildirilmiş bilinen varyant bulunmuştur. İki farklı ailede ise SOX11 ve TRIO genlerinde de novo ve yeni mutasyonlar tespit edilmiştir. Tüm hastalar mikrosefali, ZY, hipotoni ve gelişim geriliği çekirdek fenotipine sahip olup sözü edilen genlerin primer mikrosefali patogenezindeki rolleri dikkat çekmektedir.Bu genlerin hücre bölünmesi, NPC farklılaşmasında rolleri vardır. Ayrıca çalışmamız akraba evliliğine bağlı ailelerde heterozigot ve de novo değişimlerin de göz ardı edilmemesi gerektiğine önemli bir kanıttır.
Kemik biyolojisinde rol oynayan genlerdeki varyasyonların osteoporoz hastalığında kemik kütlesi ve kemik mineral yoğunluğu üzerine etkisi
Osteoporoz, kemik kütlesinde düşüklük ve yapısal bozukluklar ile karakterize, kemiklerde kırık oluşma riskini arttıran bir iskelet hastalığıdır. Çevresel risk faktörlerinin yanında genetik faktörler de kemik yapım ve yıkımı arasındaki dengeyi bozarak hastalık oluşturabilmektedir. Kemik biyolojisinde rol oynayan genler ve bu genlerdeki varyasyonların araştırılması bu genetik farklılıkların hastalığın patogenezindeki yerinin keşfi için önem taşımaktadır. 105 hasta ve 29 sağlıklı gönüllünün genetik profillerinin hastalık ve ilişkili parametrelerle ilişkilerinin incelendiği çalışmamızda ''IL-1α'' ''rs1800587'', ''IL-1β'' ''rs16944'', ''CYP1a1'' '' rs1799814'', ''RANK'' ''rs35211496'', ''VDR'' ''rs2228570'', ''LRP5'' ''rs4988321'' varyasyonları incelenmiştir. Varyasyonlar ''PCR-RFLP'' yöntemi ile çalışılmıştır. İstatistiksel analizler sonucunda ileri yaş hastalığı olarak görülen ve halk arasında boy kısalması ile ilişkilendirilen osteoporoz hastalığında boy değişkenlerinde hasta ve kontrol grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmamıştır. Hasta grubunun kontrol grubuna göre daha düşük kiloya sahip olduğu bulunmuştur. Serum D-vitamini miktarı hasta grubunda kontrol grubuna göre yüksek bulunmuştur. Bu sonucun hastaların almış olabileceği muhtemel D vitamini tedavilerinden kaynaklandığı düşünülmektedir. Kalsiyum ve kalsitonin miktarları açısından iki grup arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmamıştır. Kemik sağlığı üstüne negatif etkileri olduğu düşünülen sigara, alkol kullanımı ve D vitamini üretimi ile ilişkilendirilmiş günlük güneş alımı açısından değerlendirilen deneklerde bu parametreler ile osteoporoz hastalığı ve femur, trokanter, lomber, ward, total kalça bölgelerindeki kemik mineral yoğunluğu arasında anlamlı bir ilişki gözlenmemiştir. Çalışmamızda D vitamini reseptör geni ''VDR'de'' bulunan ''rs2228570'' numaralı polimorfizmi ile hastalık arasında ilişki saptanmıştır. Bu polimorfizmde C allelinin hastalık riskini arttırdığı sonucuna ulaşılmıştır. Diğer polimorfizmler ile çalışılan kemik bölgelerinde kemik mineral yoğunlukları arasında bir ilişki gözlemlenmemiştir.
Katı hal fermantasyonu ve proses koşullarının optimizasyonu yoluyla gıda endüstrisi için enzimlerin üretimi
Enzymes are biocatalysts, accelerating biochemical reactions in vivo or in vitro, with a wide range of applications in different industries like food, feed, detergent, paper, and pharmaceuticals. Aspartic protease, an acid protease, and Transglutaminase are important enzymes for the food industry, like milk, meat, brewery, and wine industries. Limited GRAS native strain and low extracellularly produced APase and TGase, makes the research for recombinant alternatives imperative. Pichia pastoris a well-known yeast host for heterologous protein production is a good alternative for recombinant expression of these enzymes. Once the production host is selected, the determination of fermentation steps is the key in enzyme production. Solid-state fermentation (SSF), which is performed in the nearabsence of free water is considered to be a cheap and simple process with high protein titers. Despite being a promising process option, SSF presents several challenges, primarily because of its heterologous nature, e.g., maintaining fermentation temperature and pH constant, enhancing oxygen consumption, and homogeneous nutrient distribution. Addressing these challenges constitutes the main theme of this thesis. This thesis covers molecular work, optimization of production via SSF of the two target enzymes, and application of these in various food processes. The molecular work covers the design, de novo synthesis and cloning, and construction of methanol inducible system with P. pastoris as host. Once the host is obtained, a series of submerged (SmF) and solid-state fermentation (SSF) were conducted to comparatively analyze growth and production yields as well as oxygen consumption and methanol evaporation rates. To find optimum conditions, SSF in a modified reactor with forced aeration and forced stirring were performed. The produced enzyme is tested in the different food products. SSF process is verified to be promising conditions for recombinant enzyme production, during which high cell density are reached. A higher oxygen uptake rate was proved by results compared with SmF. Both recombinant enzymes were successfully expressed when the complex medium was used. While, when the defined medium was used the production was in good titer only in the SSF process.
Primer immün yetmezlik hastalarında TREC/KREC analizi ile T ve B hücre gelişimi kontrolü
Primer immün yetmezlik (PİY); bağışıklık sisteminin işlevini bozan nadir genetik bir hastalık grubudur. Ülkemizde akraba evlilikleri oranının yüksek olması nedeni ile Avrupa ülkelerine oranla beklenenden daha sık karşılaşılan klinik bir durumdur. T ve B hücre gelişiminin PİY tanısı açısından incelenmesi önem teşkil etmektedir. T ve B hücre gelişimi somatik rekombinasyonları esnasında oluşan 'TREC' (T cell reseptör excision circle ) ve 'KREC' (kappa-deleting excision circle) T ve B hücrelerinin halkasal DNA parçalarıdır. Bu yüzden PİY için T ve B hücre gelişimini anlamada biyobelirteç olarak kullanabilirler. Bu tez çalışmasında 57 pediatik, 29 yetişkin PİY hastalarında T ve B hücre gelişiminin incelenmesi için hastalardan alınan kandan gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PZR) ile yaşa bağlı olarak TREC/KREC analizi yapılması amaçlanmıştır. Önceden mutasyon saptanmış ve/veya farklı genetik sendromlara sahip hastalarda da TREC/KREC seviyeleri belirlenmiştir. Kontrol grubu olarak immün yetersizlik ve hematolojik hastalıklar dışındaki sebeplerle biyokimya birimine başvuran hastalar ise sağlıklı referans değerin belirlenmesi için kullanılmıştır. Çalışmaya göre yetişkin PİY hastalarının kontrol grubuna göre TREC kopya sayısı bakımından anlamlı derecede daha az seviyelerde olduğu görülmüştür (t-test p<0.0001). Buna karşın KREC kopya sayısında anlamlı olmamakla beraber kontrol grubuna göre daha az seviyelerde olduğu görülmüştür (t test p=0.1461). Pediatrik PİY hastalarında TREC/KREC kopya sayılarının ise anlamlı derecede düşük kopya sayısına sahip olduğu gözlenmiştir (t test p<0.0001). Yaş gruplarına ayrıldığında yetişkin hastaların TREC kopya sayısının anlamlı derecede zamanla azaldığı, KREC kopya sayısının anlamlı olmamakla beraber yaşa bağlı değişmediği belirlenmiştir. Pediatrik hastalarda TREC/KREC kopya sayısının yaşa bağlı olarak değişimi gözlenmemiştir. Mutasyon sahibi hastalarda TREC/KREC seviyeleri belirlenerek mutasyonun fonksiyonel etkileri ortaya konulmuştur. İmmün yetmezlik ve mutasyonlu bireylerde T ve B hücrelerinin fonksiyonel olamaması veya olgunlaşamamasından dolayı TREC/KREC kopya sayılarının kontrollere göre daha az kopya sayısı içerdiği tespit edilmiştir. Yaşa bağlı değişimlerde timik aktivitenin zamanla azalması TREC kopya sayısının azalmasına sebep olmuştur. KREC kopya sayılarının ise kemik iliği kökenli olduklarından yaşa bağlı değişmediği ortaya konulmuştur.
İndüklenerek adacık benzeri hücre kümeleşmeleri (AHK) oluşturan PANC1 hücre hattında sekretogranin (SCG2) gen anlatımının gösterilmesi
Pankreas kaynaklı bir kanser hücre hattı olan PANC-1 hücreleri eksokrin kökenli olup, insüline çoğalarak tepki verirler. Bu hatta ait hücreler, kültür şartları özel biçimde düzenlendiğinde, pankreasa özgü bazı hormonları üretecek şekilde kümeleşirler. Bu tez kapsamında indüklenen PANC-1 hücrelerinde, vesiküler transport proteini kodlayan SCG2 ekpresyonunda oluşan değişimin saptanması amaçlandı. Üç boyutlu bir hücresel model olarak kullanılan adacık benzeri hücre kümelerinde (AHK), sekresyon proteini ekspresyonundaki değişime paralel olarak hormon üretiminde de değişim olabileceği öngörüsüyle, sekretogranin (SCG2) ile birlikte somatostatin (SST) ve glukagon (GCG) gen anlatımları da incelendi. İndüklenmiş ve bazal koşuldaki hücrelerden elde edilen RNA materyallerinden cDNA sentezlendi ve SCG2 geninin spesifik transkriptini çoğaltacak şekilde kRT-PZR yapıldı. Diğer yandan, PDX1, POU5F1, KLF4, SST, GCG genlerindeki ekspresyonlar kontrol amaçlı olarak deney modelimizde takip edildi ve array sonuçları valide edildi. Bu hücre tipinde ekspresyonunun daha stabil olması sebebiyle, "house-keeping" kontrol geni olarak PPIA kullanıldı. Bu tez çalışmasıyla, önemli bir vesiküler transport proteini olan SCG2'nin gen anlatım düzeylerinde, AHK oluşumunu indükleyen farklılaşma protokolünün 0 ve 14'üncü günleri karşılaştırıldığında, yaklaşık 30,5 kat artış olduğu (p=1.17x10 -5) saptandı. Diğer yandan SCG2 kadar olmamakla birlikte SST ve POU5F1 genlerinde de anlamlı değişim olduğu saptandı.