1,084
Archived Theses
0
DOIs Assigned
0%
DOI Rate
Discipline
A new DNA extraction protocol for formalin-fixed paraffin embedded tissue of uterus cancer
Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue is one of the best ways to store a material for further molecular analysis. Further molecular analyses are needed to confirm the diagnosis in such tumors like endometrial tumors. That's why, molecular analyses are important in the anatomical pathology. Extracting DNA from FFPE material is the first step leading to molecular analyses. On the other it is still challenging. Different protocols have been developed to solve this problem. Even some commercial isolation kits are available which are specialized for FFPE tissues. All of the methods aiming to develop efficient and high quality DNA for further analyses. In this study, we aimed to develop a new DNA extraction method from 30 FFPE of uterus tumor tissue blocks which were obtained with permission of Harran University Research Hospital, Department of Pathology. The quantity and quality of the extracted DNA from three replicates of each block were measured by spectrophotometer. The average quality of DNA was found between 1.7-2.0 (A260/A280) and the average absorbance ratio of A260/A230 was 1.39. The average DNA yield was 40.4 nano gram per microliter. The quality and quantity results of extracted DNA from FFPE tissues were enough for molecular analysis. The new DNA extraction protocol has many advantages such as small amount of FFPE tissues (30 micro grams per sample), six easy steps with common chemicals and solutions (without expensive chemicals such as Proteinase K and RNase A), time efficiency (extraction of 30 samples less than three hours) and cost-effective (less than 1 US dollar per sample). The new DNA extraction protocol can be adapted to every laboratory which works on DNA based technologies.
Development of a DNA isolation protocol for breast cancer sample of formalin-fixed paraffin embedded tissues
Nucleic acid extraction and utilization methods from formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE) tissues—which are stored in libraries for extended periods of time—have been developed. Nonetheless, DNA taken from FFPE tissues is typically harmed, and DNA quality may be impacted by prolonged storage. Thus, it's critical to understand how long-term preservation affects FFPE tissues and to advance the methods for obtaining sufficient and high-quality DNA from them. In this project, we aimed to create a DNA isolation protocol from FFPE blocks of breast cancer tissues. A total of 30 FFPE blocks of breast cancer tissues from different types of breast cancer had been studied as three replicates. The blocks had been surgically resected and fixed at Harran University Hospital prior to examination and subsequent storage at 4-degree temperature for several years. The average spectrophotometer measurements of DNA quality were 1.9 (A260/A280) and 1.4 (A260/A230). The average DNA amount was 78.2 nano gram per microliter. The results of DNA extraction are suitable for all DNA based methods such as next generation sequencing technologies. The developed DNA extraction protocol has six easy steps with commonly available chemicals and solutions. It is possible to extract DNA from 30 samples less than three hours and it costs 1 US dollar per sample by developed protocol from FFPE tissue blocks of breast cancer. The developed protocol has many advantages to open the treasure box of FFPE blocks in pathology laboratories and libraries.
Türkiye'de yayılış gösteren Pinus türlerine özgü bir DNA izolasyon protokolü geliştirilmesi
Bu tezde, farklı Pinus türlerinden yüksek verimli ve kaliteli DNA izolasyonu gerçekleştirmek amacıyla optimize edilmiş bir protokol geliştirilmiştir. Çalışmada, Türkiye'nin doğal habitatında bulunan beş ana Pinus türü (Pinus brutia, Pinus nigra, Pinus sylvestris, Pinus halepensis ve Pinus pinea) ile Türkiye dışı orijinli iki tür (Pinus pinaster ve Pinus radiata) ele alınmıştır. İzole edilen DNA örneklerinin verimi ve kalitesi spektrofotometrik yöntemlerle değerlendirilmiş ve türler arasındaki farklılıklar istatistiksel analizlerle incelenmiştir. Shapiro-Wilk normallik testi sonucunda verilerin normal dağılım göstermediği belirlenmiş ve non-parametrik analiz yöntemleri kullanılmıştır. Kruskal-Wallis testi ve Dunn-Bonferroni post-hoc testi sonuçları, türler arasında DNA verimi ve kalitesi açısından istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar olduğunu ortaya koymuştur. Elde edilen DNA örneklerinin bütünlüğü agaroz jel elektroforezi ile değerlendirilmiş ve yüksek moleküler ağırlıklı, intakt DNA bantları elde edilmiştir. Ayrıca, PCR amplifikasyonları başarılı bir şekilde gerçekleştirilmiş ve amplikonlar jel elektroforezi ile doğrulanmıştır. İzole edilen DNA örnekleri, dizilemeiçin uygunluk göstermiş ve sekanslama sonuçları başarılı bir şekilde elde edilmiştir. Bu bulgular, optimize edilmiş protokolün hem geleneksel moleküler tekniklerde hem de ileri düzey genetik analizlerde etkin bir şekilde kullanılabileceğini göstermektedir. Protokolün uygulama süresinin kısa olması (yaklaşık 65 dakika) ve düşük maliyeti (örnek başına yaklaşık 0,05 ABD doları) önemli avantajlar sağlamaktadır. Ticari kitlerle karşılaştırıldığında maliyet etkinliği ve farklı Pinus türlerinde tutarlı sonuçlar vermesi, protokolün geniş çaplı genetik ve moleküler biyoloji çalışmalarında tercih edilebilirliğini artırmaktadır. Ayrıca, protokolün farklı bitki türleri ve dokularında uygulanabilirliğinin araştırılması, gelecekteki çalışmalar için önerilmektedir.
Determination of antimicrobial activity, mechanism of action and synergistic effect of bicarinalin antimicrobial peptide on Helicobacter pylori
Helicobacter pylori is a Gram-negative bacterium that colonizes the human stomach which results in various gastrointestinal-related infections, diseases, and cancer. Eradication has become difficult until today due to the increasing antibiotic resistance of the bacteria. The objective of our study is to investigate the activity and synergistic activity with treatment antibiotics of the ant venom derived from Tetramorium bicarinatum known as Bicarinalin antimicrobial peptide against H. pylori. For this purpose, disk/well diffusion and microdilution experiments were conducted to find the antibacterial activity of determined concentrations of Bicarinalin AMP against H. pylori reference and clinical isolates in our stock. Positive and Levofloxacin were used as control. MIC99 values were determined by measuring the OD at 600nm. Then, Bicarinalin effect on the intracellular proteins and DNA was analyzed using colorimetric assay. Bradford method was used for the estimation of protein leakage. Subsequently, the cellular damage effects were verified by Scanning Electron Microscopy (SEM). Finally, through the disk diffusion method, the synergistic effect of Bicarinalin was tested in combination with Levofloxacin, Clarithromycin and Tobramycin. As a result, the MIC99 value of Bicarinalin was determined as 4.8μg/mL and 4.9μg/mL for the reference strain and clinical isolate, respectively. For the mechanism of action, the protein and DNA leakage that are secreted to the external environment were determined to be 33.25% and 55.10%, respectively. In SEM analysis, the cell membrane structure is disrupted, cells penetrate each other, morphological structure is deteriorated. Finally, the synergistic activity of Bicarinalin was evaluated and it was determined that the AMP increases the inhibition zones of the currently used antibiotics, Levofloxacin, Clarithromycin and Tobramycin.
Mide kanserinde oksidatif stresin NRF3, POMP ve otofajik gen ekspresyonları üzerindeki etkisinin incelenmesi
Mide kanseri dünya çapında beşinci sırada görülen ve kansere bağlı ölümlerde ise üçüncü sırada yer alan malign bir tümördür. Oksidatif stres, hücrede oksidanlar ve antioksidanlar arasındaki dengesizlik durumudur. Hücrede artan reaktif oksijen türevleri (ROS), hücresel hasara neden olarak kanser gelişimine katkıda bulunur. Antioksidanlar tarafından oksidatif stresin baskılanması hücresel homeostazın sağlanması açısından son derece önemlidir. Propolisin başlıca bileşenlerinden olan kafeik asit fenetil ester (KAFE) anti-kanser ve antioksidan etkilere sahip olan flavonoid bir bileşiktir. Cap'n collar (CNC) protein ailesine ait olan NRF1, NRF2 ve NRF3 hücresel stres faktörlerine karşı aktive olan transkripsiyon faktörleridir. NRF3'ün fizyolojik rolleri henüz netlik kazanmamıştır. Kanser hücrelerinde NRF3'ün yüksek düzeyde eksprese olduğu bilinmektedir. Proteozom olgunlaşma proteini (POMP), bir şaperon görevi görerek 20S proteozomun biyogenezinden sorumludur. Otofaji; besin eksikliği, hipoksi ve oksidatif stres gibi stres faktörleri sonucu aktive olan kendi kendini yok etme mekanizmasıdır. Bu tez çalışmasında, ilk defa hidrojen peroksit aracılı oksidatif stres koşulları oluşturulmuş AGS ve MKN-45 mide kanseri hücrelerine bir antioksidan olan KAFE uygulaması yapılarak oksidatif stresin baskılanması ve her iki uygulama grubunda da NRF3, POMP ve Beclin-1 gen ekspresyonlarının incelenmesi amaçlanmıştır. Hidrojen Peroksitin hücreler üzerindeki sitotoksitesi MTT analizi ile tespit edilmiştir. AGS ve MKN-45 hücreleri uygun koşullarda kültüre edilmiş, sonrasında hücrelere hidrojen peroksit ve antioksidan olan KAFE uygulanmıştır. Uygulama yapılmış AGS ve MKN-45 hücrelerinde gerçek-zamanlı polimeraz zincir reaksyionu yöntemiyle NRF3, POMP ve Beclin-1 ekspresyonları incelenmiştir. Bulgularımız, her iki hücre hattında da oksidatif stres koşullarında, NRF3 gen ekspresyonlarının azaldığını, POMP ve Beclin-1 gen ekspresyonlarının arttığını göstermiştir. Antioksidan KAFE ile oksidatif stresin baskılanmasının ardından her iki hücre hattında da NRF3 gen ekspresyonları artarken, Beclin-1 gen ekspresyonları azalmıştır. POMP gen ekspresyonları ise oksidatif stres koşullarında olduğu gibi artış göstermiştir. Sonuçlar, mide kanserinde yüksek düzeyde eksprese olduğu bilinen NRF3'ün, oksidatif stres koşullarında da mide kanserinde bir onkogen olarak rol alabileceğini ve NRF3 tarafından doğrudan indüklediği bilinen POMP'nin stres koşullarında ekspresyonlarının artmasının mide kanseri hücrelerinde apoptotik mekanizmaları aktive edebileceğini düşündürmektedir. Bununla birlikte, oksidatif stres koşullarının mide kanseri hücrelerinde Beclin-1 gen ekspresyonlarını arttırmasının otofaji mekanizmalarını aktive ederek mide kanserinde sağ kalımı arttırabileceğini de düşüdürmektedir.
Staphylococcus aureus izolatlarının β-laktam grubu antibiyotiklere karşı duyarlılıklarının astaksantin ile arttırılması
Gram pozitif bakteri olan Staphylococcus aureus (S. aureus), tipik olarak deri yüzeyinde ve nazofarenkslerde kolonize olmaktadır. Doğrudan temas yoluyla bulaşan S. aureus sağlıklı bir cildi enfekte etmez fakat dokulara veya kan dolaşımına girdiğinde çok ciddi enfeksiyonlara sebep olabilmektedir. Biyofilm üretme yeteneğinden dolayı tedavisi zor olan bu bakterilerin neden olduğu enfeksiyonların mortalite ve morbiditesi yüksektir. 1928 yılında A. Fleming tarafından penisilinin bulunmasıyla stafilokokal enfeksiyonlarda kullanılmasından kısa bir süre sonra stafilokokların penisilinaz üretmesiyle beraber tedavide farklı antibiyotikler kullanılmaya başlanmıştır. Metisilinin kullanılmasıyla kısa süre içerisinde metisiline de direnç gösteren S. aureus (MRSA) suşları ortaya çıkmış ve bu durum ciddi bir sağlık sorunu haline gelmiştir. Özellikle MRSA gibi çoklu ilaç direncine sahip olan ve biyofilm üreten suşlarda antibiyotik tedavisinin gittikçe zorlaşmasından dolayı yeni antimikrobiyal ajan ve kombinasyonlarına ihtiyaç duyulmaktadır. Yapılan bu çalışmada, biyofilm üreten S. aureus izolatları üzerinde β-Laktam grubu antibiyotikler ile Astaksantinin çeşitli doz kombinasyonları ile antibakteriyal ve antibiyofilm etkileri tespit edilmiştir. Biyofilm üreten S. aureus izolatlarının, çoğu antibiyotiklere karşı direnç gösterdiğinden, biyofilm yapılarını inhibe etmek yüksek antibiyotik dozu gerektirdiğinden, çeşitli dozlardaki β-Laktam grubu antibiyotiklerin astaksantin kombinasyonları ile antimikrobiyal ve antibiyofilm duyarlılıkları arttırılması amaçlanmıştır. Bu çalışmada biyofilm oluşturan MRSA ve MSSA izolatlarında mecA ve nuc genlerinin varlığı tespit edilip, izolatlar üzerindeki Astaksantin'in etkili olduğu dozlar ve β-laktam antibiyotiklerin minimum inhibitör konsantrasyonları (MİK), minimum bakterisidal konsantrasyonları (MBK) belirlenerek kombinasyonların planktonik bakteriler üzerindeki etkilerini gözlemlemek amacıyla Checkerboard metodu uyarlanarak kullanılmıştır. Astaksantin ile β-laktam antibiyotiklerin kombinasyonlarının, izolatların biyofilm üzerindeki etkisini ölçmek için MtP yöntemi kullanılmıştır. Ajanların kombinasyon uygulamalarının biyofilm oluşumunu etkilediği gözlemlenmiştir. Çalışmamızın sonuçları incelendiğinde Astaksantin'in belirli dozlarda, antibiyotik duyarlılıklarını artırdığından ve antibiyotik direncini duyarlı hale getirdiği görülmüş olup, biyofilm üretiminde MSSA'larda antibiyotiklerin MİK dozlarını 32 kata kadar indirirken; MRSA'larda MİK dozlarını 2 ile 32 kat arasında düşürmeyi başarmıştır. Bu sonuca bakılarak, Astaksantin ile β-laktam antibiyotiklerin kombinasyon uygulamaları özellikle MRSA kaynaklı biyofilm enfeksiyonları için tedavi opsiyonu olarak düşünülebilir. Anahtar Kelimeler : Biyofilm, MRSA, MSSA, Antibiyotik Direnci, Astaksantin
Mide kanserinde NRF3 ve NOTCH-2 reseptörü ilişkili miRNA34-a tayini ve sisplatin ile doksorubisin uygulamasının gen ekspresyonları üzerindeki etkisinin karşılaştırılması
Mide kanseri en sık görülen dördüncü malignitedir ve akciğer kanserinden sonra kanser sebepli ölümlerin ikinci sebebi olan çok faktörlü bir hastalıktır. NOTCH sinyal kaskadı mide karsinogenezinde önemli bir sinyal yolağıdır ve apoptozu, hücre farklılaşmasını, çoğalmasını denetler. CNC ailesine mensup NRF3'ün hücrelere kanser sürücüsü gen fonksiyonları kazandırdığı düşünülmektedir fakat fizyolojik işlevi araştırılmaya devam etmektedir. Mikro RNA'lar (miRNA) 19 ile 25 nükleotit uzunluğunda, evrimsel olarak korunmuş küçük ve kodlanmayan tek sarmallı RNA molekülleridir ve kanserde miRNA'lar onkogen, tümör baskılayıcı ya da hem tümör baskılayıcı hem de onkogen gibi fonksiyon gösterebilirler. Doksorobusin; birçok kanser türünde kullanılan antrasiklin grubu bir kemoterapik ajandır, Sisplatinin ise tümör hücrelerinde anti-neoplastik etkileri olduğu belirlenmiştir ve uzun yıllardır çeşitli kanser türleri için kullanılır. Bu tez projesi kapsamında ilk defa mide kanserinde NRF3 ve NOTCH-2 gen ifadelerinin ilişkisi tespit edilip Sisplatin ve Doxorubusin uygulanmasının NRF3 ve NOTCH gen ifadelerine etkisinin araştırılması hedeflenmektedir. Bunlara ek olarak, NOTCH Sinyal yolağı ve NRF3 geni ile etkileşimi olduğu bilinen ve bu sayede kanser için bir etken olduğu biyoinformatik olarak gösterilen miRNA34-a tespit edilerek aynı koşullar altında NRF3 ve NOTCH gen ifadeleri ile ilişkileri tayin edilecektir. Sisplatin ve Doksorobusinin mide kanseri hücrelerindeki etkisi MTT hücre canlılığı tayini ile belirlenmiştir ve MKN-45 ve AGS hücre hatları uygun koşullarda kültürlendikten sonra kemoterapi ajanları ile muamele edilmiştir. Ardından gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu ile NRF3, NOTCH-2 ve miRNA34-a gen ekspresyonları incelenmiştir. Bulgularımıza göre; her iki ilaç uygulaması sonrası NRF3 gen ekspresyonun AGS 72 saat Sisplatin uygulaması haricinde azaldığını; NOTCH-2 gen ekspresyonunda Doksorobusin uygulaması ardından her iki hücre hattında azaldığını; Sisplatin uygulamasında gen ekspresyonunun arttığını fakat istatiksel olarak anlamlı olmadığını; miRNA34-a gen ekspresyonunun ise AGS 48 saat Doksorobusin uygulaması hariç arttığını göstermektedir. Artan miRNA34-a gen ekspresyonun onkogenik NRF3 ve NOTCH-2 üzerinde tümör baskılayıcı bir rol oynayabileceği fakat aralarındaki ilişkinin anlaşılabilmesi için ileri yönde çalışmalara gereksinim olduğu düşünülmektedir. Anahtar Kelimeler: Mide Kanseri, miRNA34-a, NOTCH-2, NRF3, Kemoterapi Ajanları
Mide kanserinde polimorfik Helicobacter Pylori CagA genotiplerinde miR-200a-3p, miR-223-5p ve miR-29a-3p ekspresyon analizi
Mide kanseri, dünyada en yaygın beşinci malignite olup kansere bağlı ölümlerin önde gelen üçüncü nedenidir. Helicobacter pylori, mide kanser gelişimiyle ilişkili cagA virülans faktörü içermektedir. CagA geninin 3' değişken bölgesindeki dizi varyasyonlarının (A, B, C EPIYA motiflerinin sayısı ve R1, R2, R3 bölgelerinin organizasyonuyla oluşan A, B, C ve D cagA yapısı) mide kanser riskini etkilediği saptanmıştır. Özellikle birden fazla EPIYA-C motifi içeren C-tipi cagA'ya sahip suşların, mide kanser riskini artırdığı gösterilmiştir. Helicobacter pylori virülans faktör cagA' nın, let-7 dahil birçok miRNA ifadesini değiştirdiği tespit edilmiştir. Bu çalışmada kanserli mide dokularından izole edilen Helicobacter pylori suşlarının cagA geninin 3' değişken bölgesindeki dizi varyasyonlarını saptamak üzere PZR analizi yapıldı. Helicobacter pylori enfekte kanserli mide dokularında, miR-200a-3p, miR-223-5p ve miR-29a-3p miRNA'larının ifade değişimi kantitatif gerçek zamanlı PZR ile analiz edildi. CagA 3' değişken bölgedeki dizi varyasyonlarına (ABC EPIYA motifli A-tipi cagA ve AB-ABC EPIYA motifli A ve C tipi cagA) sahip suşlarla enfekte dokularda, miR-29a-3p ve miR-200a-3p ifadesinin azaldığı, miR-223-5p ifadesinin ise arttığı belirlendi.
Mide kanserinde polimorfik Helicobacter pylori vaca genotiplerinde miR-200a-3p, miR-223-5p AND miR-29a-3P miRNA'larının ekspresyon analizi
Mide kanseri insidansı ve mortalitesi oldukça yüksek olan bir kanser türüdür. Küresel çapta kansere bağlı ölüm oranlarında ikinci sırada yer almaktadır. H. pylori mide kanseri risk faktörü olarak bilinmektedir. H. pylori'den vakuol oluşturucu bir protein salınmaktadır. Vakuol oluşturucu proteinin vacA adı verilen gen tarafından kodlandığı bilinmektedir. VacA'nın kodladığı protein prekürsör halde 140 kDa boyutundadır. Salgılanan proteinden proteolotik prosesler sonucunda 88 kDa'lık aktif toksin bölgesi oluşmaktadır. Aktif toksin bölgesi p33 ve p55 adlı iki koldan meydana gelmektedir. Bu iki kol üzerinde s-, m- ve i- bölgeleri mevcuttur. H. pylori vacA toksin bölgelerinde farklı alleller (S1/M1/i1 veya S2/M2/İ2) içeren formlar bulunmaktadır. S1/M1/İ1 allelleri en polimorfik formlardır. H. pylori vacA'nın vakuol oluşturma yeteneği ile apoptozu tetiklemesi ve T lenfositlerinin proliferasyonunun baskılanması gibi diğer etkileri arasında doğrudan bir ilişki mevcuttur. H. pylori virülans faktör VacA'nın, let-7 dahil birçok miRNA ifadesini değiştirdiği tespit edilmiştir. Bu çalışmada kanserli mide dokularından izole edilen H. pylori suşlarında VacA geninin polimorfik bölgelerini saptamak üzere PZR analizi yapıldı. Farklı VacA formlarına sahip kanserli mide dokularında, miR-29a-3p, miR-200a-5p ve miR-223-3p miRNA'larının ifade değişimi kantitatif gerçek zamanlı PZR ile analiz edildi. Farklı VacA formlarının mide kanseri dokularında, çalışılan miRNA'ların ifade seviyesini etkileyebileceği gözlemlendi.
Mide kanserinde vincristine uygulamasının miRNA gen metilasyonlarına etkisi
Mide kanser dünyada yüksek insidans gösteren agresif bir hastalıktır. Mide kanseri oluşumu ve gelişiminde genetik faktörlerin yanısıra epigenetik faktörler de etkilidir. Epigenetik değişiklikler DNA metilasyonu, histon modifikasyonları ve RNA interferansını kapsar. Mide kanserinde tümör baskılayıcı genlerin promotör bölgeleri içindeki CpG adacıklarında yoğun hipermetilasyon görülür. Meydana gelen bu değişiklikler mutasyonlara, kromatin kararsızlığına ve tümör baskılayıcı genlerin transkripsiyonel olarak susturulmasına sebep olabilir. Mide kanserinde yüksek veya düşük ekspresyon gösteren miRNA'lar tümörogenez, proliferasyon, invazyon ve metastazda etkilidir. miRNA genlerindeki metilasyon durumu kanser patogenezinde düzensiz ekspresyon gösteren miRNA ürünlerine sebep olmaktadır. Mide kanserinde tümör baskılayıcı özellik gösteren miR335, miR34a ve miR9-3'ün düşük ekspresyon gösterdiği ve bu düşük ekspresyonun miRNA genlerindeki hipermetilasyondan kaynaklı olduğu bildirilmiştir. Yaptığımız bu çalışmada DNMT inhibe edici ajanı olan decitabine ile kemoterapötik bir ilaç olan vincristine'nin AGS ve MKN45 mide kanseri hücre hatlarında düşük ekspresyon gösteren tümör baskılayıcı özellikteki miR335, miR34a ve miR9-3'ün genlerinde mevcut olan hipermetilasyona olan etkisinin saate bağlı olarak incelenmesi amaçlanmıştır. Kontrol grubu ve decitabine grubu ile yapılan karşılaştırmalı analizler sonucunda, vincristine'nin AGS hücre hattında miR335 geninde metilasyonu arttırdığı, MKN45 hücre hattında metilasyonu azalttığı bulunmuştur. Vincristine'nin miR34a ve miR9-3 genlerinde her iki hücre hattında saate bağlı olarak demetilasyonu arttırdığı gösterilmiştir. Vincristine uygulaması sonucu pri-miR335 ekspresyon seviyesinin AGS hücre hattında azaldığı, MKN45 hücre hattında arttığı; pri-miR34a ve pri-miR9-3'ün ise her iki hücre hattında ekspresyon seviyelerinin arttığı bulunmuştur. Elde edilen bulgular miRNA genlerindeki metilasyon statüleri ile ekspresyon seviyelerinin birbiriyle ilişkili olduğunu göstermektedir. Vincristine'nin mide kanseri hücrelerinde gene özgü olarak metilasyonu etkilediği bulunmuştur.
Mide kanserinde polimorfik Helicobacter pylori genotiplerinde miR-98 ve miR-16-5P miRNA'larının ekspresyon analizi
Mide kanseri, dünya genelinde görülme sıklığı açısından dördüncü; kanser kaynaklı ölümler açısından ise ikinci sıradadır. Yüksek görülme sıklığının yanında geç anlaşılabilmesi, mide kanseri hastalarının birkaç sene içinde hayatlarını kaybetmelerine yol açmaktadır. En çok bilinen risk faktörleri, tütün ürünleri kullanımı, beslenme tarzı ve Helicobacter pylori enfeksiyonudur. Bakteri enfeksiyonunun, genetik yatkınlıkla birleştiğinde mide kanseri riskini önemli ölçüde arttırdığı bilinmektedir. Helicobacter pylori kanser oluşumunda rol oynayan ve polimorfik özellik gösteren CagA ve VacA olarak isimlendirilen iki önemli gen taşımaktadır. MikroRNA'lar küçük, kodlamayan RNA molekülleridir. Yaklaşık 20-25 nükleotid uzunluğundaki bu moleküller, post-transkripsiyonel evrede gen ekspresyonunu negatif yönde düzenler. Kanser mekanizmalarında önemli görevler üstlendikleri bilinmektedir. Hem tümörü tetikleyici hem de tümör baskılayıcı özellikleri vardır. Bu çalışmada, Helicobacter pylori genlerinden VacA ve CagA polimorfizmleri, Türk popülasyonunda çalışılmış ve bu polimorfizmler ile mide kanseri arasındaki ilişki araştırılmıştır. Ayrıca MiR-98 ve MiR-16-5p miRNA'larının tümörlü dokulardaki ekspresyon seviyelerindeki değişimler de incelenmiştir. İncelenen CagA ve VacA polimorfizmlerinin hastalıkla ilişkili olduğu görülmüş, tümör baskılayıcı ve pro-apoptotik etki gösteren miRNA'ların ise ekspresyon seviyelerinde, AGS kontrol hücre hattına göre azalma olduğu bulunmuştur.
Mide kanseri hücre hatlarında vıncrıstıne ile indüklenmiş kanser kök hücrelerinin tayini ve ilaç hassasiyetinin belirlenmesi
Yakın zamanda, kanser kök hücreleri (KKH) kanser tedavi çalışmalarında ve tümör anjiyogenezinde odak haline gelmiştir. Ayrıca KKH'ler kanser terapileri için önemli bir hedeftir. KKH'ler kandini yenileme ve pluripotent kapasiteye sahiptir. Vincristine (VCR) çeşitli kanserlerin tedavisinde sıklıkla kullanılan kemoterapik anti kanser ilaçtır. Bununla beraber, VCR hakkında son zamanlarda yapılan çalışmalar VCR'nin kanser hücreleri ile KKH'leri arasındaki ayrımı sağladığını göstermektedir. Ayrıca tümör anjiyogenezinin KKH devamlılığı ve kemoterapik ilaç direnci arasında bağlantılı olduğu rapor edilmiştir. Notch sinyal yolağı hücre farklılaşması, devamlılığı ve anjiyogenezde kritik bir rol oynar. Ve bu yolakta Delta Benzeri Ligand 4 (DBL4) anjiyogenezde önemli bir anahtar role sahiptir. Buradan yola çıkarak AGS mide kanseri hücre hattında anti-DBL4 antikoru ile Notch yolağının susturulması ve VCR'nin etkisi ilk defa incelenecektir. AGS hücre hatlarında VCR ve anti-DBL4 antikorunun sitotoksisitesi MTT analizi ile belirlendi. VCR uygulamasının ardından, AGS hücre popülasyonundaki KKH'leri seçildi. Seçilen hücrelerde morfoloji, kolonizasyon, sferiod oluşumu ve farklılaşma analizi yapıldı. Ardından DBL4 ligandının inhibisyonu ile Notch yolağının susturulması için anti-DBL4 antikoru kullanıldı. Bu işlem sonucunda uygulama yapılmamış AGS kontrol hücreleri ile anti-DBL4 uygulanmış AGS hücrelerinin karşılaştırılması sonucunda damar benzeri yapıların gerilediği görüldü. Son olarak, VCR ve anti-DBL4 antikorunun damar benzeri yapı oluşumu üzerine kombine etkisi, AGS KKH'leri üzerinde belirlendi.
Hipoksi koşullar altında mide kanserinde Vincristine'nin apoptoz ve otofaji üzerine etkisi
Kanser, dünyada çokça ölüm sebebine neden olan multifaktöriyel ve agresif bir hastalıktır. Mide kanseri de dünya üzerindeki ölümlerin en yaygın dördüncü nedenidir. Hastalığın seyrinde ise apoptoz ve otofaji gibi ölüm mekanizmaları büyük ölçüde işlev görmektedir. Vincristine ise, tübülin dimerlerine bağlanarak kanserli hücrelerin apoptoza gitmesine sebebiyet veren kemoterapötik bir ilaçtır. Fakat Vincristine aynı zamanda oral kanser hücrelerini apoptozdan koruyarak bu hücrelerin otofajiye gitmesini sağlar ve bunun da kanserin ileri evrelerinde kanseri daha da agresif hale getirdiği düşünülmektedir. Mide kanserinde Vincristine'nin hipoksik koşullarda otofaji üzerine etkisi ilk defa gösterilerek, ilacın kullanımının mide kanseri hücre hatları üzerine etkisinin gösterilmesi ve hücresel davranışın anlaşılması hedeflenmiştir. Bu amaçla, p53'ü mutant olan AGS hücreleri ile daha az agresif olan MKN45 hücreleri uygun koşullarda kültüre edildi. Hipoksi ve Vincristine ile muamele edildikten sonra apoptozda görev alan Bax ve Bcl-2 genleri, otofajide görev alan Beclin-1 ve LC3-II genleri ve hipokside görev alan HIF-1α ve VEGF genlerinin ekspresyonları analiz edilerek kullanılan Vincristine'nin kanser hücrelerini tedavi etmedeki başarısı gözlemlenmiştir. Yapılan çeşitli analizler sonucunda Vincristine'nin mide kanserinde otofajiyi indüklediği ve asidik veziküler organel oluşumuna neden olduğu gözlemlenmiştir. Her iki hücre hattında da Beclin-1 ve LC3-II ekspresyonlarında kontrole göre artış fark edilirken AGS hücre hattında pro-apoptotik Bax geninde azalma, anti-apoptotik Bcl-2 geninde artma gözlemlenmiştir. MKN45 hücrelerinde ise Bax ve Bcl-2 genlerinde artma gözlemlenmiştir. VEGF ekspresyonunun iki hücre hattında da arttığı fakat HIF-1α'nın AGS hücrelerinde arttığı, MKN45 hücrelerinde azaldığı bulunmuştur. Hipoksi koşullar kontrole göre kıyaslandığında AGS hücrelerinde VEGF dışındaki tüm genlerde artış olurken, MKN45 hücrelerinde VEGF, Bax ve Beclin-1 genlerinin ekspresyonu artmış, HIF-1α, Bcl-2 ve LC3-II genlerinin ekspresyonları azalmıştır. Hipoksi ve Vincristine'nin birlikte uygulandığı durumlarda ise AGS hücrelerinde çalışılan tüm genlerin ifadesinin arttığı, MKN45 hücrelerinde de VEGF harici çalışılan tüm genlerin ifadesinin arttığı gözlemlenmiştir. Bunun sonucu olarak Vincristine'nin hipoksik koşullarda AGS hücre hattına kıyasla, daha az agresif olan MKN45 hücre hattında otofajiyi indüklediği bulunmuştur.
Glioblastoma hücre hatlarında uyarılmış pluripotent kök hücre (UPKH) kaynaklı eksozomların terapötik etkisinin analizi
En ölümcül kanser türleri arasında görülen glioblastoma, sağkalımı oldukça düşük olan bir primer beyin tümörüdür. İlaç direnci ve kan beyin bariyerini geçme zorluğundan dolayı mevcut tedavilerle bile glioblastoma vakalarında sağkalım oldukça düşüktür. Mevcut tedavilerin yanı sıra kan beyin bariyerini kolaylıkla geçebilen ve toksik etki oluşturmayan eksozomlar, GBM tedavisi için umut vaat eden biyolojik bir araçtır. Yapılan daha önceki çalışmalar, embriyonik kök hücre kaynaklı eksozomların glioblastomada antitümörijenik etkilere sahip olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, embriyonik kök hücreler gibi etik problemler teşkil etmeyen uyarılmış pluripotent kök hücrelerden kaynaklanan eksozomların aynı etkiye sahip olup olmadığı bilinmemektedir. Bu nedenle, yapılan bu tez çalışmasında, embriyonik kök hücrelere yakından benzeyen ve sınırsız çoğalma kapasitesine sahip olan uyarılmış pluripotent kök hücre kaynaklı eksozomlar, bir glioblastoma hücre hattı olan LN18 hücrelerinde uygulanmış ve hücre canlılığıyla birlikte GBM-ilişkili bazı genlerin ifadesi analiz edilmiştir. Bunun yanı sıra sınırsız çoğalan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin kullanılmasıyla kaynağa bağlı düşük eksozom verimliliğinin önüne geçilmiştir. Elde edilen verilerle uyarılmış pluripotent kök hücre kaynaklı eksozomların GBM hücre canlılığını azlattığı ve GBM-ilişkili genler üzerinde etki ettiği gözlenmiştir. Haliç Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü'nün bilimsel araştırma ve uygulama çalışmalarına verdiği destekle gerçekleştirilen bu tez çalışmasının sonuçları, anti-GBM etkisinin olduğu gözlenen uyarılmış pluripotent kök hücre kaynaklı eksozomların, GBM için potansiyel bir terapötik araç olabileceğini göstermektedir.
Mide kanserinde hipoksi koşullar altında TNF-α'ya bağlı olarak NRF3 geninin incelenmesi
Hipoksi, özellikle solid tümörlerde düşük oksijen seviyelerinde ortaya çıkan bir koşuldur. Hipoksi belirteci olan HIF 1α'nın stabilize olması için ROS oluşumu gereklidir. Hipoksik koşulların ilk evrelerinde ortaya çıkan ROS seviyeleri, HIF 1α'nın degredasyonundan sorumlu olan PHD ve FIH proteinlerini inhibe eder. Mide kanserinde, hipoksik bir mikroçevreden etkilenen immün sistem hücreleri, TNF α'nın salınımını gerçekleştirir. TNF α, hem mitokondriyal yoldan hem de NOX aktivasyon yolu ile ROS oluşumunu indükler. TNF α tarafından artan ROS seviyeleri, mide kanserinde HIF 1α ifadelerini ortaya çıkarır. CNC ailesi üyeleri olan Nrf1, Nrf2 ve Nrf3, çeşitli hücresel stres koşullarda aktive olan transkripsiyon faktörleridir. Antioksidan gen ifadelerini pozitif olarak düzenleyen Nrf1 ve Nrf2'ye karşın Nrf3 ifadesi, antioksidan gen ifadelerini baskılar. Nrf3'ün artan gen ifadesi, birçok kanser türlerinde agresifliğe yol açmıştır. Bu çalışmada ise Nrf3 gen ifadesi, hipoksi koşullar altında ve mide kanserinde TNF α'ya bağlı olarak ilk defa incelenmiştir. Bulgularımız, kobalt kaynaklı hipoksi modelinde AGS ve MKN 45 hücrelerinde, HIF 1α gen ifadesi ile Nrf3 gen ifadesinin arttığını göstermiştir. Zamana bağlı olarak, HIF 1α gen ifadesi kontrol grubu seviyesine geri dönerken, Nrf3 gen ifadesi anlamlı derecede baskılanmıştır. Nrf3 gen ifadesi, TNF-α ve kobalt uygulanmış AGS ve MKN 45 hücrelerinde artış gösterirken, zamana bağlı olarak artan Nrf3 gen ifadesi, AGS ve MKN-45 hücrelerinde farklı ifade dereceleri baskılanmıştır. Hipoksik koşullar altında ve TNF α varlığında artan Nrf3 ifadesi, mide kanserinde agresifliğe yol açan önemli bir gen olabilir. Ayrıca sonuçlarımız ilk defa hipoksi koşullar altında zamana bağlı olarak Nrf3 gen ifadesini baskılayan bir hipoksik yanıt mekanizmasının olabileceğini de düşündürmüştür.
Alzheımer hastalığı modeli oluşturulmuş SH-SY5Y insan nöroblastoma hücrelerinin tedavisinde histon metil transferazların etkilerinin moleküler analizi
Alzheimer hastalığı (AH), 65 yaş üstü kişilerde görülen hafıza, anlama, dil, muhakeme gibi davranışsal ve bilişsel işlevlerde bozulma ile seyreden nörodejeneratif bir hastalık olup, beyinde amiloid beta 42 (Aβ42) adı verilen anormal nöritik plakların ve nörofibriler yumakların birikmesiyle karakterizedir. AH, bazı genlerdeki mutasyonlarla bağlantılı otozomal dominant bir hastalık olarak kalıtım gösterebilmekle birlikte bu genlerin çoğu DNA ve histon modifikasyonları gibi epigenetik mekanizmaların etkisi altındadır. Epigenetik modifikasyonlar geri dönüşümlü oldukları için potansiyel olarak farmakolojik müdahale ile hedef alınabilir. Buna istinaden epigenetik ilaçlar, kanser, kardiyovasküler bozukluklar, beyin bozuklukları gibi önemli hastalıkların tedavisinde yararlı olabilir. Bu bağlamda gerçekleştirilen bu çalışmada SH-SY5Y insan nöroblastoma hücrelerinde yeterli Aβ42 ekspresyonu ile Alzheimer modeli oluşturularak Aβ plaklarının artmasında rol alan genlerin ekspresyon seviyelerini değiştirebilecek metil transferaz enzim inhibitörlerinin kullanılmasıyla hastalığın prognozunu olumlu şekilde etkileyebilen teröpotik yaklaşımların geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu maksatla SH-SY5Y hücreleri uygun koşullarda kültüre edildikten sonra, yapılan Aβ42 protein uygulaması ile Alzheimer modeli oluşturularak hücrelerde üretimi başlayan Aβ proteininin kantitatif ölçümleri ELISA yöntemi ile gerçekleştirildi. Ayrıca Aβ üretimi ile ilişkili genlerin ifade seviyeleri gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (GZ-PZR) ile ölçülerek hücrelerde oluşturulan Alzheimer modeli gen seviyesinde kontrol edildi. Oluşan Aβ plaklarının miktarını düşürecek Azasitidin, Deazaneplanocin ve SGC0946 gibi metiltransferaz enzim inhibitörlerinin farklı konsantrasyonlarda hücrelere uygulanmasıyla, MTT testi ile optimum konsantrasyonlar belirlendi ve bu konsantrasyonlardaki kimyasalların uygulandığı hücrelerdeki Aβ42 miktarının ELISA yöntemi ile protein düzeyinde ölçülmesinin yanı sıra hastalıkla ilişkilendirilen APP, PSEN, BACE1, GSAP, BDNF gibi genlerin ifade seviyeleri GZ-PZR ile kantitatif olarak belirlenmiştir. Çalışma sonucunda, kullanılan metiltransferaz inhibitörlerinin etkisiyle Aβ42 plak seviyelerinde istatistiksel olarak anlamlı bir düşüş tespit edilmiştir. Kullanılan her bir kimyasal sonrası farklı oranda olmak üzere Aβ42 plaklarıyla ilişkilendirilen genlerin ifade seviyelerinde hastalığın prognozunu olumlu etkileyebilecek şekilde anlamlı değişimler saptanmıştır. Sonuç olarak, kullanılan kimyasalların hücrelerdeki mevcut epigenetik modifikasyonları değiştirerek hücre canlılığında belirgin farklılıklar meydana getirdiği gözlemlenmiştir.
Kimyasal moleküllerin kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin adipositlere farklılaştırılmasındaki etkisinin incelenmesi
Kök hücre kaderinin, küçük kimyasal moleküller ile hedefe dayalı manipülasyonları, hem kök hücre biyolojisine yeni bakış açıları sağlar hem de kök hücreleri ile yapılan teröpatik yaklaşımların gelişmesine katkı sağlar. Küçük kimyasal moleküller, hücre sinyalleri ve mekanizmalarını hedefleyen, kök hücre kaderinde rol oynayan regülatörleridir. Bu tez çalışmasında sıçan kemik iliği kaynaklı hücrelerin, adiposit hücrelerin farklılaşmasında kullanılan geleneksel yöntemlerin veriminin artırılması hedeflenmiştir. Bu hedef doğrultusunda yapılan çalışmada, sıçan kemik iliği kaynaklı kök hücrelerin adipositlere farklılaşmasının verimli bir şekilde yönlendirmesinde etkili olabilecek küçük kimyasal moleküller in vitro ortamda hücrelere uygulandı. Daha sonra adipositlere özgü gen ifadesi ekspresyonu analiz edildi. Sonuçlar incelendiğinde Forskolin, CHIR99021, SGC0946 kimyasallarının uygulandığı hücreler, kontrol ve diğer kimyasalların uygulandığı hücrelere göre adiposit farklılaşmasında önemli olan genlerin ifadesinde artış gözlendi. Elde edilen veriler, yapılan çalışmanın konunun daha iyi anlaşılması için bazı tamamlayıcı çalışmalar yapılması ve adipositlere farklılaşmasında verimin farklı türlerde de etkili olması durumunda rejeneratif tıp için terapötik ajan olarak kullanılabileceği düşünülmektedir.
Liken (Usnea longissima) ekstraktlarının fusarium graminearum izolatlarına karşı antifungal aktivitesinin incelenmesi
Tarımında bitkileri hastalıklardan korumak için geliştirilen yöntemler büyük ölçüde kimyasal pestisitlerin kullanımına dayanmaktadır. Kimyasal pestisitler arasında yer alan fungisitlerin ve fumigantların kullanımı toprak biyotası üzerine ciddi etkilere sahip olup çevre ve tüketici üzerinde olumsuz etkilere sahiptir. Bu yöntemler çevreye zarar verdiği ve atmosfer kirliliğine neden olduğu için uzun vadede ekonomik açıdan uygun değildir. Bu amaçla bitkilerde spesifik olarak hatalığın kontrolü için biyokontrol ajanlar kullanılmaktadır. Bu tez projesinde allelopatik ajan olarak U. longissima ekstraktlarının F. graminearum PH-1 ve H11 izolatları üzerinde antifungal aktivitesi belirlendi ve antifungal aktivite gösteren ekstraktların F. graminearum izolatlarında meydana getirdiği değişiklikler Mst20, CAT ve tri5 genlerinin gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) kullanılarak incelendi. Fentotipik analiz sonuçlarına göre, F. graminearum PH-1 izolatı H11 izolatına oranla liken ekstraktlarına karışı en çok etkilenen izolat olarak belirlenmiştir. U. longissima metanol eksreaktı aseton eksreaktınla oranla daha belirgin antifungal etkili olduğu görüldü. Deneyde kullanılan U. longissima ekstraktlarının konsantrasyon artışına bağlı olarak antifungal inhibisyon zon çapının orantılı olarak arrtığı görüldü. 50mg/ml konsantrasyonlu U. longissima metanol ekstraktı (30±0) aynı konsantrasyonlu aseton ekstraktına (26.5±2.121) oranla daha belirgin antifungal aktivite gözlemlendi. Pozitif kontrol grubu tetrakonzol test edilen izolatlara karşı belirgin antifungal etkili olduğu belirlenirken, negatif kontrol grubu DMSO ve aseton F. graminearum izolatlarına karşı antifungal aktivitesi görülmedi. Gen ekspresyon analiz sonuçlarına göre, apoptozla ilişkili mst20 ve oksidatif stresten sorumlu CAT genlerinin ekspresyon seviyeleri kontrol grubu ile istatiksel olarak karşılaştırıldığında, her iki izolatta anlamlı artış saptandı. Mikotoksin üretiminden sorumlu tri5 geninin ekspresyon seviyeleri kontrol grubu ile istatiksel olarak karşılaştırıldığında, her iki F. gramiearum izolatlarında kontrole göre anlamlı düşüş görüldü. Literatür taramasında likenlerin antifungal etkilere dayanan sınırlı çalışmaları göz önüne alındığında yapılan tez çalışmasında liken (U. longissima) ekstraktlarının F. graminearum izolatlarına karşı antifungal aktivitesinin incelenmesi konusu özgün olması ve biyokontrol ajan olarak araştırmalara katkı sağlaması açısından önem taşımaktadır.
MDA-MB-231 insan meme kanseri hücre hattında miR638'in rolünün incelenmesi
Meme kanseri (MK), kadınlarda en sık görülen malign tümörlerden biridir ve kanserin ikinci önde gelen nedenidir. Yılda yaklaşık 1,5 milyon yeni vaka meme kanseri teşhisi konur ve her yıl yaklaşık 460.000 hasta meme kanseri kemo-direnç ve metastaz nedeniyle ölmektedir. Benzer özelliklere sahip birkaç meme kanseri hastası farklı klinik sonuçlar gösterir. Bu nedenle, biyolojik özelliklerin tanı, prognoz ve klinik sonuçların tahminiyle ilgili kısıtlamaları vardır. Meme kanseri hastalarının yaşam kalitesini iyileştiren yeni kişiselleştirilmiş tedavi yöntemlerinin tanımlanması için acilen yeni tanısal ve prognostik yaklaşımlara ihtiyaç vardır. miRNA profilleri, meme kanseri hastalarını tedaviye yanıt veren veya yanıt vermeyen gruplar olarak sınıflandırmak için etkili bir şekilde kullanılmıştır. Bu nedenle miRNA'ların meme kanseri progresyonunu potansiyel olarak düzenlediği açıkça gösterilmiştir ve meme kanserinin yeni tanısal, prognostik ve öngörücü biyobelirteçleri olarak kullanılmıştır. Bu çalışmada MDA-MB-231 meme kanseri hücre hattında miR638 ve kontrol olarak miR kontrol lenti viral transdüksiyon yöntemi kullanarak yüksek seviyede ekspresyonu gerçekleştikten sonra hücrelerin bu vektörleri içine alıp almadıkları görüntülenecektir. miRNA'ların ekspresyonlarını kontrol etmek için vektörlerde bulunan GFP'nin, floresan mikroskop aracılığıyla meydana getirdiği yeşil ışıma dikkate alınacaktır. MTT yöntemi kullanarak hücrelerde proliferasyon ve çoğalma yeteneği test edilecektir. Bunun yanı sıra bahsi geçen hücrelerde miR638'in etkisini incelemek için transdüksiyonun ikinci günü hücrelerden RNA izole edilip kanser hücrelerinde önemli olan apoptoz ve proliferasyonla ilgili genlerin seviye ve değişiklikleri gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (GZ-PZR) yöntemiyle incelenecektir. Son olarak miR kontrol ve miR638'in MDA-MB-231 meme kanseri hücre hattında yapılan bir çizgi çekme yöntemi ile migrasyonu (göç) nasıl etkilediğine bakılacaktır. Bu çalışmanın amacı, miR638'in insan meme kanseri hücre hatları üzerindeki etkilerinin araştırılmasıdır.
Meme kanserinde nanoparçacıklar kullanılarak kombine tedavi uygulaması
Meme kanseri, kadınlarda yaygın olarak görülen, tümörün heterojen olması nedeniyle tedavisi oldukça zor olan ölümcül bir kanser türüdür. Kemoterapi gibi mevcut kanser tedavilerinde, ilaçların tümör dokusuna spesifik olarak ulaşamaması ve sağlıklı dokulara potansiyel toksik etki bırakmaları nedeniyle, hastalarda olası yan etkiler gözlenmesine neden olmaktadır. Günümüz nanoteknoloji ve biyotıp alanındaki gelişmelerle birlikte geliştirilen nanoparçacıklar, ilacın spesifik dağıtımı ve kontrollü salınımını sağlamaları nedeniyle, onkoloji alanında büyük yankı uyandırmıştır. Bu çalışmada monoklonal antikorlar (mAb) ile yüklü biyo-uyumlu süperparamanyetik demir oksit nanoparçacıklar (SPION) kullanılarak, aynı anda birden fazla reseptörün hedef alınması ve hücrelerin spesifik olarak öldürülmesi amaçlanmıştır. SKBR3 meme kanseri ve kontrol olarak dH1f fibroblast hücre hatları üzerinde, trastuzumab ve cetuximab mAb'larıyla yüklü SPION ile kombine ilaç tedavi uygulaması gerçekleştirildi. Toksik doz, tekli ve kombine tedavinin etkisi, hücrelere uygulamanın ikinci gününde MTT hücre canlılığı testi kullanılarak belirlendi. Hücrelerin ölümü ve sinyal yolaklarıyla ilişkisi, kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (GZ-PZR) kullanılarak, kanser yolaklarındaki anahtar genler üzerinden incelendi. Sonuç olarak kontrol hücrelere kıyasla, kombine tedavi uygulanan hücrelerde kanser hücrelerinde ölüm oranının artmasının yanı sıra, apoptoz ilişkili genlerde ekspresyon artışı gözlenmiştir. Bu sonuçlar ışığında, tasarlanan kombine ilacın, özellikle meme kanseri tedavisi kullanımı açısından oldukça umut verici olduğu gösterilebilir.
Fibroblast hücrelerinin küçük kimyasal moleküller aracılığı ile adipositlere direkt farklılaştırılması
Küçük kimyasal moleküller (KKM) aracılığıyla hücrelerin doğrudan farklılaşması (transdiferansiyasyon), daha önceki yeniden programlanma yöntemlerinin dezavantajlarını gidermekte ve rejeneratif tıp alanında büyük umutlar vaat etmektedir. Bu doğrultuda geliştirilen yeniden programlama çalışmalarında, sinyal yolakları, epigenetik modifikasyonlar veya metabolik süreçleri hedefleyerek, ektopik gen ekspresyonu gerekmeden hücresel farklılaşmada etkili olabilen KKM' ler yaygın olarak kullanılan biyoaktif moleküllerdir. Bu tez çalışmasında insan fibroblast hücrelerin, adiposit benzeri hücrelere doğrudan farklılaşmasında (transdiferansiyasyon) etkili olabilecek küçük kimyasal moleküllerin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu doğrultuda yapılan çalışmada, dH1f fibroblast hücrelerinden adiposit farklılaşmasının indüklenmesinde etkili olabilecek KKM' lerin farklı kombinasyonları, kademeli kültür koşullarında hücrelere uygulandı. Oluşan lipit damlacıklarının birikimiyle karakterizasyon gerçekleştirildi ve farklılaşmada en etkili kimyasal kombinasyonlar belirlendi. Daha sonra belirlenen kombinasyonların uygulandığı hücrelerin adiposit spesifik gen ekspresyon analizleri gerçekleştirildi. Sonuçlar incelendiğinde 3–Deazaneplanocin (DZNep) ve RepSox kimyasallarının uygulandığı hücrelerde yüksek oranda lipit birikimi gözlemlendi. Bu hücrelerde, kontrol ve diğer kombinasyonların uygulandığı hücrelere göre adipositlere özgü genlerinin daha yüksek oranda ekspresyonu gözlendi. Bulgular göz önüne alındığında yapılan çalışmanın daha fazla optimize edilmesi ve farklı türlerde adipositlere direkt farklılaşmanın gerçekleşmesi halinde, rejeneratif tıp alanında ayrıca obezite ve obezite ilişkili hastalıklarda adiposit kaynaklı yeni tedavi yaklaşımlarında kullanılabileceği düşünülmektedir.
Alzheimer hastalığı tanısında APP ilişkili gen ve miRNA seviyelerinin biyolojik belirteç olarak kullanılmasının SH-SY5Y insan nöroblastoma hücrelerinde incelenmesi
Alzheimer Hastalığı (AH) geri dönüşümü olmayan, progresif nörodejeneratif bir hastalıktır. Hastalığın patogenezinin temelinde amiloid-beta (Aβ) monomerlerinin toksik oligomerlere dönüşerek plaklar oluşturması yatmaktadır. MikroRNA (miRNA)'lar hayatta kalma ve nöronal fonksiyonlar için esastır. Birçok miRNA'nın, Alzheimer hastalığı nöropatolojisinde de önemli olduğu gösterilmiştir. Bu bağlamda gerçekleştirilen çalışmada SH-SY5Y insan nöroblastoma hücrelerinde yeterli Aβ42 ekspresyonu ile Alzheimer modeli oluşturularak APP ve β-sekretaz genlerinin hedefi olduğu düşünülen miRNA'ların, bu genlerin anlatım seviyeleri üzerindeki olası rollerinin araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaçla SH-SY5Y ve kontrol olarak insan fibroblast hücreleri uygun koşullarda kültüre edilerek; Aβ42 protein uygulaması yapıldı. Hücrelerdeki amiloid üretimininkalitatif ve kantitatif ölçümleri, ELISA ve MTT analizleri ve kongo kırmızısı boyama yöntemi ile gerçekleştirildi. Hastalıkla ilişkilendirilen miRNA'lar ve bu miRNA'larla ilişkilendirilen genlerin ifade seviyeleri Gerçek-Zamanlı PZR ile kantitatif olarak belirlendi. Sonuç olarak, hastalık modellemesi sonrasında miRNA'lar ve onlarla ilişkilendirilen genlerin hastalığın nöropatolojisi üzerine olası rolleri gösterilmeye çalışılmış ve hastalıkla ilişkili bazı miRNA ve genlerin ifade seviyelerinde Aβ42 uygulaması sonrasında istatistiksel olarak anlamlı değişimler saptanmıştır.
İnterlökin 12'nin akciğer kanseri hücreleri üzerine etkisi
Günümüzde kök hücre tedavileri, tıbbın birçok alanında deneysel veya klinik olarak kullanılan tedavi yöntemlerindendir. Farklı tedavi yöntemleri geliştirilmiş olmasına rağmen henüz kanseri yok edebilecek bir tedavi bulunmamaktadır. Akciğer kanseri en sık görülen kanser türleri arasındadır. Birçok deneysel çalışmada mezenkimal kök hücrelerin (MKH) tedavi edici ve koruyucu özelliği bildirilirken kanser modellerinde ise, kanserli hücrelerin çoğalmalarını baskıladığı ve durdurduğu gösterilmektedir. Ancak yapılan bazı çalışmalarda da kök hücrelerin kanser oluşumunu tetikleyerek kitleyi büyüttüğü, yeni damar oluşumuna ve kanserin invazyonuna neden olduğu gösterilmiştir. MKH'ler ile kanser hücreleri arasındaki iletişim hücrelerden salgılanan sitokinler yardımıyla sağlanmaktadır. MKH'lerin tedavi edici özelliği bu sitokinler ile gerçekleşmektedir. Bu çalışmanın amacı, MKH'ler ile A549 akciğer kanser hücrelerini in-vitro olarak aynı ortamda tutarak, MKH'lerin kanserli hücrelerin büyümesini baskılamak için kullandığı sitokinlerden interlökin (IL)-12 salgılamasını sağlayarak, IL-12'nin A549 kanser hücrelerinde apoptotik ve otofajik yolaklardaki genlere olan etkileri ile birlikte hücre döngüsü ve proliferasyon genleri üzerindeki etkilerini araştırarak MKH'lerin kanser hücreleri üzerindeki etkisini görebilmektir. Bu çalışma hücre kültürü seviyesinde 3 ayrı grup oluşturularak ve 6 farklı saat diliminde yapılmıştır. Hücrelerden salınan sitokinlerden IL-12p70 ve IL-12p40 seviyeleri toplanan besiyerlerinden ELİSA çalışılarak tespit edilmiştir. Ayrıca IL-12 alt birimleri ve reseptörleri, apoptoz ve otofaji , hücre döngüsü belirteçleri ile birlikte proliferasyon belirteçleri gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu yöntemi ile araştırılmıştır. Yaptığımız ELİSA testi ve gz-PZR sonucunda, IL-12'nin salgılanmaya başladığı ilk saatlerde apoptoza direnç gelişmeye başlamış olabileceği gibi ilerleyen zaman diliminde bu apoptotik direncin IL-12 etkisi ile gerilemiş olabileceği ve hücre döngüsü süresinin ise IL-12 salınımından sonra G1/S fazında uzadığı düşünülmektedir. Proliferasyon belirteçlerinin gz-PZR ile mRNA ekspresyon düzeylerine baktığımızda ise IL-12 salgılandıktan sonra azalırken daha sonra yavaşta olsa tekrar eksprese olmaya başladığı gözlemlenmiştir. Sonuç olarak, MKH'lerin, IL-12 salınımı ile A549 kanser hücrelerini baskılamak için tek başına kullanıldığında yetersiz kaldığı, ancak IL-12 salınımı ile kanser hücrelerinin çoğalmasının baskılanmasına rağmen durdurulamadığı düşünülmüştür.
Gençlerin erişkin başlangıçlı diyabeti'nde (MODY) vitamin D reseptör polimorfizmlerinin araştırılması
Diyabet, insülin etkisi ya da sekresyonu ya da her ikisinde de var olan kusurlardan kaynaklanan hiperglisemiyle karakterize edilen metabolik bir hastalıktır. Diyabet bünyesinde esas olarak iki tip barındırmaktadır. Bunlar tip 1 diyabet (T1DM) ve tip 2 diyabet (T2DM) olarak adlandırılmaktadır. Çok sık bilinmeyen ancak beta hücrelerinde fonksiyon bozukluğuna sebep olan tek gen mutasyonu ile karakterize diğer diyabet türleri ise Neonatal diyabet, Gençlerin Erişkin Başlangıçlı Diyabeti (MODY) ve mitokondriyal diyabettir. 1974 yılı Tattersall tarafından ilk kez tanımlanan MODY diyabeti 25 yaşından önce tespit edilen insülinden bağımsız diyabetin baskın ve kalıtsal halidir. MODY'nin tanımlanması diyabetin tedavi ve tanı sürecine büyük önem katmaktadır. D vitamini etkisini D vitamini reseptörü aracılığıyla gösteren bir hormon olarak kabul edilir. Diyabet gelişiminde pankreatik beta-hücrelerinde hem VDR hem de 1-α-OH'az mevcut olup, D vitamini insülin sentezi ve salınımı için önemlidir. D vitamini eksikliği ve diyabet hastalığı toplumlarda çok sık gözlemlenmektedir. Yapılan epidemiyolojik çalışmalardan D vitamini düşüklüğünün T2DM, kardiyovasküler rahatsızlıklar, otoimmün olarak T1DM ve multiple skleroz gibi hastalıkların riskini artırdığı gözlemlenmiştir. Çalışmamızda MODY hastalarında D vitamini düzeyi ile sonuçlar veren VDR geni TaqI rs731236 ve VDBP geni Eco130I (StyI) rs4588 polimorfizmlerinin hastalığın seyri ve biyokimyasal parametreleri üzerine etki düzeyini görmeyi amaçladık. Türk toplumunda son zamanlarda yaygınlığı artan MODY hastalığının D vitamin düzeyleri, VDR ve VDBP gen polimorfizm dağılımlarının incelenmesi bakımından hastalığın tanı ve seyrine katkı sağlayacağını düşünmekteyiz. Çalışmamız hasta ve kontrol olmak üzere iki gruba ayrılmıştır. Hasta grubunda kontrol grubuna kıyasla trigliserid (p<0,05), Serbest T4 (p<0,05), CRP (p<0,05), hemoglobin (p<0,05) ve hematokrit (p<0,05) düzeyleri ile aile diyabet öyküsü (p<0,05), nöropati (p<0,05), retinopati (p<0,05) değerleri büyük ve istatistiksel olarak anlamlı çıkmıştır. VDR gen rs731236 polimorfizminde çalışma sonucumuzda heterozigot mutant 'CT' varyantı, VDBP gen rs4588 polimorfizminde homozigot 'CC' varyantı diğer genotiplere kıyasla daha yüksek bulunmuştur. VDR rs731236 T>C (TaqI) mutant CC genotipi ile VDBP rs4588 C>A (StyI) normal CC genotipi böbrek ve karaciğer fonksiyonları ile ilişkili parametreler üzerinde etkili olduğu gözlenmiştir. Bu çalışma 2022-2024 yılları arasında T.C. Haliç Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü'nün bilimsel araştırma ve uygulamalarına verdiği katkı ile hazırlanmıştır.
Sanguinarine ve askorbik asit kombinasyonlarının ıca-bağımlı biyofilm üreten staphylococcus aureus izolatları üzerindeki etkisinin araştırılması
Nozokomiyal ve toplumsal kaynaklı enfeksiyonlara sebep olan Staphylococcus aureus'ların (S. aureus) son yıllarda prevalansı artmıştır. Biyofilm ilişkili enfeksiyonlara neden olan olup, S. aureus' ların tedavileri zordur. Bu çalışmada, farklı etki mekanizmalarına sahip ajanların, biyofilm üreten S. aureus' lar üzerindeki kombinasyon uygulamaları ile daha düşük dozlarda daha etkili tedavi olanağı yaratmak hedeflenmiştir. Çalışmamızda biyofilm oluşturan metisilin duyarlı S. aureus'da (MSSA), icaA, icaD, blaZ, blaI, blaRI ve atl genlerinin varlığı tespit edildikten sonra, izolatlar üzerindeki sanguinarine ve askorbik asitin minimum inhibitör konsantrasyonları (MİK) ve minimum bakterisidal konsantrasyonları (MBK) belirlendi. Planktonik S. aureus klinik izolatlarına karşı dozları 8 kat MİK ile 16 kat alt-MİK arasında değişen 8 farklı doz içeren sanguinarine ve askorbik asit kombinasyonlarının antibakteriyel ve antibiyofilm aktiviteleri sırasıyla, dama tahtası ve MtP yöntemiyle araştırıldı. Ayrıca MBEK metoduyla, MİK'in 1/16 kat alt-MİK' erini içeren ajanların tek ve kombinasyonlarının sesil S. aureus'lar üzerindeki etkisi araştırıldı. 1/4 MİK sanguinarine ve askorbik asitin tek ve kombine uygulamalarının, inkübasyonun 12 saat sonunda, Sesil S. aureus izolatlarının icaA, icaD ve atl genlerinin ekspresyon düzeyleri üzerine etkileri gözlendi. Planktonik izolatlarda sanguinarine ve askorbik asitin tek ve kombine etkilerine bakıldığında MSSA1, MSSA2, MSSA3 ve MSSA4 izolatlarının FİK değerleri sırasıyla 0,745, 0,745, 0,920, 0,699 olarak tespit edilip, kısmı sinerjistik etkilerinin olduğu belirlenmiştir. Ajan kombinasyonlarının biyofilm oluşumunu ve olgun biyofilmi azalttığı gözlemlenmiştir. MSSA izolatlarının gen ifadelerinde azalma gözlemlenmiştir. Çalışmanın sonuçlarına göre, sanguinarine ile askorbik asit kombinasyonları, ica-bağımlı biyofilm üreten S. aureus infeksiyonlarında, alternatif bir tedavi opsiyonu olabilir. Anahtar Kelimeler: S. aureus, Ica-bağımlı biyofilm, Sanguinarine, Askorbik Asit, Sinerji
MMP enzimlerinin katalitik çinko ile etkileşimlerinin DFT yöntemleri kullanılarak modellenmesi
Matriks Metalloproteinaz-9 (MMP-9), hücre dışı matriksin (ECM) yeniden şekillendirilmesinde ve çeşitli patolojik durumlarda önemli rol oynayan bir enzimdir. Yüksek MMP-9 aktivitesi, kanser (meme, akciğer, pankreas, yumurtalık vb.), kardiyovasküler hastalıklar ve artrit gibi birçok hastalığın ilerlemesi ile ilişkilidir. Bu tez çalışmasında, Ficus Deltoidea (FD) yaprak ekstraktının MMP-9 üzerindeki inhibitör etkilerini ve bu etkilerin moleküler mekanizmalarının araştırılması amaçlanmaktadır. Böylece FD yaprak ekstraktında bulunan biyoaktif bileşikler olan viteksin ve isoviteksin'in MMP-9 üzerinde inhibitör bir etkisi olup olmadığı incelenecektir. DFT yöntemi kullanılarak en düşük enerji seviyeli yapılar oluşturularak ve bu yapıların, HOMO-LUMO analizi, UV hesaplamaları ve NBO yükleri hesaplanmıştır. Elde edilen sonuçlar ile bu bileşiklerin MMP-9 ile olan etkileşimleri analiz edilmiştir. Sonuçlar, Ficus Deltoidea yaprak ekstraktında bulunan viteksin ve isoviteksin'in MMP-9 enzimini inhibe edebileceğini ve bu bileşiklerin potansiyel biyolojik ajanlar olarak tıbbi uygulamalarda kullanılabileceğini göstermektedir. DFT hesaplamaları, bu bileşiklerin moleküler özelliklerini ve MMP-9 ile olan etkileşimlerini detaylı bir şekilde ortaya koymaktadır. Zn içeren komplekslerin kararlılığının özellikle su ve metanol gibi polar çözücülerde arttığı gözlemlenmektedir. Komplekslerin kararlılığını artırarak daha düşük enerjili yapılar oluşturmasına yardımcı olmaktadır. Bu tez araştırmasında su ve metanol çözücü ortamında oluşturulan komplekslerin daha kararlı yapılar oluşturduğu ve hidrojen bağı ile stabilite kazandığı gözlemlenmektedir. Elde edilen sonuçlar viteksin ve isoviteksin'in MMP-9 enzimini inhibe ettiğini ve viteksin'in MMP-9 ile daha kararlı kompleks oluşturduğunu göstermektedir.
Koroner arterlerinde aterosklerozu bulgusu olan dokularda ağır metal birikiminin moleküler yöntemler ile incelenmesi
Kardiyovasküler hastalığı olan kişilerde bakır ve demir seviyelerinde artış olduğunu gösteren çalışmalardan yola çıkılarak koroner aterosklerozu olan ve olmayan insanlardan alınan otopsi dokularında Spectro ICP-OES cihazı ile doku içeriğindeki elementler incelenmiştir. Çalışmamızda koroner arter dokularındaki elemental kompozisyon belirlenmiştir. Aterosklerotik hastaların koroner arterlerinde ağır metal birikimi olduğu ortaya konulmuştur. Koroner damarlarda tedavi şu anda bölgesel stent veya koroner baypas şeklinde olup damarlardaki yaygın ateroskleroz göz ardı edilmekte ve etkili tedaviler bulunmamaktadır. Çalışmada ayrıca koroner aterosklerozun ameliyatsız çözümü ile ilgili koroner darlık bulunan dokular eşit iki parçaya ayrılmış ve bir parçasına fosfatidilkolin/deoksikolat uygulaması yapılıp aterosklerotik plak değişimleri yapılmayan parça ile karşılaştırılmıştır. Diğer parça kontrol grubu olarak değerlendirilmiş ve serum fizyolojik uygulanmıştır. Fosfatidilkolin/deoksikolat uygulamasının aterosklerotik plakların belli bölgelerindeki materyalleri mikroskobik gözlemde belirgin bir şekilde çözdüğü tespit edilmiştir. Uygulama yapılan dokulardan kesit alınmış histolojik boyamalar yapılıp mikroskopik incelemesi yapılmıştır. Fosfatidilkolin/deoksikolat uygulamasının hücrelere zarar vermeyip hücreler arasında biriken asellüler maddeleri çözdüğü gözlenmiştir. Aerosklerotik hastaların koroner arterlerindeki ağır metal birikimi ile ilgili bu çalışmayla literatüre katkıda bulunulmuş ve koroner arter darlığını ameliyatsız, stentsiz çözmek veya hastalarda darlık gelişimini engelleyecek erken tedavilere öncülük edecek solüsyon kombinasyonu geliştirilmesi için uygulama yapılmıştır. Anahtar Kelimeler: Koroner ateroskleroz, Ağır metal, Esansiyel olmayan geçiş metalleri, Fosfatidilkolin/deoksikolat
Patojen ilişkili protein 1 (pr-1) genlerinin karpuz bitkisinde (Citrullus lanatus (Thumb.) Matsum. & Nakai) genom çapında in-silico analizi
Karpuz (Citrullus lanatus (Thumb.) Matsum. & Nakai) ekonomik açıdan önemli ve dünya çapında sevilerek tüketilen bir tarım bitkisidir. Karpuz üretiminde abiyotik faktörlerle beraber biyotik faktörler önemli derecede sınırlayıcı etkiler gösterebilmektedir. Patojen ilişkili (PR) proteinler biyotik faktörler sınırlayıcı stres faktörlerine karşı bitki savunma sisteminde önemli görevler yapan proteinlerdir. Biyotik faktörlere karşı dirençli bitkilerin geliştirilmesi ve seçimi amacıyla PR ailesinden olan PR1 proteinlerinin C. lanatus genomunda in-silico analizi gerçekleştirilmiştir. Gerçekleştirilen analizlerde 19 adet PR1 geni tanımlanmıştır. Çoğunlukla tek ekzon taşıyan genler 14-25 kDa aralığında PR1 proteinlerinin (CsPR1) üretimini sağlamaktadır. PR1 proteinlerinin genellikle suda çözünebilir ve hücre dışı boşlukta yer alan proteinler olduğu tahmin edilmiştir. Proteinler antifungal, antibakteriyel ve antiviral özellikler kazandıran CAP_PR-1 (IPR001283/ Allergen V5/ Tpx-1-related) domaini taşıdığı belirlenmiştir. Proteinlerin korunmuş motifler içerdiği görülmüştür. ClPR1 proteinlerinde patojen-protein etkileşiminde önem arz eden CAP1, CAP2, CAP3 CAP4 ve CBM bölgeleri proteinlerde yer aldığı görülmüştür. ClPR1 proteinlerinin NJ tabanlı filogenisinde 3 ana gruba ayrıldığı ve genlerinin çoğunun 2. kromozomda kümelendiği ve 2, 3, 4, 6, ve 10. kromozomlarda konumlandığı görülmüştür. Proteinlerin 3D yapıları daha 1CFE kodlu PR14A (Solanum lycopersicum) proteini homolojisine dayalı olarak üretilmiş ve analiz edilmiştir. Çalışmada özetle karpuz genomunda yer alan PR1 proteinlerinin identifikasyonu ve karakterizasyonu in-silico yöntemle gerçekleştirilerek elde edilen bilgiler daha sonraki moleküler geliştirme çalışmalarına katkı sağlanması amacıyla literatüre sunulmuştur. Anahtar Kelimeler: Biyotik faktör, bitki patojeni, tolerans, moleküler yanıt
Üçlü negatif meme kanseri hücre hattında kuersetin ve epigallokateşin gallatın kombine kullanımının doksorubisin üzerindeki etkinliğinin otofaji odaklı incelenmesi
Üçlü negatif meme kanseri (TNBC), özellikle 45 yaş altı genç kadınlarda görülen, yüksek metastaz ve mortalite oranı ile ilişkili, oldukça heterojen bir meme kanseri alt türüdür. ER, PR ile HER2 reseptör ekspresyonunun negatif olması ile karakterize edilen TNBC, hedefe yönelik etkin bir tedavi yaklaşımı bulunmaması nedeniyle genellikle ciddi yan etkilere sahip konvansiyonel kemoterapi ajanları ile tedavi edilmektedir. Kendi kendini yeme olarak da bilinen otofaji, hasarlı veya işlevini yitirmiş organellerin ve protein agregatlarının lizozomal enzimler aracılığıyla yıkılarak geri dönüştürüldüğü koruyucu bir süreçtir. Tümör gelişimini baskılayarak karsinogenezi engelleyici bir rol üstlenen otofaji, bazı durumlarda ise kanser hücrelerinin hayatta kalmasını destekleyerek tedavi direncini artırabilmektedir. Bu nedenle TNBC gibi oldukça agresif kanser türlerinin tedavisinde, tümör hücrelerini seçici olarak hedefleyebilen ve birçok hücresel yolak üzerinden etkinlik gösterebilen tedavi yaklaşımlarına ihtiyaç vardır. Polifenoller, antikanser, antioksidan ve kardiyoprotektif gibi birçok biyolojik etkiye sahip olan, pleiotropik doğal bileşiklerdir. Çalışmamızda TNBC'yi modelleyen MDA-MB-231 hücre hattına, agresif bir kemoterapi ajanı olan doksorubisinin güvenli doz seviyelerinde uygulanmasını sağlamak ve etkinliğini artırmak amacıyla, polifenolik bileşikler olan kuersetin ve epigallokateşin gallat (EGCG) ile kombine uygulaması gerçekleştirilmiştir. Maddeler farklı saat ve dozlarda MDA-MB-231 hücre hattına uygulanarak sitotoksik etkileri MTT test ile belirlenmiş ve üçlü bir kombinasyon oluşturulmuştur. Üçlü kombinasyonun %25 ve %40'lık dozları ile yapılan uygulamada, ATG-12, Ambra1 ve Beclin-1 (BECN1) otofaji genleri ile Bcl-2 antiapoptotik genin ekspresyon düzeyleri RT-PCR ile değerlendirilmiştir. Gen ekspresyon değişimleri, ACTB referans geni kullanılarak normalize edilmiş, ardından 48. ve 72. saatlerdeki değişimler karşılaştırılmıştır. Otofaji ve apoptoz yolağında etkili kilit genlerin ekspresyon seviyelerinde değişimler gözlemlenmiştir. EGCG ve kuersetinin sinerjistik etkisinin, doksorubisinin MDA-MB-231 hücre hattı üzerindeki etkinliğini artırabileceği ve tedaviyi tamamlayıcı bir yaklaşım olabileceği görülmüştür.
Regeneration of Cichorium intybus L. in tissue culture and analysis of its secondary metabolites
Cichorium intybus L. was collected from field and regenerated in vivo in soil and in vitro in three different media; Murashige and Skoog (MS), Gamborg B5 and White medium supplemented with different concentration and combinations of auxins and cytokinins. Callus production was also achieved in the basic media supplemented with plant growth regulators (PGRs). Plant was regenerated by direct organogenesis from leaf explant in MS and B5 medium supplemented with Indole-3-butyric acid (IBA), and Naphthalene acetic acid (NAA). Root and shoot regeneration occurred. Plantlets were maturated in growth chamber in sterile condition and acclimatized in laboratory in ambient conditions and transferred to soil. Callus was produced from leaf explant in MS, B5 and White medium supplemented with auxin, cytokinin and gibberellic acid. The best result for callus production was provided from MS medium supplemented with Indole-3-acetic acid IAA and Benzyl amino purine (BAP). Secondary metabolites provided from in vivo and in vitro samples were analysed by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and Spectrophotometry. Phenolic compounds (esculine, caftaric acide, chlorogenic acid and cichoric acid) were extracted in ethanol/water (80:20 v/v) and quantified by HPLC. Inulin was quantified by spectrophotometry. The highest caftaric acid concentration was found in flowers from in vivo samples. However, the highest concentration of esculine was found in leaf extract of in vitro regenerated plants. Chlorogenic acid concentration was higher in vivo samples then that of in vitro whereas chichoric acid concentration was found to be higher in in vitro samples than that of in vivo. Inulin was found to be higher in in vivo samples.
STZ ile deneysel diyabet oluşturulan sıçanlarda çedi otu (Prosopis farcta L.) bitkisinin meyve ve çekirdek liyofilize ekstraktlarının iyileştirici etkilerinin araştırılması
Bu çalışmanın amacı, streptozotosin (STZ) ile diyabet oluşturulan sıçanlarda çedi otu (Prosopis farcta L.) (PF) bitkisinin meyve ve çekirdeğinden elde dilen liyofilize ekstraktların antidiyabetik ve antioksidan etkilerinin araştırılmasıdır. Toksisite testi sonrası, 49 adet sıçan her grupta 7 adet olacak şekilde 7 gruba ayrıldı. Deneysel diyabet streptozotosin (STZ) [50 mg/kg, intra peritonal (i.p)] ile oluşturuldu. Çalışma, Kontrol grubu (KONT), Diabetes mellitus grubu (DM), Diabetes mellitus+Glibenklamid 3 mg/kg (DM+GLY-3), Diabetes mellitus+PF meyve 100 mg/kg (DM+PfM-100), Diabetes mellitus+PF meyve 400 mg/kg (DM+PfM-400), Diabetes mellitus+PF çekirdek 100 mg/kg (DM+PfÇ-100) ve Diabetes mellitus+PF çekirdek 400 mg/kg (DM+PfÇ-400). 21 günlük deneme sürecinde 5 günde bir sıçanların kan şeker düzeyleri ve haftalık canlı ağırlıkları kaydedildi. Muameleler sonunda, liyofilize ekstraktların antidiyabetik etkinliğinin göstergesi olarak, serum AST, ALT, ALP, LDH, TC, HDL-c, kreatinin (CRE), üre, ürik asit, insülin ve c-peptid, glikozillenmiş hemoglobin (HbA1c) ile ince barsak dokusu α-glukozidaz enzim aktivitesine tespit edildi. Keza, antioksidan etkinliğin göstergesi olarak, böbrek, ince bağırsak, eritrosit ve karaciğer dokusu örneklerinde CAT, SOD, GSH-Px, GST, GR, GSH enzim düzeyleri ve MDA içeriği ortaya kondu. Elde edilen sonuçlara göre, canlı hayvanların son ağırlıkları DM+PfM100, DM+PfÇ100 ve DM+PfÇ400 gruplarında başlangıç ağırlıklarına göre önemli düşüş gösterdi. Ayrıca, diyabet ile diyabetik bitki ekstratı ilave gruplarında AST, ALT, ALP, LDH, CRE, URE, ürik asit, α-glukosidaz ve HbA1c düzeyleri KONT grubuna göre önemli (p≤0.05) artış tespitedi. Diğer yandan, insülin, c-peptid ve bazı antioksidan enzim düzeyleri ise DM+PfM-400 grubunda KONT grubuna göre önemli (p≤0.05) artış bulundu. Bunlara ek olarak, dokulardaki MDA düzeyi DM+PfM grublarında düşerken, DM ve DM+MPfÇ gruplarında ise genel olarak arttı. Sonuç olarak; Prosopis farcta L. meyve ve çekirdek ekstraktlarının antioksidan etkilere sahip olabilirken, diyabetik komplikasyonlara karşı iyileştirici etkileri için kesin bir sonuç bulunamamıştır. Anahtar kelimeler: Diabetes mellitus, Prosopis farcta, Antidiabet, Antioksidan, Rat.
Van Gölü'ne dökülen akarsulardan Streptomyces türlerinin izolasyonu teşhisi ve moleküler tanısı
Bu çalışmada Van Gölü'ne dökülen akarsulardan alınan sediment örneklerinden Streptomyces türlerinin izolasyonu, teşhisi ve moleküler tanısı amaçlanmıştır. Van Gölü'ne dökülen akarsulardan toplamda 24 sediment örneği alınmıştır. Daha sonra örneklerin nem ve pH oranları tespit edilmiştir. Alınan örneklerden Streptomyces bakterilerinin izolasyonu yapılarak, bakterilerin saf kültürleri elde edilmiştir. Bu işlem sonucunda 179 Streptomyces bakterisi izole edilmiştir. Bütün bakterilere başta renk gruplandırması, degredasyon, azot kaynakları, karbon kaynakları, antibiyogram ve antimikrobiyal testler olmak üzere 77 test uygulanmıştır. Elde edilen sonuçlar IDENTAX Bacterial Identifier 1.2 programına aktarılıp bakterilerin benzerlik oranları tespit edilerek bilgisayar yardımı ile teşhis yapılmıştır. Majör testlerin sonuçlarına göre türlerin % 18.43'ü ve minör testlerin sonuçlarına göre türlerin %35.75'i %95 ve üzerinde benzerlik göstermiştir. Test sonuçları MVSP 3.2 bilgisayar programına girilerek benzerlik dendogramları oluşturulmuştur. Bu sonuçlara göre yedi minör, dört majör grup ve 16 tekli üye oluşmuştur. Ayrıca renk grubuna göre tespit edilen 7 türün taramalı elektron mikroskobu ile spor zincir morfolojisi tespit edilmiştir. 11 Streptomyces bakterisinin 16S rDNA gen bölgeleri PCR ve elektroforez işlemine tabii tutulduktan sonra sekans analizi yapılmıştır. Elde edilen diziler NCBI-GENBANK yardımıyla benzer dizilere sahip türler ile kıyaslanmıştır. 16S rDNA bölgeleri kıyaslanan bu türler MEGA 7 programına girilerek Maksimum Likelihood filogenetik ağacı oluşturulmuş ve türlerin filogenetik pozisyonları belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlara göre izolatlar ve benzelik gösterdikleri türler kıyaslandığında % 97.82 ile %100 arasında benzerlik oranlarının olduğu görülmüştür.
Determination of hepatoprotective and antioxidant role of thyme (Origanum onites L.) infusion against ethyl alcohol induced oxidative stress in rats
In this study, we aimed to determine the hepatoprotective and antioxidants role of thyme (Origanum onites L.) against ethyl alcohol (EtOH) induced oxidative stress in rats. Rats were divided into 4 groups with 7 rats in each and conducted as contro, 20% EtOH, 3% O. onites infusion and 3% O. onites + 20% EtOH groups. The hepatoprotective and antioxidant role of O. onites infusion supplementation was evaluated as liver damage biomarkers, antioxidant constituents and malondialdehyde. The obtained results, while there was a significant increase in the AST and ALT levels of 20% EtOH group in comparison with the control group and a significant decrease in the TP and TC content of 20% EtOH group according to control group. The 3% O. onites + 20% EtOH mixture infusion group caused a significant decrease in the AST levels in comparison with the 20% EtOH group whereas, a significant increase in the TP and TC content of 3% O. onites infusion + 20% EtOH group in comparison with the 20% EtOH group. Also, while EtOH significantly increased MDA contents in the liver, kidney and erythrocyte tissues in comparison to those of control. The O. onites Infusion supplemented groups significantly decreased MDA contents in all tissues comparison to those of 20% EtOH group. Furthermore, while EtOH caused fluctuations in the antioxidant defence system levels as a result of oxidative stress condition in rats. The definitive curative effects of the O. onites infusion on these fluctuations have not been determined. As a result, it was concluded that O. onites contents may have a hepatoprotective and antioxidant role against EtOH induced oxidative stress in rats.
Van Gölü'nden toplanan sediment örneklerinden metilotrofik bakterilerin izolasyonu ve karakterizasyonu
Bu araştırmada; metilotrofik bakterilerin izolasyonunda kullanılan sediment örneği Van Büyükşehir Belediyesi Atık Su Arıtma tesisinin açıldığı alandan sağlandı. Bu çalışmada metilotrofik bakterilerin izolasyonunda sadece bir izolatın % 1-5 oranında metanol içeren ortamda üredeği gözlemlendi. Halomonas S1 izolatı olarak adlandırılan bu izolatın morfolojik, fizyolojik, biyokimyasal özellikleri belirlenerek 16S rRNA gen bölgesinin dizi analizi gerçekleştirildi. İzolatlardan yalnız S1 kültürünün tek karbon ve enerji kaynağı olarak %1 metanol içeren besi yerinde üreyebildiği görüldü. Daha kesin bir sonuç elde etmek için S1 kültürü NMR tekniği kullanılarak test edildikten sonra S1 kültürürnün metanolü yegane enerji ve karbon kaynağı olarak kullanma yeteneğine sahip olduğu gözlemlendi. 16S rDNA gen bölgesi; filogenetik analizde 1202 nükleotit'lik bir bölgede kıyaslanan S1 izolatının, 16 nükleotid fark ve % 98.6 benzerlik ile Halomonas desiderata (NR 026274)'ya benzediği tespit edilmiştir. Aynı zamanda BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) programı kullanılarak Gen Bankasındaki veritabanı ile karşılaştırılması sonucu suşun %100 benzerlikle Halomonas desiderata olduğu bulunmuştur.
Türkiye'de yayılış gösteren Tricholoma (Fr) staude cinsine ait bazı türlerin filogenetik karakterizasyonları
Tricholoma (Fr) Staude cinsi Tricholomataceae familyasında sınıflandırılan ekonomik ve tıbbi değeri olan bir makrofungustur. Bu cinse ait morfoloik olarak tanımlanmış 16 tür ile 4 tanımlanamayan örneğin taksonomik ve evrimsel ilişkileri makroskobik (şapka, sap ve lamel), mikroskobik (spor, bazidyum, bazidyol ve marjinal hücreler) ve moleküler karakterler kullanılarak belirlenmeye çalışılmıştır. Türkiye'nin farklı bölgelerinden toplanan Tricholoma türlerine ait örneklerin filogenetik ilişkileri, nükleer DNA'ya ait iki farklı gen bölgesinin [ITS (İnternal Transcribed Spacer) ve LSU (Large Subunit)] çoklu dizi analizleri yapılarak belirlenmiştir. Türler arası evrimsel akrabalık ilişkileri, oluşturulan filogenetik ağaçlar yardımıyla değerlendirilmiş, makroskobik ve mikroskobik karakterler kullanılarak yapılan teşhisleri destekleyip desteklemediği araştırılmıştır. Kullanılan iki bölgeden ITS bölgesi en fazla varyasyon gösteren ve tür ayrımında daha belirleyici olan bölge olmuştur. Yapılan değerlendirmeler sonucunda teşhis edilen ve analizi yapılan tüm örneklerin Tricholoma alt cinsine ait oldukları ve bu alt cins içerisinde dört seksiyona (Genuina, Caligata, Tricholoma ve Terrea) ayrıldıkları belirlenmiştir. Genuina seksiyonu içerisinde yer alan Tricholoma sp. T.184 ve Tricholoma sp. T.685 örnekleri ile Terrea seksiyonunda yer alan T. sp. T.17 ve T. sp. T.718 örneklerinin makroskobik, mikroskobik ve moleküler verilere dayanarak dünya mikotası için yeni türler olabileceği sonucuna varılmıştır.
Obezite hastalarından gastrektomi operasyonu ile elde edilen mide dokularında glutatyon S-transferaz izozimlerinin aktivitelerinin ve toplam tiyol miktarlarının karşılaştırılması
Obezite, prevalansındaki yükselme eğiliminden, birçok hastalık ve mortalite ile ilişkili olmasından dolayı pek çok ülkede önemli bir halk sağlığı sorunu haline gelmiştir. Bu çalışmada endojen savunma mekanizmasının önemli üyeleri olan glutatyon molekülü ve glutatyon S-transferaz enzimi üzerine obezite ve ilişkili hastalıklarının etkisi araştırıldı. 39 obez hastasından alınan mide dokusu örnekleri homojenize edildi. GSH düzeyleri analiz edildi. GST enzim aktivitesi ELISA Mikroplaka Okuyucu sistemde CDNB, pNBC, EPNP substratlarına karşı okuma yapılarak belirlendi. Hastalar cinsiyet, yaş, hipertansiyon olgusu, diyabet olgusu ve aile öyküsü parametreleri göz önünde bulundurularak gruplandırıldı. Vücut Kitle İndeksi-GSH-Toplam GST aktivitesi ilişkisinde, toplam GST aktivitesinin yüksek ölçüldüğü durumlarda, GSH miktarı nispeten düşük olarak tespit edildi. Yaş-GSH ve toplam GST ilişkisinde yaş artışı ile beraber GSH düzeyi ve toplam GST aktivitesinde artış gözlendi. Cinsiyete göre yapılan karşılaştırmada, kadın hastalarda, üç farklı substratla ölçülen tüm aktivite değerlerine ait ortalamaların, erkeklerin ortalamalarından yüksek olduğu tespit edildi. Mevcut çalışma Türk popülasyonundaki obez hastaların mide dokularında GST enzim aktivitelerinin ve toplam tiyol miktarının yaş, cinsiyet, hipertansiyon olgusu, diyabet olgusu ve aile öyküsü parametrelerine göre gruplandırılıp karşılaştırıldığı ilk çalışma oldu. Bu çalışma Ankara Keçiören Eğitim ve Araştırma Hastanesi Baştabipliği Klinik Araştırmalar Etik Kurulu'nun 2012-KAEK-15/(1678) 1800 sayılı onayıyla gerçekleşmiştir.
Yeni benzotiyofen türevlerinin antioksidan kapasitelerinin ve GSTM2 izozimi üzerine etkilerinin tayini
Benzotiyofenler, son dönemde, ilaç olarak kullanılabilme potansiyellerinin test edilmesini amaçlayan projelerin konusunu oluşturmaya başlamıştır. Bu çalışmamızın ilk aşamasında, Reaxys® ile yapılan araştırmada daha önceden çalışılmadığı tespit edilmiş iki benzotiyofen türevinin antioksidan kapasiteleri ABTS, DPPH ve Galvanoksil olmak üzere üç farklı yöntemle tayin edildi. İkinci aşamada ise, bu türevlerin GSTM2 izozimi üzerine muhtemel inhibisyon/aktivasyon etkileri araştırıldı. Benzotiyofen türevlerinin ikisi de test edilen mevcut standart antioksidan maddelere kıyasla çok düşük kapasite göstermişlerdir. Türev-1 için ABTS prosedürü sonucunda EK50 değeri 42.52 μM olarak hesaplanmıştır. Ancak diğer iki metotla yapılan deneylerde EK50 değeri hesaplamamıza yetecek derecede yüksek % RSA değerleri izlenmemiştir. Türev-2 üzerinde yapılan testlerin hiçbirinde EK50 değerine ulaşılamamıştır. Türev-1 için Vmax değerinin azaldığı ancak Km değerinin değişmediği tayin edilmiş, SigmaPlot yazılımı tam yarıĢmasız inhibisyon modelini öngörmüştür. Türev-2 düşük konsantrasyonlarda aktivasyon, 5μM madde konsantrasyonundan sonra inhibisyon etki göstermiĢtir. Yazılım bu etkiyi tam yarışmalı ile tam yarışmasız arasında, muhtemel karışık modele uygun öngörmüĢtür. Anahtar kelimeler: ABTS, Benzotiyofen, DPPH, Galvinoksil, GSTM2, İnhibisyon modeli
Deve gülü bitkisinin in vitro rejenerasyonu, farklı vejetasyon dönemlerinde ve stres şartlarında fitokimyasal içeriğinin ve antioksidan kapasitesinin araştırılması
Deve gülü bitkisi (Alcea spp), halk arasında tonsilit, mide ve bağırsak ülseri, pnömoni, üriner sistem enfeksiyonları ve allopesi gibi çeşitli hastalıkların tedavisinde kullanılmaktadır. Deve gülü bitkisiyle ilk kez yapılan bu çalışmayla, in vitro rejenerasyonu, farklı vejetasyon dönemlerinde ve stres şartlarında fitokimyasal içeriği ve antioksidan kapasitesi incelenmiştir. Bitkinin tohum dormansisi ve kontaminasyonu engellenerek tohumlar % 86.67 oranında çimlendirilmiştir. Doku kültüründe en iyi kallus oluşumu 14 günlük kotiledonlardan 2mg/l 2,4 D içeren MS elde edilmiştir. Nod ve sürgün ucundan %100 oranında doğrudan rejenerasyon başarılmıştır. En yüksek FCR, FRAP ve ORAC değerleri Temmuz ayına ait infüzyon örneklerinde sırasıyla 16.538±0.019 GA.Eq. mg/gdrog, 225.691 µmol Fe+2/gdrog, 311.86±1.006 µmol TE/gdrog olarak tespit edilmiştir. En yüksek gallik ve klorojenik asit miktarları infüzyonu yapılan Temmuz (meyve) dönemi örneklerinde sırasıyla 0.779 mg/drog, kafeik asit ise Haziran dönemi örneklerinde 1.256 mg/drog. olarak tespit edilmiştir. Haziran ayında makro ve mikro elementler yüksek olarak belirlenmiştir. Ağır metaller ise vejetasyon dönemlerine göre anlamlı bir farklılık göstermemiştir. Doku kültüründe 0.5 mg/l NAA+0.5 mg/l BAP uygulanan örneklerin FCR, FRAP, ORAC ve fenolik asit miktarlarının doğal ortamdakine göre yaklaşık iki katına çıktığı tespit edilmiştir.
2,3-dialkinilik tiyofen türevlerinin radikal yakalama aktivitelerinin ve indirgeme gücü özelliklerinin belirlenmesi
Serbest radikaller, ortaklanmamış elektron bulunduran yüksek enerjili kararsız ara ürünlerdir. Bu ürünler bileşik halinde de bulunabilmektedir. Serbest radikaller, başta kanser olmak üzere karaciğer hastalıklarına sebep olmanın yanısıra DNA ve protein hasarlarınada yol açabilmektedir. Vücudumuzun savunma sistemi serbest radikalleri nötrleştirirken kullandığı moleküllere antioksidan denmektedir. Bu tez çalışmasında, sentetik kaynaklı dört farklı 2,3-dialkinilik tiyofen türevlerinin radikal yakalama aktiviteleri ve indirgeme gücü kapasiteleri beş farklı antioksidan kapasite yöntemi ile test edilmiştir. ABTS ve galvinoksil yöntemlerinde test edilen maddelerin EK50 değerleri dikkate alınarak sıralandığında, ABTS metodunda madde 4 > madde 2 > madde 1 > madde 3 iken galvinoksil metodunda ise madde 4 > madde 3 > madde 1 > madde 2 olduğu tespit edildi. Buna karşın, test edilen dört farklı dialkinilik tiyofen türevinin DPPH radikali ile reaksiyona girmediğinden bu yöntem ile antioksidan kapasiteleri tespit edilemedi. Fosfomolibden ve FRAP yöntemlerinde ise maddelerin indirgeme aktiviteleri tespit edildi. Fosfomolibden yöntemi sonuçlarına göre test edilen türevler indirgeme akitivitesine göre sıralandığında madde 4 > madde 1 > madde 2 > madde 3 olarak tespit edildi. Son olarak, FRAP yönteminde ise iki dialkinilik tiyofen türevi bu yöntemle indirgeme aktivitesi göstermiştir. Bunlar, madde 4 ve madde 2'dir. Madde 4 (103,22 µM madde 4 1,49 µM troloksa denk geldi)'ün madde 2 (128,03 µM madde 2 0,34 µM troloksa denk geldi)'ye göre daha aktif olduğu tespit edildi. Buna karşın, madde 1 ve madde 3 FRAP yönteminde herhangi bir indirgeme aktivitesi göstermediği tespit edildi. Anahtar kelimeler: Antioksidan, Antioksidan kapasite, Tiyofen türevleri.
Streptozotosin ile diyabet oluşturulan ratlarda hanzabel (Achillea arabica) bitki ekstraktının antidiyabetik ve antioksidan etkilerinin araştırılması
Achillea arabica, halk hekimliğinde yaygın olarak kullanılan çok yıllık aromatik bir bitkidir. Bu çalışmada, streptozotosin (STZ) 50 mg/kg ile diyabet oluşturulan sıçanlarda A. arabica çiçek etanolik liyofilize ekstresinin antidiyabetik, antihiperlipidemik ve antioksidan etkileri değerlendirildi. Toksisite testinden sonra otuz beş dişi rat beş gruba ayrıldı. Kontrol, Diabetes mellitus (DM), A. arabica (400 mg/kg ekstre), DM+A. arabica (400 mg/kg ekstre) ve DM+Glibenklamid (2 mg/kg). 21 günlük tedavinin sonunda, hem A. arabica ekstresi hemde glibenklamid diyabetik gruplarda glukoz ve glikolize hemoglobin (HbA1c) seviyelerinde DM grubuna göre önemli düşüş gösterdi. A. arabica ekstresi ile tedavi edilen diyabetik grupta, malondialdehit içeriği, serum aspartat aminotransferaz, alanin aminotransferaz, laktat dehidrojenaz, alkalan fosfataz, kreatinin, üre, trigliserit, kolesterol, düşük yoğunluklu lipoprotein kolesterol düzeylerindeki azalma ve redükte glutatyon (GSH) artışı anlamlı bulundu. Ayrıca, karaciğer ve böbrek dokularının antioksidan enzim aktiviteleri genellikle değişmezken, böbrek dokusunun glutatyon S-transferaz aktivitesi DM grubu ile karşılaştırıldığında tedavi gruplarında anlamlı bir düşüş gösterdi. Bu bulgular A. arabica ekstresinin karaciğer ve böbrek fonksiyon bozukluğu ve diyabetin neden olduğu oksidatif stres üzerinde, muhtemelen antioksidan ve antidiyabetik etkilerinden dolayı terapötik bir etkiye sahip olduğunu göstermiştir. A. arabica çiçek ekstresi, diyabet ve hiperlipidemi ilaçları geliştirmek amacıyla doğal bir kaynak olarak kullanılabilir. Anahtar kelimeler: Achillea arabica, Antioksidan, Diabetes mellitus, Lipit peroksidasyonu, Liyofilize ekstre, Rat.
Salisilik asitin buğday çiminin oksidatif stres indeksine ve DNA koruyucu aktivitesine etkilerinin araştırılması
Buğday çimi yüksek miktarlarda klorofil, E vitamini ve C vitamini içeriğinden dolayı yüksek antioksidan özelliğe sahip olup bazı hastalıkların (anemi, diyabet, kanser) tedavisinde kullanıldığını belirtilen in vitro ve in vivo çalışmalar mevcuttur. Bu çalışmanın amacı, farklı salisilik asit konsantrasyonları (Kontrol (distile su), SA-2 (10-2 M), SA-4 (10-4 M), SA-6 (10-6 M), SA-8 (10-8 M), SA-10 (10-10 M) ve SA-12 (10-12 M)) kullanılarak şişirilen tohumlardan büyütülen buğday çiminin oksidatif stres indeksine ve DNA koruyucu özelliğine etkilerini araştırmaktır. Bunun yanında, buğdaylar su kültüründe 10 gün büyütüldükten sonra, bazı fizyolojik parametrelere, pigment içeriğine, bazı oksidatif stres metabolitlerine antioksidan savunma enzimlerinin aktivitelerine etkileri araştırıldı. Çimlenme oranlarına göre SA-2 uygulamasının çimlenmeyi engellediği bulundu. SA-12 uygulaması sürgün boyunun kontrole göre uzamasına yol açtı. Salisilik asitin farklı konsantrasyonu uygulamaları kök uzunluğunda artışa sebep olurken, kök yaş ağırlığında da artış olduğu bulundu. SA-8 uygulamasının toplam antioksidan seviyesinde artışa sebep olduğu ve oksidatif stres indeksini düşürdüğü bulundu. Katalaz aktivitesinde SA-6 uygulamasının kontrole göre anlamlı artışa sebep olduğu bulundu. Liyofilize buğday çimi ektresinin pUC19 plazmitini Fenton reaksiyonu ile oluşturulan hidroksil radikallerinin zararlı etkilerinden koruduğu gözlendi. Salisilik asit uygulanan buğday çiminin toplam antioksidan seviyesinin artışına yol açarak oksidatif stres indeksini düşürdüğü ve DNA koruyucu etkiye sahip olabileceği sonucuna ulaşıldı. Anahtar kelimeler: DNA koruyucu etki, Ekmeklik buğday, Oksidatif stres indeksi, Salisilik asit
Yeni sentezlenen indol türevlerinin antioksidan kapasitelerinin belirlenmesi ve insan karaciğer kanser hücrelerine etkilerinin araştırılması
Son yörüngelerinde eşlenmemiş elektron içeren serbest radikaller kararsız moleküllerdir. Kararlı hale geçmek için diğer moleküllerden elektron almaya çalışırlar. Bunun sonucunda istenmeyen oksidasyon reaksiyonlarına neden olarak DNA hasarı, lipit peroksidasyonu, protein modifikasyonları gibi çeşitli hücresel hasara yol açarlar. Serbest radikallerin zararlı etkilerine karşı vücudun savunma sistemine antioksidanlar denmektedir. Antioksidan moleküller serbest radikalleri kendine bağlayarak, onlara hidrojen aktararak yada serbest radikallerin zarar verdiği biyomolekülleri onararak serbest radikallerin zararlı etkilerini engellerler. Antioksidanlar, glutatyon-S-transferaz gibi enzimatik yapıda yada C vitamini gibi enzimatik olmayan bir yapıda olabilir. Bu tez çalışmasında ilaç olma potansiyeli taşıyan yeni sentezlenmiş iki farklı indol türevinin (3-Bromo-1-etil-2-fenil-1H-indol) madde 1 ve (1-etil-2-fenil-3feniletilin1-H-indol) madde 2 antioksidan kapasiteleri 5 farklı (DPPH, ABTS, Galvinoksil, Fosfomolibden ve FRAP) antioksidan kapasite metoduyla belirlendi ve bu maddelerin sitotoksisite analizleri ile bu maddelerin HepG2 hücre hatlarındaki GST spesifik aktivitelerine etkileride araştırıldı. Çalışmanın sonucunda 5 farklı antioksidan kapasite belirleme yöntemiyle madde 1'in aktivitesi analiz edilmesine karşın sadece total antioksidan aktivitesi belirlenebildi. Total antioksidan aktivite sonucu troloksa göre değerlendirildiğinde, Madde 1'in test edilen konsantrasyonları (333,3-1333,3 µM) 33,43 ile 38,04 kat troloks'tan daha düşük antioksidan potansiyele sahip olduğu belirlendi. Buna karşın, Madde 2'nin test edilen en yüksek konsantrasyonundaki (3000 µM) ABTS sonucu ise oranı ise 0,016 olup troloksun 5.17 oranına kıyasla oldukça düşük olduğu tespit edildi. Fosfomolibden metodunda ise Madde 2'nin troloks standardının bileşiğinin 1.22 katına karşılık gelerek toplam antioksidan kapasite değerinin troloks bileşiği değerine yakın olduğu belirlendir. FRAP metodunda ise madde 2'nin 133,33 µM konsantrasyonun 33.83 µM troloks konsantrasyonuna karşılık geldiği hesaplandı. Bu sonuca göre madde 2 nin antioksidan kapasitesine sahip olduğu ancak bu antioksidan kapasitesinin troloks standardına göre düşük olduğu belirlendi. Buna karşın, DPPH ve galvinoksil metotlarında ise test edilen maddeler antioksidan aktivite göstermedikleri tespit edildi. GST aktivite ölçümlerinde ise kontrol ve Madde 1 ile muamele edilen hücreler için toplam GST aktiviteleri sırasıyla 14.8 ± 2.4 ve 0.79 ± 0.04 nmol/min/mg protein olarak bulundu. Bu sonuçlar Madde 1'in GST enzim aktivitesinde % 94.7 azalmaya neden olduğunu göstermiştir. Madde 2'nin (25 ve 50 µM) GST enzim aktiviteleri analiz edilmiş her iki doz uygulama sonucunda GST enzim aktiviteleri sırasıyla 21.6 ± 2.5 ve 19.3 ± 0.95 nmol/min/mg protein olarak bulundu. Madde 2 düşük 25 µM konsantrasyonda HepG2 hücre hattında GST aktivitesinin istatistiksel olarak anlamlı indüksiyonuna neden oldu. Sitotoksisite testi ile bu çalışmada test edilen indol türevleri (Madde 1 ve Madde 2) hücre canlılık oranlarına bakıldığında, Madde 1'in EC50 değeri HepG2 hücre hattında 92 µM olarak bulundu. Buna karşın, Madde 2'nin test edilen dozlarda (6,25-250 µM) istatistiksel olarak anlamlı herhangi bir sitotoksik aktivite gözlemlenmemiştir.
Astragalus davisii chamb. & matthews (Erek geveni) ve astragalus gymnalopecias rech.fil. (Müküs geveni) bitki ekstrelerinin antioksidan kapasite tayini ve kanser hücre hatlari üzerine sitotoksik etkileri
Astragalus cinsi, tıbbi etkileri olan ve kullanımı 2000 yılı aşkın bir süre öncesine dayanan, Fabaceae (Baklagil) ailesindeki çiçekli bitkilerin en büyük cinslerinden biridir. Literatürde Astragalus cinsinin çeşitli türlerinin, antioksidan, antikanser, antidiyabetik, antiviral, immünomodülatör, kardiyoprotektif, hepatoprotektif gibi özellikleri bildirilmiştir. Astragalus davisii (Erek geveni) ve Astragalus gymnalopecias (Müküs geveni), Van İli'nde yayılış gösteren endemik türlerdendir ve Van ilinde bu türlerin potansiyel tedavi edici etkilerinin araştırıldığı herhangi bir çalışmaya rastlanılmamıştır. Bu çalışmada, A. davisii ve A. gymnalopecias türlerinin çeşitli organlarından (kök, yaprak, çiçek) elde edilen hidrometanollü özütlerinin antioksidan potansiyellerini belirlemek ve bu özütlerin, kanserli hücre hatları üzerinde sitotoksik etkilerini açığa kavuşturmak amaçlanmıştır. A. davisii ve A. gymnalopecias bitki özütlerinin antioksidan aktivitelerinin belirlenmesinde, iki raikal süpürme deneyi (DPPH ve ABTS), toplam fenolik ve toplam flavonoid madde miktarlarının belirlenmesi ve metal şelatlama aktivitesi deneyleri uygulanmıştır. Ayrıca özütlerin potansiyel sitotoksik etkileri, MCF-7 (meme kanser hücresi) ve HT-29 (kolon kanser hücresi) hücreleri üzerinde değerlendirilmiş ve bunun için XTT deneyleri yapılmıştır. Özütlerin DPPH. ve ABTS.+ radikallerini süpürme aktiviteleri göz önünde bulundurulduğunda, konsantrasyona bağlı artış görülmüştür. Ayrıca en düşük IC50 değeri DPPH için A. gymnalopecias yaprağında (5.58±0.22 mg/ml), ABTS.+ için ise A. davisii yaprağında (5.54±1.06 mg/ml) bulunmuştur. En yüksek toplam fenolik içerik, A. davisii'nin çiçek özütünde (217.97±2.82 μg gallik asit eşdeğeri /mg özüt) görülmüştür. En yüksek toplam flavonoid içerik, yine A. davisii'nin çiçek özütünde (1303.47±20.13 μg kuersetin eşdeğeri/mg özüt) bulunmuştur. Metal şelatlama aktivitesi göz önünde bulundurulduğunda, en düşük IC50 değeri A. gymnalopaecias çiçeğinde (2.80±1.39 mg/ml) tespit edilmiştir. MCF-7 ve HT-29 üzerindeki sitotoksik aktivitelerin incelenmesinde A. davisii ve A. gymnalopecias bitkilerinin hidrometanol çiçek özütleri kullanılmıştır. Bitki özütlerinin MCF-7 hücreleri üzerindeki sitotoksik etkisinin, uygulanan doza ve inkübasyon süresine bağlı olarak arttığı ve kanser hücrelerinin canlılığını düşürdüğü tespit edilmiştir. En düşük IC50 değeri, 72 saatlik inkübasyon süresi ve maksimum konsantrasyon (12.5 mg/ml) ile A. davisii'de (6.49±0.53 mg/ml) görülmüş olup, A. davisii'nin en yüksek sitotoksik etkiye sahip olduğu bulunmuştur. Özütlerin HT-29 hücreleri üzerindeki sitotoksik etkisi 24 saatlik uygulama süresinde ve yine A. davisii'de (IC50, 3.93±0.51 mg/ml) yüksek bulunmuştur. ii Bu çalışmada elde edilen verilere göre çalışılan konsantrasyonlarda A. davisii ve A. gymnalopecias özütlerinin, yüksek antioksidan ve sitotoksik aktivite gösterdiği ve tamamlayıcı tedaviye katkı sağlayabilecek potansiyele sahip olduğu sonucuna varılmıştır. Anahtar kelimeler: Antioksidan, Astragalus davisii, Astragalus gymnalopecias, Sitotoksisite, Toplam fenol, Toplam flavon
Ratlarda parasetamol ile indüklenen karaciğer hasarına karşı çöven otu (Gypsophila bicolor) bitki ekstrelerinin koruyucu etkinliğinin araştırılması
İlaca bağlı gelişen karaciğer hasarı, karaciğer hasarının en sık nedenlerinden birisidir ve tüm Dünya'da yüzbinlerce kişinin ölümüne yol açan küresel bir sağlık sorunudur. Günümüzde ilaca bağlı gelişen hepatotoksisiteye karşı etkili bir önlem mekanizması ya da çözüm yolu henüz tam anlamıyla bulunmamıştır, ancak araştırmalar devam etmekte ve daha fazla ilerleme kaydedilmektedir. Bu bağlamda, Gypsophila bicolor'un da içeresinde yer aldığı Gypsophila cinsi dünya halk hekimliğinde bitkisel ilaç olarak kullanıldığı bilinmesine rağmen, FDA (Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi) onaylı saponin bazlı bir ilaç bulunmamaktadır. Bunun için, son yıllarda önemli derecede yan etkilere sahip olan biyofarmasötiklerin istenmeyen yan etkilerini azaltıp, hücresel düzeylerdeki etkinliğini arttırarak biyoyararlanımını ve buna bağlı olarak da terapötik etkinliğini arttırıp, etkin ve güvenli tedavi sağlamak amacıyla nanoteknolojiden faydalanılarak nanopartiküler ilaç taşıyıcı sistemler araştırılmakta ve yeni çözüm yolları geliştirilmektedir. Bu sistemlerin sağlık alanına taşınması ise yeni teşhis ve tedavi yöntemlerinin geliştirilmesinde umut verici bir ışık olarak görünmektedir. Bu bilgiler ışığında bu çalışmada, ratlarda parasetamolle oluşturulan karaciğer hasarı üzerine Gypsophila bicolor bitki ekstresinin ve katı lipit nanopartikül (KLN) ile enkapsüle edilen nanopartikül formlarının hepatotoksisiteye karşı hepatoprotektif etkisinin biyokimyasal, histopatolojik ve moleküler olarak belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu bitki ekstresinin KLN şeklinde formüle edilmesi ile yüksek etkinliğe sahip, kararlı ve yan etkileri düşük sistemlerin oluşturulması hedeflenmiştir. Çalışmanın ilk aşamasında, Gypsophila bicolor ekstresi ile yüklü katı lipit nanopartikül (GBE-KLN) mikroemülsiyon ve ultrasonikasyon yöntemiyle hazırlandı. Yapılan lazer kırınımı analizine göre bu partiküllerin nano boyutta dağılım gösterdiği ve negatif yükle yüklü olduğu, FT-IR (kızıl ötesi spektroskopisi) analizine göre Gypsophila bicolor ekstresinin katı lipit nanopartiküllere enkapsüle edildiği, SEM görüntülerine göre küresel ve nanoboyutta olduğu, TG analizine göre ise GBE-KLN'nin sıcaklığa karşı stabil olduğu sonucuna varıldı. Çalışmanın daha sonraki aşamasında ise parasetamol ile indüklenen karaciğer hasarı oluşturulmuş ratlar üzerinde in vivo çalışmalar gerçekleştirildi. Deneysel uygulama öncesi bitki ekstreleri için uygun dozlar akut toksisite testi ile belirlendi. 21 günlük muamelede kullanılan 64 adet Wistar albino erkek sıçanlar rastgele 8 gruba ayrıldı (n=8). Normal kontrol grubu hariç tüm gruplara son uygulamadan 1 saat sonra 2 g/kg dozunda 2 ml 1X PBS (%1'lik CMC içeren)'de hazırlanan parasetamol çözeltisi gavaj ile oral yoldan verildi. Kontrol hariç diğer gruplardaki uygulamalar da yine oral olarak gerçekleştirildi. Parasetamol uygulamasından 24 saat sonra ratların serum ve karaciğer doku örnekleri elde edildi. Serum örneklerinde karaciğer fonksiyon testleri ve karaciğer dokusunda ise antioksidan enzim aktivitelerinden katalaz (CAT), süperoksid dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz ii (GSH-Px), glutatyon redüktaz (GR) ve glutatyon S-transferaz (GST) ile redükte glutatyon (GSH) ve malondialdehit (MDA) seviyeleri ölçüldü. Ayrıca karaciğer dokularında TNF-α'nın ekspresyon seviyesi ve karaciğer dokularının histolojik değişiklikleri de incelendi. Elde edilen sonuçlar incelendiğinde, parasetamol toksisitesi ile artmış olan Alanin aminotransferaz (ALT), Aspartat aminotransferaz (AST) ve Alkalen fosfataz (ALP) değerlerinin Gypsophila bicolor ekstresi ile nanopartikül formlarının uygulandığı guruplarda önemli derecede azaldığı gözlemlendi. Yine yapılan biyokimyasal analizlere göre parasetamol alan grupta enzim aktivitelerinin (CAT, SOD, GSH-Px, GR ve GST) ve GSH seviyelerinin azaldığının MDA seviyesinin ise artmış olduğunu buna karşılık Gypsophila bicolor bitki ekstresinin ve nanoformlarının verildiği gruplarda bu enzim aktivitelerinin ve GSH seviyelerinin artmış olduğunu MDA seviyesinin ise azaldığını gözlemledik. 100 mg/kg dozunda Gypsophila bicolor ekstresi ile yüklü katı lipid nanopartikül (GBN100) uygulanan sıçan karaciğer dokularında yapılan histopatolojik değerlendirmelerde neredeyse hiç patolojik bulgulara rastlanmadı ve kontrol grubuna en yakın sonuçlar elde edildi. Kontrol grubuna göre parasetamolün ratların karaciğer dokusunda TNF-α ekspresyonunu önemli ölçüde arttırarak parasetamolün neden olduğu karaciğer hasarında yer alan inflamatuar reaksiyonu ortaya çıkardığını buna karşılık Gypsophila bicolor ekstresinin katı lipid nanopartikül şeklinde verildiği gruplarda (GBN50 ve GBN100) TNF-α'nın overexpresyonunu belirgin bir şekilde inhibe ettiğini gözlemledik. Sonuç olarak; Gypsophila bicolor ekstresi ile yüklü katı lipid nanopartikül uygulamasının parasetamol ile indüklenen karaciğer hasarına karşı proinflamatuar sitokinlerden olan TNF-α'nın ekspresyon seviyesini azaltarak, karaciğer morfolojisini önemli ölçüde iyileştirerek ve antioksidan sistemi aktive ederek karaciğer hasarını hafiflettiğini ve dolayısıyla hepatoprotektif ve antioksidan etkiye sahip olabileceğini söyleyebiliriz. Özellikle ilaca bağlı gelişen karaciğer hasarının tedavisine ilişkin gelecekteki araştırmalar için bir temel sağlayabilir.
Enkapsüle edilmiş miR-3670, miR-8078 temelli tedavi yaklaşımının meme kanserinin immünoterapisindeki etkinliğinin araştırılması
Bu çalışmada amaç, MCF-7 meme kanseri hücrelerinde aşırı eksprese edilen bir immün kontrol noktası olan PD-L1'in ekspresyonunu mikroRNA-3670 (miR-3670) ve mikroRNA-8078 (miR-8078) kullanarak inhibe etmek ve meme kanserindeki immünoterapötik özelliklerini araştırmaktır. Biyoinformatik analizlerimiz sonucunda miR-3670'in PD-L1 mRNA'nın iki farklı bölgesine yüksek bağlanma skorlarıyla (82.15 ve 87.35) bağlanabildiği, PD-L1 ligand sentez yolaklarını ve kanser hücrelerinin temel düzenleyici yolaklarını önemli ölçüde hedef aldığı ve meme kanserinde PD-L1 ekspresyonunu etkili bir şekilde baskıladığı tespit edilmiştir. Sitotoksisite analizi, her iki miRNA'nın 1nM dozunun MCF-7 hücre hattında yüksek toksisite sergilerken, sağlıklı bir meme dokusu hücre hattı olan HME1'de daha az toksik olduğunu tespit edilmiştir. Total RNA analizleri, toplam RNA konsantrasyonları ile sitotoksisite seviyeleri arasında anlamlı bir korelasyon olduğunu belirlemiştir. Yüksek sitotoksik dozlarda toplam RNA miktarında bir azalma gözlenirken, düşük sitotoksik dozlarda bir artış belirlenmiştir. RT-PCR ve ELISA analizlerimize dayanarak, miRNA-3670 ve miRNA-8078 mimiklerinin 1 nM dozlarının MCF-7 hücrelerinde hem PD-L1 gen ifadesini hem de sPD-L1 protein seviyelerini azalttığı tespit edilmiştir. Ancak, HME1 hücreleri üzerinde anlamlı bir etki tespit edilememiştir. MCF-7 hücrelerinde, miR-3670 ve miR-8078 hücre sağkalımını azaltıp apoptozu tetiklerken, HME1 hücrelerinde anlamlı bir farka neden olmamıştır. Hücre göçü analizimize göre, miRNA'lar MCF-7 hücrelerinde hücre göçü üzerinde güçlü bir inhibitör etkiye sahipti (sırasıyla %81.47 ve %99.8) ve anti-metastatik özellik sergilemiştir. Tersine, HME1 hücrelerinde hücre göçünü inhibe edemediği (sırasıyla %22.8 ve %6.2) tespit edilmiştir. Morfoloji ve biyoinformatik analizlere (KEGG ve GO) dayanarak, her iki miRNA da lamellipodia varlığında önemli bir düşüşe yol açarak MCF-7 hücrelerinde EMT'den MET'e geçişe neden olduğu tespit edilmiştir. Ancak, HME1 hücrelerinde görünür morfolojik değişiklikler gözlenmemiştir. Metastazla ilişkili parametreler üzerinde yapılan ELISA analizlerine göre, MCF-7 ve HME1 hücrelerinde miR-3670 ile miR-8078'in 1nM dozu serbest e-kaderin antijen seviyelerini önemli ölçüde azalttığı tespit edilmiştir. Ayrıca, miR-3670 ve miR-8078'in MCF-7 ve HME1 hücrelerinde sVEGF-A seviyesinde ve sTINAGL-1 antijen seviyesinde azalmaya neden olduğu bulunmuştur. miR-3670 ve miR-8078'in MCF-7 hücrelerinde koloni oluşumunu sırasıyla %17.7 ve %78.2'lik bir azalma ile önemli ölçüde engellediği belirlenmiştir. MCF-7 hücre hattında 3D sferoid oluşumunu %90 oranında engellediği ve tipik olarak elipsoid şekilli 3D sferoidlerin aksine amorf sferoidlerin (sırasıyla %13 ve %22) gelişmesine neden olduğu tespit edilmiştir. Oluşturulan 3D sferoidlerin boyutunun 100 µm'nin altında kaldığı ve hacimlerinin 1 mm3 ten az olduğu tespit edilmiştir. HME1 hücre hattında 3D sferoid yapı gözlenmemiştir. Sonuç olarak; miRNA'ların (miR-3670, miR-8078), meme kanseri hücrelerinde bağışıklık tepkilerinin yeniden yönlendirilmesi yoluyla kanser immünoterapisi için potansiyele sahip olabileceğini göstermiştir. Özellikle mevcut kanser tedavisi yaklaşımlarında giderek daha önemli hale gelen kişiselleştirilmiş kanser immünoterapisi de ve hedefe yönelik tedaviye ilişkin gelecekteki araştırmalar için bir temel sağlayabilir.
Ardıç (Juniperus oxycedrus L. ssp. oxycedrus) bitkisi biyopolimerinden nanopartikül sentezlenmesi, karakterizasyonu ve antioksidan etkisinin incelenmesi
İnsanoğlu ilk çağlardan beri çevresindeki bitki, mantar ve diğer canlıları kendi amaçları için kullanmaya başlamış ve zamanla hangisinin hangi amaçlar için kullanacağını öğrenmiştir. Bitkiler tarafından üretilen maddeler diğerlerine göre daha fazla önem kazanmış ve saflaştırılmaya başlanmıştır. Bugün kullanılan ilaçların büyük bir kısmı ya bitki ekstraktlarından elde edilen bileşikler ya da bu bileşiklerin türevleridir. Son zamanlarda teknolojik gelişmeler ile beraber bu bileşiklerden nanopartiküllerin sentezlenmesine olan ilgi artırmıştır. Bu doktora tezi kapsamında tıbbi ve farklı kullanım alanları olan ardıç (Juniperus oxycedrus L. ssp. oxycedrus) türünün meyve metanol ekstraktı (AE), ekstraktan elde edilen amentoflavone ve cuprassoflavone karışımı (AC) ve bunlardan elde edilen nanopartiküllerin (p(AE), p(AC)) sentezlenmesi hedeflenmiştir. Kullanılan bu malzemelerin kan uyumluluk testleri, antibakteriyel ve antioksidan özellikler araştırılmıştır. Sentezlenen nanopartiküllerin yüzey yükü ve boyut analizi, sıcaklığa bağlı yapısal bozunma davranışları, olası bağ yapıları ve morfolojik özellikleri çeşitli enstrümental analiz cihazları kullanılarak incelendi. Sentezlenen nanopartiküllere ayrıca ağrı kesici (parsetamol) ve antikanserojen (5-fluorouracil (5-Fu) ve Paklitaksel) ilaçlar yüklendi. İlaç yüklü bu partiküllerin farklı pH ortamında salım davranışı ve farklı ilaç salım kinetik modelleri incelenmiştir. Ayrıca deneysel olarak karaciğer harabiyeti oluşturulmuş sıçanlarda AC ve p(AC) nanopartiküllerin serum biyobelirteçlerinden aspartat aminotransferaz (AST), alanin aminotransferaz (ALT), üre ve keratin (Cre) seviyeleri ile karaciğer, böbrek, dalak, beyin, akciğer, kan ve kalp dokularında katalaz (CAT), glutatyon redüktaz (GR), süperoksid dismutaz (SOD), glutatyon S-transferaz (GST) enzim aktiviteleri ve redükte glutatyon (GSH) seviyeleri ile lipid peroksidasyon (Malondialdehit) (MDA) düzeyleri incelenmiştir. Çalışma kapsamında kullanılan ardıç meyve metanol eksraktı, AC p(AE) ve p(AC) nanopartiküllerin kana uyumlu, antioksidan ve antimikrobiyal özelliğe sahip olduğu tespit edildimiştir. Parasetamol yüklü p(AE) nanopartiküllerinden % 95 parasetamol salındığı gözlenmiştir. Farklı ilaç yüklenen p(AC) nanopartikülerinden ise pH 5.4'te % 97 parasetamol, pH 8'de % 90 paklitaksel ve pH 7.4'te % 99 5-Fu salındığı belirlenmiştir. İlaç yüklü nanopartiküllerin ilaç salım kinetik modelleri incelendiğinde p(AE) parasetamol için pH 7.4'te Higuchi modeline, p(AC) parasetamol için pH 5.4'te Krosmeyer-Peppas modeline, p(AC)5-Fu için pH 8'de Higuchi modeline ve p(AC) paklitaksel için pH 8'de Krosmeyer-Peppas kinetik modeline uyduğu görülmüştür. Sentezlenen partiküllerin sıçan uygulamalarında serum biyobelirteçlerinde genel olarak olumlu etki ettiği ve antioksidan enzimlerin aktivitesi ile GSH ve MDA seviyelerinde farklı dokularda farklılıklar olmasına rağmen genel olarak olumlu etki ettiği tespit edilmiştir.
Van otlu peynirinin geleneksel yöntemlerle hazırlanan mayasında (rennet) kullanılan bitkilerin ve mikroorganizmaların araştırılması
Peynir, dünya genelinde birçok tat ve formda üretilen, fermente süt bazlı bir grup gıda ürününün genel adıdır. Süt ve süt ürünleri arasında önemli bir yere sahip olan peynir, Türkiye'de de sıkça tüketilen bir gıda maddesidir. Bazı bölgelerde yerel peynirler, normal olarak bilinen peynirlerden daha farklı şekilde üretilip tüketilmektedir. Bu mahalli peynir çeşitlerinden biri olan Van Otlu peyniri, Doğu Anadolu'da ve Türkiye'de oldukça sevilen ve buna bağlı olarak tüketilen bir peynir çeşididir. Günümüzde Van Otlu peyniri henüz endüstriyel olarak büyük ölçekte üretilmediği için halk tarafından farklı yöntemler kullanılarak mayalama işlemi yapılmaktadır. Bu yöntemler arasından dikkat çekenler ise yıllardır peynir mayası yapımında kullanılan bazı bitkilerdir. Peynir mayasına katılan pek çok bitki türü bilinmektedir. Van Otlu peynir mayasının hazırlanmasında kullanılan Apiaceae familyasına ait Pimpinella oliverioides Boiss. & Hausskn. (Giha hevin) ilk kez bu çalışma ile tespit edilmiştir. Pimpinella L. cinsi Türkiye'de 29 takson ile temsil edilmekte olup bunlardan 7'si endemiktir. Pimpinella oliverioides türüne ait herbaryum materyalleri arazide toplanmış ve bunlara ait video ve fotoğraf kayıtları alınmıştır. Bitki örneklerinin teşhislerini yapmak için Herbaryum materyali haline getirilmiş ve Uluslararası VANF herbaryumunda saklanmıştır. Ayrıca bu bitkiden elde edilen maya içeriğindeki kültüre edilebilen mikroorganizmalar da tespit edilmiş ve morfolojik olarak ayırt edilen 15 mikroorganizma içinden proteolitik aktiviteye sahip Paenibacillus sp. moleküler olarak tanımlanmıştır.
Farklı makroalg türlerinden elde edilmiş biyoaktif bileşiklerin antikanser ve antioksidan özelliklerinin araştırılması
Yeni antikanser ajanların keşfi kanser tedavisinde önemli bir yer tutar. Deniz yosunları (makroalgler) kimyasal olarak aktif ve sitotoksik özelliklere sahip metabolitlerin doğal kaynakları arasındadır. Bu nedenle kahverengi, yeşil ve kırmızı deniz yosunlarından izole edilen daha güçlü ve seçici antikanser bileşenlerinin tanımlanması ve bunların etki biçimlerine ilişkin çalışmalar son zamanlarda dikkat çekmektedir ve bu çalışmalar farmakolojik uygulamalar için önemli bir ilerleme niteliği taşımaktadır. Bu tez çalışmasının amacı bazı makroalg türlerinden elde edilen ticari olarak mevcut, saflaştırılmış ve karakterize edilmiş bazı ikincil metabolitler olan hordenin, tiramin ve 2-feniletilaminin kanser hücre hatları üzerindeki anti-kanser etkisini, ayrıca antioksidan ve anti-inflamatuar aktivitelerini araştırmaktır. Bu doğal kaynaklı maddelerin in silico ADME/T analizlerinin sonuçları hem gastrointestinal sistemden hem de kan-beyin bariyerinden (KBB) geçebildiklerini ve görece yüksek ilaç skorları ile farmakolojik açıdan aktif gruplara ve özelliklere sahip olduklarını göstermiştir. Çalışmanın ilk aşamasında hordinin, tiramin, 2-feniletilamin metabolitlerinin ve pozitif kontrol olarak çalışmaya dahil edilen paklitakselin sitotoksik aktivitesi 10 insan kanser hücre hattı (HCT-116, CaCo-2, HT-29, HepG2, PANC-1, Ishikawa, HeLa, A172, A549 ve TT) ve 2 kontrol hücre hattı (HEK293 ve CCD-18Co) üzerinde test edilmiştir. Hordininin test edilen kanser hücre hatlarının hiçbirinde sitotoksik aktivitesi tespit edilmemiştir. Diğer yandan tiramin ve 2-feniletilamin kolon kanseri hücre hatları (HCT-116, CaCo-2 ve HT-29) ile endometriyal kanser hücre hattı (Ishikawa) üzerinde en yüksek sitotoksik aktiviteyi göstermiştir. Tiramin ve 2-feniletilamin için EC50 değerindeki konsantrasyonları HCT-116 hücre hattında sırasıyla 64.63 μM ve 84.50 μM, CaCo-2 hücre hattında 126.90 μM ve 156.23 μM, HT-29 hücre hattında 204.90 μM ve 208.71 μM ve Ishikawa hücre hattında 169.40 μM ve 212.30 μM olarak hesaplanmıştır. Tiramin uygulaması HCT-116, CaCo-2 ve HT-29 hücre hatlarında koloni oluşumunu sırasıyla %92, %95 ve %62 oranında ve 2-feniletilamin sırasıyla %60, %30 ve %17 oranında inhibe etmiştir. Yara iyileşme testi sonuçları tiramin ve 2-feniletilamin uygulamasının HCT-116 hücre migrasyonunu sırasıyla %20 ve %18 oranında ve CaCo-2 hücre migrasyonunu %49 ve %43 oranında inhibe ettiğini göstermiştir. Hesaplamalı analizler bu etkinin MMP-9 enziminin inhibisyonu ile gerçekleşmiş olabileceğini işaret etmektedir. Tiramin ve 2-feniletilamin bileşiklerinin apoptotik aktivitesinin tayini iki farklı yöntemle gerçekleştirilmiştir. Akış sitometrisi sonuçları bu bileşiklerin EC50 değerindeki konsantrasyonları uygulanan HCT-116, CaCo-2 ve HT-29 hücrelerinde canlı, ölü, erken ve apoptotik hücre popülasyonlarının sayısında negatif kontrol grubuna göre anlamlı bir fark oluşturduğunu göstermiştir. qRT-PCR analizleri, antikanser potansiyelini ortaya çıkaracak şekilde CASP 3, CASP 8, CASP 9, BAX, P53 gen ifadelerinin uyarıldığını ve BCL-2 gen ifadesinin baskılandığını ortaya çıkarmıştır. Griess testi, LPS ile indüklenen RAW264.7 hücrelerindeki artmış NO düzeylerinin hordinin, tiramin ve 2-feniletilamin uygulamasıyla pozitif kontrol grubuna göre anlamlı bir düşüş gösterdiğini ve qRT-PCR analizleri iNOS, COX2, IL-6 ve TNF-α gen ifadelerinin anti-inflamatuar etkiyi işaret edecek biçimde anlamlı şekilde baskıladığını, IL-10 gen ifadesini ise artırdığını göstermiştir. Hordinin, tiramin ve 2-feniletilaminin antioksidan aktiviteleri DPPH, ABTS, Galvinoksil, FRAP ve Fosfomolibden olmak üzere beş farklı metotla test edilmiştir. Test edilen bileşiklerin antioksidan aktiviteye sahip olduğu yalnızca ABTS metodu ile tespit edilmiştir. Bu metodla standart antioksidanlar troloks ve askorbik asit için EC50 değerleri sırasıyla 5.23 μM ve 6.52 μM olarak hesaplanırken, hordinin, tiramin ve 2-feniletilamin için sırasıyla 15.78 μM, 9.09 μM ve 137.64 μM olarak hesaplanmıştır. Tiramin ve 2-feniletilaminin EC50 dozları ile muamele edilen HCT-116, CaCo-2 ve HepG2 hücrelerinin toplam GST ile GSTT1 ve GSTM1 izozimleri, GPX ve SOD enzim aktiviteleri ve toplam tiyol düzeyleri kontrol grubuna göre karşılaştırmalı olarak değerlendirilmiştir. Bu alkaloidler ile muamele HCT-116 hücre hattında toplam GST, GPX ve SOD enzim aktivitelerinde artışa ve toplam tiyol düzeylerinde ise düşüşe neden olmuştur. Bu tez çalışmasının sonuçları makroalglerden elde edilmiş metabolitler olan tiramin ve 2-feniletilaminin anlamlı düzeyde sitotoksik, anti-metastatik, apoptotik etki gösterdiğini, bu yolla antikanser potansiyellerinin yüksek olduğunu ortaya koymuştur. Bu gerçeği destekleyecek şekilde hordinin, tiramin ve 2-feniletilamin anlamlı düzeyde anti-inflamatuar ve antioksidan özellik göstermiştir.
Türkiye'de yetişen Helvella L. türlerinin morfolojik ve moleküler karakterizasyonu
Helvella, Ascomycota bölümünün Helvellacae familyasında yer alan; düzensiz loblu, eyer, kadeh ya da fincan şeklinde apotezyum yapılarıyla karakterize edilen bir mantar cinsidir. Türkiye, zengin bir mikobiyotaya sahip olmasına rağmen, Helvella cinsi üzerine kapsamlı çalışmalar oldukça sınırlıdır. Türkiye'nin farklı ekolojik bölgelerinde hâlâ keşfedilmeyi bekleyen çok sayıda tür bulunduğu düşünülmekte; bu nedenle Helvella cinsine yönelik güncel ve kapsamlı bir taksonomik revizyona ihtiyaç duyulmaktadır. Doktora tez çalışmasında, 2022-2024 yılları arasında gerçekleştirilen arazi çalışmalarıyla doğadan toplanan ve çeşitli fungaryumlardan temin edilen örnekler morfolojik ve moleküler yöntemlerle değerlendirilmiş; tür teşhisleri yapılarak filogenetik ilişkileri ortaya konmuştur. Tez kapsamında elde edilen örneklerin, makroskobik ve mikroskobik özellikleri dikkate alınarak morfolojik tanımlamaları yapılmıştır. Makroskobik karakter olarak apotezyum, sap, reseptakulum ve himeniyum yapıları, mikroskobik karakter olarak ise askus, askospor, parafiz, excipulum gibi tanısal özellikler incelemiştir. Mikroskobik seviyede yapılan çalışmalar için distile su, melzer, pamuk mavisi, Congo red ve KOH (potasyum hidroksit) gibi belirteçlerden yararlanılmıştır. Ayrıca, çalışmada tanımlanan Helvella türlerinin tamamı için genişletilmiş morfolojik betimlemeler yapılmış; daha önce eksik ya da yetersiz şekilde belgelenmiş bazı türlerin tanımlamaları güncellenmiştir. Buna ek olarak, Türkiye'de yayılış gösteren Helvella türlerinin ayırt edilmesine olanak tanıyan, morfolojik ve ekolojik karakterlere dayalı yeni bir teşhis anahtarı oluşturulmuştur. Moleküler sistematik çalışmaları kapsamında, beş farklı DNA barkod bölgesine ait [Transkribe edilen aralayıcı bölgeler (ITS), büyük alt ünite (LSU), uzama faktörü 1-alfa (TEF1-α), RNA polimeraz 2 (RPB2) ve ısı şok proteini 90 (HSP90)] DNA dizileri elde edilerek filogenetik analizleri gerçekleştirilmiştir. Bu bölgelere ait ayrı ayrı diziler elde edildikten sonra birleştirilmiş veri setleriyle dörtlü (ITS/LSU/TEF1-α/HSP90) ve beşli (ITS/LSU/TEF1-α/RPB2/HSP90) çoklu lokus analizleriyle kombine filogramlar oluşturulmuştur. Elde edilen diziler üzerinden Bayesian Inference (BI) yöntemine dayalı filogenetik ağaçlar oluşturularak, morfolojik verilerle desteklenen tür sınırları ve kladal yapılar ortaya konmuştur. Çalışma kapsamında analiz edilen 50 örnekten 26 farklı tür tanımlanmış olup, bu türler Helvella cinsinin Acetabulum, Crispa, Elastica ve Lacunosa kladları içerisinde sınıflandırılmıştır. Tanımlanan türlerden; Acetabulum kladında yer alan H. arctoalpina, Elastica kladında bulunan H. capucina, H. pubescens, H. rivularis ve Lacunosa kladına ait H. alpina, H. dryophila, H. pseudoalpina, H. sublactea türlerinin ülkemiz mikotası için yeni kayıtlar olduğu belirlenmiştir. Bu tez çalışmasıyla, Helvella cinsinin Türkiye'deki taksonomik çeşitliliği ve filogenetik ilişkilerine yönelik şimdiye kadar yapılmış en kapsamlı değerlendirme yapılmıştır. Morfolojik ve moleküler verilerin birlikte kullanılması sayesinde, tür teşhislerinde karşılaşılan problemlerin büyük oranda çözümlendiği, bazı geleneksel tür tanımlarının ise moleküler veriler ışığında yeniden ele alınması gerektiği sonucuna varılmıştır. Ayrıca elde edilen bulgular, yalnızca Türkiye mikobiyotası için değil, Helvella cinsinin küresel ölçekte sistematik konumlandırılması açısından da önemli katkılar sunmaktadır. Sonuç olarak, bu çalışma yalnızca mevcut bilgi boşluklarını doldurmakla kalmayıp, gelecekte yapılacak ekolojik, evrimsel ve koruma temelli mikolojik araştırmalara da güçlü bir zemin hazırlamaktadır. Türkiye'nin mantar çeşitliliğine dair farkındalığın artırılması ve mikofloristik envanterlerin güncellenmesi açısından bu tez, temel bir başvuru kaynağı niteliğinde olmaktadır. Anahtar kelimeler: DNA barkodlama, Helvella, HSP90, ITS, LSU, RPB2, TEF1-α, Yeni kayıt
Kars-Iğdır (Türkiye) ekstrem topraklarından streptomyces bakterilerinin izolasyonu, karakterizasyonu, teşhisi ve sekonder metabolitlerinin araştırılması
Bu tez çalışmasında, aşırı tuzlu Iğdır/Tuzluca ve aşırı soğuk Kars/Sarıkamış yörelerinden elde edilen ekstrem toprak habitatlarından antibakteriyel metabolit üreten Streptomyces türlerinin izolasyonu, bu izolatların morfolojik, biyokimyasal ve moleküler düzeyde karakterizasyonu ile yüksek antibakteriyel aktivite gösteren sekonder metabolitlerin üretimi amaçlanmıştır. Ayrıca bu sekonder metabolitlerin karakterizasyonu üzerine çalışmalar yapılmıştır. Çalışmanın ilk aşamasında, belirtilen ekstrem habitatlardan alınan toprak örneklerinin fiziko-kimyasal özellikleri belirlenmiş ve seri dilüsyon ile yayma ve dökme plaka yöntemi kullanılarak olası Streptomyces izolatları elde edilmiştir. İzolatların test bakterilerine karşı antibakteriyel aktiviteleri incelenmiş ve etki spektrumları dikkate alınarak seçilen Streptomyces izolatlarının morfolojik ve biyokimyasal özellikleri tespit edilmiştir. Moleküler düzeyde tür tayini için 16S rRNA, rpoB ve recA gen bölgeleri dizilenmiş ve filogenetik analizler gerçekleştirilmiştir. Ayrıca seçili izolatın antibakteriyel metabolitleri, fermentasyon koşullarının optimize edilmesiyle en uygun ortam ve kültür süresi belirlenerek fermente edilmiştir. Elde edilen metabolit, kromatografik yöntemlerle saflaştırılmış ve yapısal özelliklerini aydınlatmak amacıyla ¹H-NMR ve FT-IR teknikleri ile analiz çalışmaları yapılmıştır. Çalışma neticesinde 34 Streptomyces izolatı elde edilmiş, bunlardan BH006, BH011, BH022, BH026 ve BH034'ün karşıt çizgi yöntemi sonucunda test bakterilerine karşı yüksek antibakteriyel aktivite gösterdiği belirlenmiştir. Bu izolatların oluşturduğu inhibisyon zon çapları sırasıyla; BH006 izolatı için Staphylococcus aureus'a karşı 24 mm, Bacillus cereus'a karşı 35 mm ve Escherichia coli'ye karşı 24 mm; BH011 izolatı için B. cereus'a karşı 15 mm; BH022 izolatı için S. aureus'a karşı 13 mm, B. cereus'a karşı 25 mm ve E. coli'ye karşı 16 mm; BH026 izolatı için S. aureus'a karşı 39 mm, B. cereus'a karşı 40 mm ve E. coli'ye karşı 37 mm; BH034 izolatı için ise S. aureus'a karşı 18 mm, B. cereus'a karşı 17 mm, Enterococcus faecalis'e karşı 11 mm ve E. coli'ye karşı 13 mm olarak ölçülmüştür. Uygulanan morfolojik ve biyokimyasal test sonuçlarına göre bu beş izolatın birbirinden farklı tür özellikleri sergilediği belirlenmiştir. Filogenetik analizler, BH006, BH011, BH022, BH026 ve BH034 izolatlarının sırasıyla Streptomyces ficellus, Streptomyces rochei, Streptomyces bikiniensis, Streptomyces gobitricini ve Streptomyces inhibens ile yakın benzerlik gösterdiğini ortaya koymuştur. Fermentasyon deneyleri, S. aureus, B. cereus, E. faecalis ve E. coli'ye karşı en yüksek antibakteriyel aktivitenin BH026 izolatının metabolitlerinden elde edildiğini göstermiştir. Bu izolat için GYM broth (glukoz, maya, malt özütü) optimal üretim besiyeri olarak tanımlanmış ve maksimum metabolit üretiminin 3. günde gerçekleştiği tespit edilmiştir. Ancak saflaştırma çabalarına rağmen, yetersiz verim nedeniyle aktif metabolitin kimyasal yapısı aydınlatılamamıştır. Buna ek olarak izole edilen Streptomyces türlerinin doğal mikrobiyal topluluk içindeki konumunu anlamak ve seçilen dört toprak örneğinin mikrobiyal çeşitliliğini ortaya koymak amacıyla metagenomik analiz yapılmıştır. Bu kapsamda topraklardan elde edilen total DNA, yeni nesil dizileme (NGS) teknolojisi ile dizilenmiş, ardından biyoinformatik analizlerle taksonomik sınıflandırma gerçekleştirilmiştir. Analiz sonucunda toplamda 22 şube (filum), 38 sınıf, 91 takım, 186 familya, 364 cins ve 662 tür düzeyinde çeşitlilik belirlenmiştir. Toplam cins sayısı örnekler arasında değişiklik göstermiş olup, tüm toprak örneklerinde baskın cinslerin Pasteurella ve Sphingomonas olduğu saptanmıştır.