Kromatografi-sıvı
Bu konu başlığı altında 75 tez
Primer ve sekonder glioblastomaların metabolomik yaklaşımla incelenmesi
daha sonra doldurulacakGlioblastom erişkin çağda görülen en sık beyin tümörüdür. Tüm tedavilere rağmen ortalama sağ kalım 15 ay civarındadır. Glioblastom farklı genetik yollarla gelişen primer ve sekonder alt türleri içerir. Bu çalışmada morfolojik olarak aynı olan ancak genetik olarak son derece farklı olan primer ve sekonder glioblastomlu hastalardan elde edilen doku örneklerinde bu tümörlerin gelişime ışık tutabilecek metabolomikleri tespit ederek, kişiye özel tedavilerin planlanması ve tedaviye alınacak yanıtın rekürrens olmadan değerlendirilmesi amaçlandı. 6 adet normal, 37 adet primer gliomblastom, 10 sekonder glioblastom ve 5 adet düşük evreli tümör dokusu Q-TOF LC/MS ile incelendi. Glioblastomlarda lipid mediatör olan prostaglandinler (PG'ler), tromboksanlar (TX'lar), lökotrienler (LT'ler), lipoksinlerden (LX'ler) oluşan eikozanoidlerin artışı ile ilişkili metabolitler izlendi. Safra asitleri ve metabolitlerinin glioblastomlarda arttığı saptandı. C21 steroid sentez artışı, C21, C19 ve C18 steroid metabolizmasının yavaşlaması gösterildi. Sekonder glioblastomalarda daha fazla olmak üzere tüm glioblastomalarda alfa-Tokotrienolün arttığı saptandı. Glioblastomlarda sağ kalımı uzatabilmek için eikozanoid, steroid, kolesterol, safra asitleri ve sentez yolakları ile ilgili hedeflenmiş ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. tır
Farklı tipteki aluminyum adjuvanların monositik hücrelerde oluşturduğu etkilerin proteomiks ve metabolomiks düzeyde incelenmesi
Aşılar, doğal enfeksiyonu taklit ederek ve uzun süreli immünolojik hafıza üreterek bulaşıcı hastalıkların neden olduğu hastalıkların mortalite ve morbiditesini azaltan biyolojik bileşiklerdir. Aşılarda kullanılan antijenlerin çoğu zayıf immünolojik cevaba sebep olduklarından dolayı aşıların etkisinin gücünü ve süresini artırmak amacıyla aşı bileşenlerine adjuvanlar da eklenmektedir. Eski yıllardan beridir aluminyum tuzları adjuvan olarak en sık kullanılan maddelerdir ve özellikle monositlere olgun bir dendritik fenotipe farklılaşmaları için güçlü bir uyarım sağlamaktadırlar. Bu tez çalışmasında U-937 ve THP-1 hücre kültüründe aluminyum oksihidroksit (AH) ve aluminyum hidroksifosfat (AP) tuzlarının farklı derişimleri kullanılarak metabolomiks ve proteomiks çalışmalar yürütülmüştür. Bu amaçla gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi (GC-MS) ile intraselülar ve ekstraselülardametabolomiks analizler ve sıvı kromatografisikuadropol uçuş zamanlı kütle spektrometresi (LC-qTOF-MS) ile proteomiks analizler gerçekleştirilmiştir. Analizler sonucunda toplamda 170 metabolit ve 403 protein tanımlanmıştır. Tek değişkenli ve çok değişkenli veri analizleri alüminyum adjuvan tuzlarına ve THP-1 ve U937 hücre kültürü tiplerine bağlı olarak değişen metabolitleri, proteinleri ve yolakların belirlenmesini sağlamıştır. Farklı derişimlerde AH ve AP tuzlarına maruz kalan hücrelerde anlamlı düzeyde değişen endojenik metabolit ve proteinlerin mevcut alüminyum adjuvanların etkisinin güçlendirilmesine ve yeni endojen adjuvanlarının geliştirilmesine öncülük edebileceği düşünülmektedir.
Momordica charantia L. ekstrelerinin içeriğinin ve melanoma kanser hücreleri üzerine etkisinin metabolomik çalışmalarla incelenmesi
Bu tez çalışmasında, yara bakımında kullanılan Momordica charantia L. (kudret narı) Sıvı Kromatografisi/Kuadrapol Uçuş Zamanlı Kütle Spektrometrisi (LC/Q-TOF MS) temeline dayanan metabolomik çalışmalarla metabolom düzeyinde incelenmiş ve de bu bitkinin B16-F10 melanom hücre hattı üzerinde in vitro etkisi LC/Q-TOF MS ile araştırılmıştır. Bu amaçla Momordica charantia L. bitkisinin olgunlaşmış meyve ve tohumunun metanol ekstraktları hazırlanmıştır. Elde edilen ekstraktlar LC/Q-TOF MS cihazı kullanılarak C18 kolon ile gradiyent elüsyon programı kullanılarak analiz edilmiştir. Elde edilen ham veriler çeşitli veri analiz yöntemleri kullanılarak incelenmiştir. Tespit edilen piklerin normalizasyonu yapılmıştır ve meyve ve tohum arasındaki fark incelenmiştir. Araştırma sonucunda meyve ve tohum arasında metabolom düzeyinde farklılık olduğu görülmüştür.Ayrıca, Momordica charantia L.'nin cilt kanserinde etkinliğini incelemek amacıyla meyve ve tohum ekstraktları B16-F10 melanom hücre hatlarına uygulanmıştır. Kontrol grubu, tohum ve meyve grupları arasındaki farkları gözlemleyebilmek için LC/Q-TOF MS cihazı kullanılarak analiz yapılmıştır. Kontrol, meyve ve tohum grupları arasında ekstraklarının hücre hatlarına inkübasyonu sonucu 48 saat ve 72 saat inkübasyonunun sonucundaki farklar ayrı olarak incelenmiştir. Sonuç olarak, meyve (hücrede) ve tohum (hücrede) ekstraktlarının metabolitlerinin hem 48 saat inkübasyon sonrası için hem de 72 saat inkübasyon sonrası için kontrole göre farklı olduğu görülmüştür. Bu bitkinin yara bakımında kullanılmak üzere umut vaad edici olduğu sonucuna varılmıştır. Anahtar kelimeler: Sıvı kromatografisi, kütle spektrometrisi, yara bakım, biyobelirteç, metabolom ve fitoterapötik
Investigation of the in vitro and in vivo effects of telomere-targeted new drug candidate compounds on different cancer cell lines
Cancer, characterized by its heterogeneity, metastatic character, and limited treatability, stands as a leading global cause of mortality. Cancer cells elongate their telomeres through the activity of the telomerase enzyme, thereby gaining immortality by evading control checkpoints in the cell cycle. The expression of telomerase is present in approximately 95% of cancer cells, while its activity is absent in somatic cells. Consequently, in recent years telomerase/telomere-targeted therapies have shown significant promise. Due to the heterogeneity of cancer cells and their varying telomere lengths, long-term anti-telomerase therapies can lead to adverse effects. Therefore, there is a need for novel molecules that can target telomeres, regardless of their telomeric lengths, and exhibit rapid efficacy. Within the scope of this doctoral thesis research, the objective was to investigate molecules added to telomeric structures by telomerase, which may induce genomic instability and cell death through telomeric DNA damage, both in vitro and in vivo. These molecules were synthesized by the MAIA biotechnology company (Chicago, USA) and delivered to the Department of Medical Biochemistry. The candidate drug molecules were tested on different cancer cell lines [breast cancer (MCF-7), non-small cell lung cancer (A549), cervical cancer (HeLa), and colon cancer (HT29)] at nine different concentrations for 96 hours, and cytotoxicity was assessed using the MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) assay. The obtained EC50 results were compared with 6-thio-dG in each cell line, and a molecule named "L6" was identified as a new potential drug candidate with a lower EC50 value compared to 6-thio-dG. The EC50 values of different cell lines to the L6 molecule were evaluated, and HT29 colon cancer cells, which exhibited the highest sensitivity to the L6 molecule, were selected as the target cell line. The DNA damage induced by these molecules at telomeric ends was assessed using the Telomere Induced Foci (TIF) method with confocal microscopy. In this method, co-localization of telomeric probes and staining with the γH2AX antibody specific to DNA damage was used to demonstrate TIF. The results obtained from the TIF method indicate that the telomeric DNA damage caused by the L6 molecule is statistically significant compared to the control group and 6-thio-dG. Additionally, an assessment of global genomic damage reveals that the L6 molecule and 6-thio-dG induce DNA damage to an equal extent. Furthermore, the effects of the candidate molecules on the base excision repair (BER) pathway proteins Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease-1 (APE1) and Poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP1), as well as the quantities of DNA damage product 8-Hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OH-dG) was investigated liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HR/MS) and liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) techniques. L6 promotes a significant downregulation in the expression levels of both PARP1 and APE1 in HT29 cells. The in vivo efficacy of L6 was evaluated both in CD1 nude mice and BALB/c mice. In the xenograft model established with the HT29 cell line, the optimal dosage of L6 was determined to be 3 mg/kg, administered in a total of 4 doses, with a treatment frequency of twice per week. A syngeneic animal model was generated using the CT26 cell line, followed by the administration of sequential therapy with the L6 molecule and anti-PD-L1. After the euthanize the animals, immunophenotyping was performed by flow-cytometry on excised tumor tissues. The results obtained indicate that the L6 molecule led to a reduction in tumor size, decrease in Treg cell count, and an increase in the activated CD8+ cells. Key words: Cancer, telomere, telomerase, TIF (telomeric induced foci), xenograft, syngeneic, LC-MS/MS, APE1, PARP1, 8-OH-dG
Kumaş fazı emici ekstraksiyonu ile ilaç etkin maddelerinin farmasötik preparat ve biyolojik materyalden analizi için analitik yöntem geliştirilmesi ve validasyonu
Kumaş fazı emici ekstraksiyonu (FPSE) son yıllarda ön plana çıkan bir numune hazırlama tekniğidir. Bir kumaş yüzeyinin farklı sorbentlerle kaplanması ile hazırlanan mikroesktraksiyon cihazları, hedef molekülün yüksek geri kazanımla ve basit bir şekilde farklı ortamlardan analizine olanak tanımaktadır. Her ne kadar FPSE'nin farmasötik analiz uygulamalarında kullanımı bilinse de bu tez çalışmasında FPSE ile iki ilaç etkin maddesi için iki özgün uygulama gerçekleştirilmiştir. Bu uygulamalardan ilkinde FPSE, Tazaroten molekülünün jel formülasyonundan analizinde bilinen uygulamaların aksine Tazaroten molekülünü değil, jel formülasyonunu hedef almış ve enjeksiyon öncesi hazırlanan çözeltide ortam bileşenlerini yüksek seçicilikle tutarak hedef molekülün serbest kalmasını sağlamıştır. Böylece karmaşık ve çok basamaklı jel formülasyondan ekstraksiyon tekniklerinin yerini almıştır. Tazaroten, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile ticari jel formülasyonundan analiz edilebilmiştir. İkincisinde ise model bir molekül olarak seçilen Levofloksasin molekülünün kan plazmasından analizi sonucu farmakokinetik profilin ortaya çıkarılmasın amacıyla kullanılmıştır. Halihazırda kullanılan proteinlerin çöktürülmesi sonrası etkin maddenin kan plazmasından analizi yöntemi ile istatistiksel olarak benzer sonuçlar elde edilmiştir. Analizler için HPLC ile kombine kütle spektrometrisi (LC-MS) kullanılmıştır. Farmakokinetik çalışmalarda FPSE tek başına az basamaklı basit bir ekstraksiyon yöntemi olmakla kalmamış, numunenin saklanması ve transferine de olanak tanıyan birçok amaçlı mikroekstraksiyon cihazı olarak görev almıştır. Bu tez çalışması sonucunda literatüre FPSE'nin bilinen mikroekstraksiyon uygulamalarının aksine farklı amaçlarla kullanımı ile ilgili iki farklı yaklaşım ortaya konulmuş ve ilgili yaklaşımların başarısı geliştirilen analitik yöntemler ile ispatlanmıştır.
Kronik böbrek hastalarında plazma amino asit profilinin incelenmesi
Böbrek yetmezliği, artan insidansı ve prevalansı, yüksek maliyetleri ve kötü sonuçları ile dünya çapında bir halk sağlığı sorunudur. Hastalık ve yönetim, glomerüler filtrasyon hızı (GFR) ve albüminüri ile değerlendirilen, hastalık şiddetinin aşamalarına ve klinik tanıya göre sınıflandırılması yapılır. Kronik böbrek hastalığı, rutin laboratuvar testleriyle saptanabilen bir hastalıktır ve bazı tedaviler, ilerlemesini önleyebilir ve hastalığın ilerlemesini yavaşlatabilir. Bu nedenle hastalığın tanısı ve tedavisinin takibi için yeni biyobelirteçlerin keşfedilmesi önemlidir . Bu çalışmanın amacı; Kronik böbrek hastalığı olan hastalarda hem diyaliz öncesi hem diyaliz sonrası plazma serbest aminoasit profillerini incelemek ve sağlıklı kontrol grubuyla kıyaslayarak tanı ve tedavide kullanım potansiyelini araştırmaktır. Çalışmamızda Şanlıurfa Harran Üniversitesi Tıp Fakültesi Diyaliz Bölümüne başvuran KBY teşhisi konulan 46 sağlıklı ve 46 KBY tanısı konulan hastadan plazma örnekleri alındı. Plazma serbest aminoasit profilleri LC-MS/MS yöntemiyle incelendi. Elde edilen verilerin istatistik analizi SPSS ile yapıldı. İstatiksel analiz sonucunda kronik böbrek yetmezliği olan hastalarda ortalama alanin,arginin,aspartik asit, sitrulin,histidin, metionin,tirozin ve hidroksiprolin glisin,löysin,isolöysin,lizin,ornitin,fenilalanin, prolin, serin glutamikasit, glutamin valin,taurin alloizölöysin,alfaminoadipik asit,anserin,gamaaminobütirik asit,1-metilhistidin, 3- metilhistidin 5-oh-trp amino asit düzeyleri kontrol grubundan daha yüksek bulunmuştur. Fosfoetanolamin ,sistin, alfaaminobütirik asit, betaaminobütirik asit ve triptofan amino asitleri KBY hastalarında kontrol grubuna göre daha düşük bulunmuştur. Diyaliz sonrasında diyaliz öncesine göre sitrülin ,histidin ,alanin,arginin aspartik asit, glutamik asit ,glisin, sistin ,isölöysin, prolin , fosfoetanolamin ,taurin alloisolöysin, alfaaminoadipik asit ,anserin, alfaaminobütirik asit ,betaaminobütirik asit betaalanin, 1 -metilhistidin ,5-oh-trp düzeyinde artış görülürken ,glutamin löysin,lizin, ornitin fenilalanin ,serin ,valin, asparajin ,metiyonin, triptofan ,tirozin ve hidroksiprolin gamaaminobütirik asit 3-metilhistidin düzeyinde düzeyinde azalış görülmüştür. Grupların aritmetik ortalamaları arasındaki farkın anlamlılığını sınamak amacıyla kullanılan Paired samples T testinde sitrülin,glisin,lizin, anserin, alfaaminobütirik asit,gamaamino bütirik asit, fosfoetanolamin ve taurin düzeyi anlamlı bulunmuştur (p<0,05). Çalışma sonucunda KBY de aminoasitlerin rolünün anlaşılması amacıyla daha fazla çalışmaya ihtiyaç görülmüştür.
Spina bifida hastalarında aminoasit metabolizmasının incelenmesi
Spina bifida, insanlarda en sık görülen ve en karmaşık merkezi sinir sistemi malformasyonudur. Dünyada spina bifida insidansı hala 1000 doğumda 0,3-4,5 olarak görülmektedir. Normal bir gebelik oranında, orta hatta bir defektli bir bebek doğurma olasılığı 1/1000'dir. Genellikle spina bifida, fetusun omurilik kısmının uygun şekilde kapanamadığı gebeliğin üçüncü ve dördüncü haftalarında meydana gelir. Spina bifidanın etiyolojisi heterojendir. Sendromik olmayan spina bifidaların çoğunun hem genetik hem de çevresel faktörlerin etkisiyle multifaktöriyel kökenli olduğu düşünülmektedir. Spina bifida riskinin artmasıyla ilişkili çevresel faktörler arasında gebelik ağırlığının artması, annenin sigara içmesi, özellikle antiepileptik ilaçlar olmak üzere ilaç alımı ve annenin diyabet ve hipertermi gibi hastalıkları yer almaktadır. Ayrıca klorlu su tüketimi, inositol alımı, basit şeker alımı ve eser elementlerin ve diğer mikro besinlerin alımı gibi diyet faktörleride spina bifidaya neden olduğu tahmin edilmektedir. Fakat hala hastalığın net nedeni tespit edilememiştir. Yüksek maternal serum alfa-fetoprotein seviyeleri genellikle spina bifida aperta'nın göstergesidir ancak ikiz gebelik gibi farklı durumlarda da AFP seviyesi arttığı için tanıyı doğrulamak için ultrason gereklidir. Tarama amaçlı obstetrik ultrasonografi, birçok ülkede gebelik sırasında hastalığın saptanması için ilk rutin yöntemdir. Ancak bazen kapalı spina bifidayı tespit etmekte başarısız olmaktadır. Spina bifida tanısını koyan kesin bir biyokimyasal markır olmadığı için, bu alanda ciddi araştırmalar devam etmektedir. Günümüzde bu tür hastalıkların tanı ve tedavisi için metabolomik alanında ciddi çalışmalar yapılmaktadır. Metabolomik çalışmalarında aminosit, karnitin, yağ asidi ve organik asid profili gibi çeşitli metabolitler incelenmektedir. Bu çalışma; spina bifidalı bireylerin serbest aminoasit profili LC-MS/MS yöntemiyle incelenerek, aminoasitlerin hastalığın hem tanısında hemde tedavisinde kullanılabilme potansiyeli tespit etmek amacıyla yapıldı. ix Çalışmada harran üniversitesi araştırma ve uygulama hastanesi Beyin cerrahisi bölümünde spina bifida teşhisi konmuş 40 hasta ve 40 sağlıklı çocuğun plazma örnekleri kullanıldı. Plasma örneklerindeki 48 serbest aminoasit profili LC-MS/MS ile incelendi. Elde edilen dataların analizi SPSS ve metaboanalist 5 ile yapıldı. Çalışma sonucunda kontrol gurubuna göre spina bifida biraylerine Sarkozin ve Glutamik Asit Aminoasitleri anlamlı bir şekilde artarken,4-OH-Prolin ve Triptofan aminoasitleri anlamlı bir şekilde azaldığı tespit edildi
Farklı üretim teknikleriyle üretilen protez kaide materyallerinden salınan rezidüel monomer miktarının karşılaştırılması
3 boyutlu yazıcı teknolojisi kullanımı dental alanda hızla artmaktadır. Bilgisayar destekli üretim kategorisinde bulunan eklemeli üretim olarak da adlandırılan bu teknoloji protez kaidesi üretimi için de kullanılmaktadır. Protez kaidesi üretimi için kullanılan polimerlerin polimerizasyonu sırasında, tüm monomerler tepkimeye katılamaz ve polimer içerisinde serbest halde bulunurlar. Rezidüel monomerler oral kaviteye sızarak inflamasyon, iritasyon, hipersensitivite gibi sitotoksik ve alerjik etkiler yaratabilirler. Protezin hastaya teslimi öncesinde polimer içerisinde veya etrafında kalan rezidüel monomer miktarını azaltmak amacıyla farklı yöntemler uygulanmaktadır. Bu çalışmanın amacı farklı rezidüel monomer miktarı azaltma yöntemleri uygulanan konvansiyonel ısı ile polimerize veya 3 boyutlu yazıcı ile üretilen protez kaide materyallerinden 1gün ve 1 hafta içerisinde salınan rezidüel monomer miktarlarını karşılaştırmaktır. Kullanıcı talimatlarına göre 3 boyutlu yazıcı ile (n=96) konvansiyonel yöntem ile (n=96) olmak üzere toplam 192 polimer örneği üretilmiştir. Her iki grup uygulanacak rezidüel monomer azaltma yöntemleri için 4 farklı alt gruba (n=24) bölünmüştür. Her alt grup ise 1 gün ve 1 hafta bekleyecek şekilde tekrar ikiye ayrılmıştır. Oluşturulan alt gruplardaki örneklere (n=24); herhangi bir işlem uygulanmayan (kontrol), 5 dakika ultrasonik (40khz) izopropil alkol banyosu (%99), 24 saat distile su banyosu, 3 dakika etano l(%99) banyosu olmak üzere rezidüel monomer azaltma yöntemleri uygulanmıştır. 3ml %75 etanol sıvısında 1 gün ve 1 hafta bekletilen polimer örneklerinden salınan rezidüel monomer miktarını belirlemek amacıyla yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) yöntemi uygulanmıştır. Konvansiyonel ısı ile polimerize olan total protez kaidesi örneklerinden salınan MMA ve EGDMA, 3 boyutlu yazıcı ile üretilen protez kaide örneklerinden salınan UDMA ve TEGDMA monomerleri analiz edilmiştir. Veriler rezidüel monomer azaltma yöntemleri için Kruskal Wallis ile değerlendirilmiştir. Aynı rezidüel monomer azaltma yönteminin uygulandığı 1 gün ve 1 hafta bekletilen gruplar arasında ise Mann Whitney U testi uygulanmıştır. 3 boyutlu yazıcı ile üretilen gruplarda 5 dakika ultrasonik izopropil alkol banyosu uygulanan ve 3 dakika etanol(%99) banyosu uygulanan 1 gün ve 1 hafta bekletilen gruplarda UDMA ve TEGDMA monomerleri salınım miktarları açısından kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı derecede daha düşük bulunmuştur (p<0.05). Konvansiyonel yöntem olan ısı ile polimerize kaide materyali örnek gruplarında ise rezidüel monomer azaltma yöntemleri açısından bir fark bulunamamıştır (p>0,05). 3 boyutlu yazıcı ile üretilen protez kaide materyaline uygulanan ultrasonik izopropil alkol banyosu veya etanol banyosu rezidüel monomer salınımını önemli ölçüde azaltmıştır. Anahtar Kelimeler: rezidüel monomer, eklemeli üretim, protez kaide materyali, rezidüel monomer azaltma yöntemleri, yüksek performanslı likit kromatografisi
Kolestaz hastalarında safra asitlerinin LC-MS/MS ile araştırılması ve olası biyobelirteçlerin belirlenmesi
Kalıtsal safra asidi sentez bozuklukları (IEBAS) safra asitlerinin sentez yollarında görev alan enzimlerde yapısal veya işlevsel bozukluklar sonucu alışılmadık ara metabolitlerin birikmesine neden olan otozomal ressesif geçişli hastalıklar grubudur. Tedavi edilmediğinde nörolojik semptomlarla ilerleyen ve ölümcül karaciğer hastalığı ile sonuçlanan bu durumda erken tanı oldukça önemlidir. Bu çalışmada nadir görülen, tanısı güç olan ancak tedavi edilebilir bu hastalıkların erken tanısında kullanılabilecek yöntem ve bunlara yönelik olası biyobelirteçlerin belirlenebilmesi amaçlandı. Kuru kağıda emdirilmiş idrar örneklerinde LC-MS/MS yöntemi ile altmış sekiz safra asidi ara metabolitleri hedefli metabolomik analiz ile değerlendirildi. Plazma örneklerinde 5α-kolestanol ve 7-dehidrokolesterol ara metaboliti ve kolesterol ölçümü GC-MS yöntemiyle değerlendirildi. Hastalar ile sağlıklı bireylerin total safra asit değerleri arasında (p=0,001), klasik safra asit değerleri arasında (p=0,001), hidroksile safra asit değerleri arasında (p=0,001), 3β-hidroksi-Δ5-safra asit değerleri arasında (p=0,002) ve 3-okzo-∆⁴-safra asit değerleri arasında (p=0,001) anlamlı bir fark olduğu bulundu. Bir hastada 3β-hidroksi-Δ5-steroid dehidrogenaz eksikliği, bir hastada oksisterol-7α-hidroksilaz eksikliği, 3 hasta serebrotendinöz ksantomatozis tanıları ile uyumlu idrarla atılan safra asidi ara metabolitleri tespit edildi. Kolesterol ve kolestanol değerleri arasında (p=0,570 ve p=0,099) anlamlı bir fark olmadığı bulundu. 7-dehidrokolesterol değerleri arasında anlamlı bir fark olduğu bulundu (p=0,008). Bu bulgular safra asit sentez yolaklarında görev alan enzim eksikliklerinin bir sonucu olarak açığa çıkan ara metabolitlerin idrarda ve plazmada tespit edilebilmesinde ve bu bozuklukları öngörmede hedefli kütle spektrometri yönteminin etkili olduğunu göstermektedir.
Sıvı kromatografisi-tandem MS metodu ile granülositlerde lökosit sistin ölçümünün geliştirilmesi
Sistinoz, sistin taşınmasındaki bozukluğa bağlı olarak lizozomlarda sistin birikmesine yol açan nadir bir kalıtsal bozukluktur. Sisteamin tedavisi ile glomeruler hasar geciktirilir. Sistinoz tanısı ve sisteamin tedavi takibinde lökositlerde sistin konsantrasyonu ölçümü altın standarttır. Bu tez çalışmasında, lökosit içi sistin konsantrasyonu ölçümü için, duyarlılık ve doğruluğu yüksek bir ESI tandem MS metodunun geliştirilmesi amaçlanmıştır. Örnekler ACD tüplere alındı ve granülosit izolasyonu yapıldı. Sisteinin sisteine oksidasyonunu ve SH grupları ile interferansı önlemek için N-etilmaleimid kullanıldı. Sistin, 3N butil-HCl ile türevlendirildikten sonra di-butil ester türevi ESI tandem MS ile ölçüldü. Metodun 0 - 41.38 mol/L aralığında lineer olduğu saptandı. Çalışma içi ve günler arası presizyon (%CV) <% 6 ve kantitasyon limiti (LoQ) 0.095 mol/L idi. Geri elde % 92.2-107.4 olarak bulundu. Anlamlı bir carry over izlenmedi. Hemolizin anlamlı interferansa neden olduğu izlendi (bias %20). Sistinin -80 0C derecede saklanan örneklerde 30 gün stabil kaldığı ve don-çöz yapılmaması gerektiği bulundu. Sonuç olarak, bu çalışmada granülositlerde sistin ölçümü için yeni bir ESI-tandem MS metodu geliştirilmiştir. Sistein oksidasyonu ve sistinin disülfid değişim reaksiyonları NEM ile engellenmiştir. Analitik değerlendirme yöntemin yeterli olduğunu göstermiştir. Elde edilen kanıtlar göz önüne alındığında, bu metod sistinoz ve sisteamin takibinde lökosit içi sistin konsantrasyonu ölçümü için uygundur. Klinisyenler testi güvenilir bir şekilde rutin ölçümlerde kullanabilir.
Sülfür metabolizmasinda yer alan metabolitlerin miktar tayini için LC-MS/MS yönteminin geliştirilmesi ve valide edilmesi
Sülfür metabolitleri, hücresel fonksiyonda kritik roller oynarlar. Sülfür bileşiklerinin düzeylerindeki ve metabolizmasındaki değişikliklerin kanser ile ilişkilendirilmesi bu bileşiklerin klinikte hassas, doğru ve hızlı miktar tayinlerini yapabilme gereksinimini doğurmuştur. Özellikle biyolojik sorulara cevaplar ararken, spesifik metabolitlerin derişimlerinin doğru ve kesin olarak bilinmesi gerekir. Bu tür analizler hedeflenmiş metabolomiks çalışmalar ile elde edilebilir. Bu çalışmalarda LC-MS/MS yaklaşımları, üstün seçiciliği ve duyarlılıkları nedeniyle yaygın olarak kullanılmaktadırlar. Tez çalışmasında kısa analiz süresine (12 dk) sahip ve türevlendirme aşaması gerektirmeden sülfür metabolizmasinda yer alan metabolitlerin eş zamanlı analizi için yeni bir LC-MS/MS yöntemi sunulmuştur. Yöntem, metabolitler için 0,05-10 µg/mL aralığında doğrusal bulunmuştur. Geliştirilen yöntem validasyon çalışmaları ile seçici, kesin, doğru, duyarlı, doğrusal ve sağlam bulunmuştur. Geliştirilen yöntem insan hepatoselüler karsinom (HepG2), insan akciğer adenokarsinom (A549), insan sağlıklı akciğer epitel (BEAS-2B), insan kolorektal adenokarsinom (Caco-2) ve insan sağlıklı kolon epitel (FHC) hücre hatlarına uygulanarak sülfür metabolitlerinin miktarları belirlenmiştir.
İnsan serum bütirilkolinesterazının olası lipolitik aktivitesi-lipid metabolizması ile ilişkisi
Kolinesterazlar (AChE ve BChE), başlıca kas-sinir kavşaklarındaki kolinerjik sinapslarda asetilkolin uyarılı nörotranmisyonu sonlandırır. BChE ekspresyonunun esansiyel yağ asitleri tarafından düzenlendiğini daha önce göstermiştik. Lipazların ve kolinesterazların (ChE) katalitik bölgesinin benzeşmesi, ChE'lerin da çeşitli lipit ve fosfolipitleri hidroliz edebilecekleri hipotezini öne sürmemize neden oldu. ChE'lerin serbest yağ asitleri, trigliseritler ve fosfatidilkolin-sfingomiyelin gibi zar fosfolipitlerinin olası hidrolizi kromatografik ve spektrofotometrik-florometrik yöntemlerle incelendi. Ticari BChE-AChE ve insan plazmasından saflaştırılan BChE'nin lipolitik aktiviteleri farklı kaynaklardan kontrol enzimleri (Pankreatik (PanL) ve buğday tohumu (BTL) lipaz, fosfolipaz (PLA2), sfingomiyelinaz) ile birlikte değerlendirildi. BChE'nin PLA2 ve sfingomiyelinaz aktiviteleri tarandı. BChE'nin kısmi PLA2 aktivitesi gösterdiği, ancak sfingomiyelinaz aktivitesi göstermediği bulundu. Substrat olarak serbest yağ asidi hidrolizi, 4-mu palmitat ile gerçekleştirildi. Sonuçlar, saflaştırılan BChE'nin 4-mu palmitat'ı BTL kadar etkin hidroliz edebildiğini gösterdi. Michaelis-Menten kinetik sonuçları substrat olarak 4-mu palmitat kullanan enzimlerin afinitesini şu şekilde sıralar: BTL (10,4 µM)> Safl BChE (34,2 µM)> PanL (129,8 µM)> tic BChE (186 µM). Kolinesterazların trioleik asit (TO) hidrolizi GC-MS ve LC-MS/MS ile analiz edildi. TO hidrolizinin GC-MS sonuçları, saflaştırılan BChE'nin PanL'nin %7'si kadar oleik asiti ortama saldığını gösterdi. LC-MS/MS sonuçları PanL'nin diğer enzimlerden daha yüksek TO hidrolitik aktivitesi (18593 ppm/dk/mg protein enzim) olduğunu gösterdi (p<0,001). TO hidroliz yetisi olduğu bugüne kadar gösterilmemiş olan saflaştırılan BChE'nin aktivite değeri (714,3 ppm/dk/mg protein enzim), BTL'den (80,7 ppm/dk/mg protein enzim) daha yüksekti (p=0,024). Aynı çalışmalar ticari AChE ile gerçekleştirildi. Ancak AChE'nin adı geçen substratları hidroliz etmediği gözlendi. BChE aktivitesinin spesifik inhibitörü IsoOMPA varlığında ve BChE'nin lektin afinite kromatografisi sonrası elde edilen süpernatanda lipolitik aktivitesi çok düşüktü. Bu sonuç lipolitik aktivitenin BChE'ye ait olduğunu ve BChE'nin 4-mu palmitat ile trioleik asiti hidroliz ettiğini göstermektedir.
Metabolomik ve fluksomik çalışmalar ile kolon kanserinde kemoterapötiklere karşı direncin in vitro değerlendirilmesi
Günümüzdeki yenilikçi teknolojiler sayesinde omiks (genomik, transkriptomik, proteomik, metabolomik ve fluksomik) gibi karmaşık analizler yapılabilmektedir. Omik analizlerden elde edilen detaylı bilgi; hastalıkların mekanizmasını anlamak, erken teşhisini kolaylaştırmak, bireysel tedavi stratejilerini seçmek ve bunların etkinliğini değerlendirmek için büyük bir potansiyele sahiptir. Metabolomik fenotipinin belirlenebilmesi için çok sayıdaki metabolitin eş zamanlı ve kapsamlı analizlerinin yanı sıra döngü hızlarının da belirlenmesini gerektirir. Tez çalışmaları kapsamında kolorektal kanseri in-vitro modeli olan insan kolon adenokarsinom hücre hatlarına (Caco-2) ve kontrol olan insan fötal kolon hücre hatlarının (FHC) kematöratpotiklere karşı gözlenen direnç gelişimine bağlı olarak fenotipde gözlenen değişimler metabolomik, lipidomik ve fluksomik analizler ile incelenmiştir. Fluksomik analizlerde kararlı 18O izotopu işaretleme ajanı olarak kullanılmıştır. Metabolomik, lipidomik ve fluksomik analizlerin gerçekleştirilmesinde GC-MS ve LC-qTOF-MS analitik cihazları kullanılmıştır. Bu analizler sonucunda 300'ün üzerinde metabolit/lipit ve 38 metabolitin 18O işaretlenme yüzdeleri hesaplanmıştır. Tez kapsamında ilk kez 18O kararlı izotopu ile Krebs döngüsü metabolitleri, aminoasitler, yağ asitleri ve oligofosfonükleotitlerin işaretlenme yüzdeleri belirlenmiştir. İstatiksel olarak anlamlı bulunan metabolitler ile gerçekleştirilen yolak analizlerinde malat-aspartat mekiği, aminoasit, amonyak metabolizmaları ile glikoz-alanin ve üre döngülerine ait yolakların dirence bağlı olarak değiştiği gözlemlenmiştir. Elde edilen kapsamlı omiks (metabolomiks, lipidomiks ve fluksomiks) verileri, kemoterapötiklere karşı izlenen direncin hücre dinamiklerindeki farklılıklarını göstermiştir.
Meme kanserinde hedeflenmiş metabolitlerin LC-MS/MS Yöntemi ile tayinleri
Kadınlar arasında en sık görülen ve kansere bağlı ölümlerin % 18'ini oluşturan meme kanserinde en iyi koruyucu yöntem erken tanıdır. Metabolomik analizler erken tanıda ve hastalığın takibinde önemli rol almaktadırlar. Hedeflenmemiş metabolomik çalışmalarda hastalık tanısı için yeni belirteçlerin bulunması; hedeflenmiş metabolomikte ise seçilmiş belirteçlerin miktar tayinlerinin yüksek kesinlikte ve tekrarlanabilirlikte gerçekleştirilmesi amaçlanmaktadır. Bu çalışmada, kaynaklarda meme kanserinin erken teşhisi için önerilen yirmi altı metabolit seçilerek analizleri yapılmıştır. Hedeflenmiş metabolomik analizler 105 sağlıklı gönüllü, 172 erken evre ve 92 metastatik evredeki meme kanseri hastasına ait plazma örneklerinde gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) yöntemi geliştirilmiş ve valide edilmiştir. Analizler sonucunda glutamik asit, malik asit, gliserik asit, 3-hidroksibütirik asit, glutamin, prolin, kolin, fumarik asit, laktik asit, fumarik asit/glutamik asit ve malik asit/glutamik asit miktarlarının meme kanseri hastalarında önemli oranda değiştiği görülmüştür. Bu metabolitler meme kanserinin erken tanısında biyobelirteç olarak kullanılmak üzere önerilmektedir.
Mersin (Myrtus Communis l.) bitkisinin farklı ekstraktlarının fenolik içeriğinin belirlenmesi ve hücre kültüründe antioksidan – antiinflamatuar etkilerinin araştırılması
Mersin bitkisi (Myrtus communis L.), kırmızı meyveli üzümsü bir bitki olup, içerdiği fenolik bileşikler ve antosiyanidin bileşenlerinden dolayı güçlü antioksidan ve anti-inflamatuar özelliklere sahiptir. Bu çalışmanın amacı, mersin bitkisinin farklı ekstraktlarının antioksidan ve antiinflamatuvar etkilerini invitro belirlemek ve iyi bilinen bir antiinflamatuvar molekül olan ferulik asit içeriği en yüksek olan mersin ekstraktının invitro antiinflamatuvar etkisini araştırmaktır. Bu çalışmada mersin bitkisi yaprağı, kurutulmuş, kurutulmuş parçalanmış, ham mersin meyvesi, mersin çekirdeği ve çekirdeksiz mersin meyvesi kullanılmış, farklı zaman periyotlarında (1 dak., 3 dak., 5 dak., 10 dak.) demleme ve kaynama teknikleri ile ekstraktlar elde edilmiştir. Bu ekstraktlarda LC-MS/MS ile kateşin, etil ferrulat, gentisik asit, p-koumarik asit, sirinsik asit, kaempferol, epikateşin, rutin, kafeik asit ve ferulik asit gibi fenolik bileşiklerin miktarları belirlenmiş in-vitro antioksidan (FRAP, TEAC ve DPPH yöntemleri ile) ve antiinflamatuvar (hyaluronidaz inhibisyon miktar tayini ve WST-1 testi ile) aktivite testleri spektrofotometrik yöntemler ile gerçekleştirilmiştir. Ferulik asit içeriği ile antioksidan ve antiinflamatuvar aktiviteleri en fazla çıkan mersin bitkisi ekstraktlarının, makrofaj hücre kültüründe (human monocytic cell line, THP-1) sitokin seviyelerine (IL-1𝛼, IL-1𝛽, NF-κB, IL-6, IL-10, TNF-𝛼 ve IFN-𝛾) etkisi belirlenmiştir. Bu çalışma mersin bitkisinin demleme ve kaynama ekstraktlarının THP-1 hücre hattında antiinflamatuvar potansiyelini değerlendiren ilk çalışmadır. Çalışmanın ilk aşamasında demleme ve kaynama sonucu elde edilen mersin bitkisi ekstraktların LC-MS/MS analizlerinde en yüksek konsantrasyonlara genel olarak demleme ekstraktlarında 5. dakikada ulaşıldığı tespit edilmiş ve bu dakikadan sonra düşme veya artış yüzdelerinde azalmalar olduğu gözlenmiştir. Bu dakikalarda en yüksek konsantrasyonlara ferulik asit ve kaempferolün sahip olduğu tespit edilmiştir. Bu nedenle çalışmada 5. dakika süre seçilmiştir. Kurutulup parçalanmış meyvenin kaynaması ile elde edilen ekstrakttaki fenolik bileşiklerin konsantrasyonlarının diğer ekstraktlara oranlara daha fazla olduğu tespit edilmiştir. Bu ekstraktlarin TEAC, FRAP ve DHPP aktivitelerinin, LC-MS/MS sonuçlarına paralel olarak demleme ve kaynama süresi ile antioksidan aktivitelerde değişkenlik olduğu ve çoğunlukla artan zaman ile birlikte antioksidan aktivitelerde artış olduğu tespit edilmiştir. En yüksek aktivite gösteren mersin fraksiyonunun, kurutulup parçalanmış meyve ekstraktı olduğu ( TEAC (10,90 ± 0,36 - 18,53 ± 2,78), FRAP (0,67 ±0,05 - 3,45 ± 0,41) ve DHPP (22,32 ± 1,21 - 109,86 ± 0,52 ) tespit edilmiştir. Hyaluronidaz aktivitesinin inhibisyonu yüzdesinin demleme ve kaynama ekstraktlarının LC-MS/MS ve antioksidan sonuçları ile korelasyon gösterdiği ve bu korelasyonun en fazla kurutulup parçalanmış meyvenin 5. dakika ekstraktında olduğu tespit edilmiştir. WST-1 demleme ve kaynama ekstraktlarının inhibisyon yüzdelerinin LC-MS/MS ve antioksidan sonuçları ile korelasyon gösterdiği, çoğunlukla en yüksek inhibisyonların 5. dak ve 10. dakikalarda gözlendiği tespit edilmiştir. Çalışmanın 3. aşamasında in vitro antioksidan ve antiinflamatuvar etkileri en yüksek tespit edilen mersin bitkisi ekstraktı olan kurutulup parçalanmış ham meyvenin kaynama ve demleme ekstraktı ile ferulik asit'in; lenfosit hücre kültüründe inflamasyon üzerine etkileri belirlenmiştir. IL-1𝛽, TNF-𝛼 ve IFN-𝛾 sonuçları istatistiksel anlamlı olurken, NF-κB, IL-6, ve IL-1𝛼 düzeylerindeki düşüşler ile IL-10 düzeyindeki artış istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır. Bu projeden elde edilen veriler mersin bitkisi ekstraktlarının antioksidan ve antiinflamatuvar etkili olup, kansere ve otoimmun hastalıklara karşı koruyucu olabileceğini işaret eder niteliktedir.
Glikozaminoglikan tayini için moleküler baskılanmış kromatografik kolon dolgu materyali geliştirilmesi
Hücrelerarası alanın en yaygın moleküllerinden olan proteoglikanların temel yapısında, 'core protein'e (çekirdek protein) kovalan olarak bağlanmış bir ya da daha fazla glikozaminoglikan (GAG) zinciri bulunmaktadır. İdrarla eksrete edilen GAG düzeyleri, lizozomal depo hastalıklarının, özellikle de mukopolisakkaridozların tayin ve izleminde kullanılırlar. Son yıllarda ise idrar GAG tayininin değişik hastalıklarda (kronik böbrek rahatsızlıkları, renal fibroz, glomerüler filtrasyon sorunları, mesane taşı, meme ve akciğer kanserleri, hipertansiyon ve diabet, vb.) bir belirteç olarak kullanılabileceğini gösteren çalışmalar yayımlanmıştır. Bu gelişmelere karşılık, GAG yapısının yüksek polaritesi ve mikroheterojenitesi idrar GAG analizlerinin oldukça zor olmasına yol açmaktadır. Bu nedenle GAG analizi için yeni, spesifik ve kolay uygulanabilir yöntemler geliştirilmesine gereksinim bulunmaktadır. Bu çalışmada, biyolojik olarak tayinleri büyük öneme sahip Glikozaminoglikan türlerinden Heparan sülfat, kondroitin sülfat ve dermatan sülfat tayini ve ayırımı için kromatografik kolon materyali geliştirildi. Öncelikle bu üç Glikozaminoglikan kimyasal olarak parçalanmış elde edilen fragmanlar kütle spektrometresinde, Multiple Reaction Monitoring(MRM) ve Surface Induced Reaction(SIR) ile incelendi. Bu analizler ile elde edilen fragmanların bir kütüphanesi oluşturuldu. Bu ölçümlere göre polimerler karakterize edilmiştir. Moleküler baskılanmış polimer materyalleri de sadece bu üç moleküle karşı seçicilik gösteren, glikozamioglikanların negatif yüklü sülfat gruplarına non-iyonik ilgi gösteren akrilamid monomerinden elde edildi. Bu polimeri elde edebilmek için presipitasyon polimerizasyon tekniğinde termal polimerizasyon ile hazırlanmış moleküler baskılama tekniği kullanıldı. Bu teknikle elde edilen polimerler, çelik HPLC kolonu içerisine doldurulmuş, sonrasında yıkanarak içerisinde baskılanmış, Glikozaminoglikanlar uzaklaştırılmış sonrasında ise bu baskılanmış polimerler örnek uygulamasından sonra, tutma kapasitelerine bağlı olarak karakterize edildiler. Ölçümlerde kolon elüsyon zamanı her onbeş dakikada bir toplanan fraksiyonlara göre yapılmış ve farklı baskılanmış kolonlara göre farklı zamanlar bulunmuştur. Farklı zamanlara göre pompa sisteminde elüsyon uygulanarak örnek uygulaması yapılmış ve karakterizasyonu buna göre gerçekleştirildi. Standart grafiklerin oluşturulmasında 1000ng/mL'nin altındaki düzeylerde seri dilüsyon ile standart grafikleri oluşturulmuştur. İdrar örneklerinde ise ölçümdeki doğruluk gücünü artırmak için idrara 500ng/mL miktarıda her bir glikozaminoglikandan eklenmiştir. Baskılanmamış kör polimer ile yapılan çalışmalarda ise glikozaminoglikanlara seçimlilik gösterilmemiştir. Gerçekleştirilen bu çalışma, idrar ile atılan GAG'ların seçimli bir şekilde ayrılması ve böylelikle daha doğru, daha hızlı ve daha ekonomik tayini için moleküler damgalama yöntemiyle kromatografik kolon dolgu materyali geliştirilmesi hipotezine dayanmış ve başarılı bir şekilde bu hipotez kanıtlanmıştır. Bu yeni metodolojik yaklaşımla hazırlanan GAG seçimli polimerle, analiz edilen idrar örneklerinde GAG molekülleri kromatografik olarak daha doğru ve daha hızlı ve ekonomik bir şekilde ayrıştırılacaktır. Böylelikle idrar GAG analizinde yeni ve kolay bir yöntem geliştirildi ve bu polimer GAG ile ilişkili hastalıkların izlenmesindeki eksikliği/kısıtlılıkları gidererek GAG tayini çalışmalarında kromatografik kolon dolgu materyali olarak rutinde kullanılabilecektir.
Ankara'da satışa sunulan ballarda bazı neonikotinoidlerin LC-MS/MS ile araştırılması
Bu çalışma ile süzme ballarda asetamiprid, klotiyanidin, imidakloprid, tiyametoksam ve tiyakloprid kalıntılarının belirlenmesi için test yönteminin uyarlanması, uyarlanan yöntem ile neonikotinoid kalıntıların araştırılması, gıda güvenliği ve halk sağlığı açısından sonuçların değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Avrupa Komisyonu 2002/657/EC sayılı Kararına uygun olarak baldaki beş neonikotinoidin, likit kromatografi-tandem kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) yöntemi, analiz yöntemi eş zamanlı olarak hızlı ve güvenirilir bir şekilde geliştirilmiş ve tam olarak doğrulanmıştır. Yapılan çalışma sonucunda, CCα ve CCβ sırasıyla, Asetamiprid için 5,44 ve 5,89 ng/g, Klotiyanidin için 5,23 ve 5,46 ng/g, İmidakloprid için 5,15 ve 5,30 ng/g, Tiyametoksam için 5,16 ve 5,32 ng/g, Tiyakloprid için 20,28 ve 20,56 ng/g olarak bulundu. Metot validasyon parametreleri sağlandıktan sonra Ankara'da satışa sunulan 60 adet bal numunesin de maksimun kalıntı limitlerini aşan neonikotinoid kalıntısı varlığı belirlenememiştir. Uyarlanan yöntemin kısa zamanda, az kimsayal kullanılarak, etkili, güvenilir, duyarlı, tekraredilebilmesinin yanı sıra birden fazla analitin eş zamanlı olarak analiz edilebilir olması nedenleriyle kullanılabilir ve avantajlı olduğu sonucuna varılmıştır.
Difenil eter grubu herbisitlerin biyolojik numunelerden tayinine yönelik sıvı kromatografisi yöntemi geliştirilmesi ve pestisit-protein etkileşimlerinin incelenmesi
Bu tez çalışması kapsamında Aklonifen ve Bifenoks pestisit bileşiklerinin YPSK yöntemi kullanılarak analizi için gerekli parametreler bulunmuş ve bu parametrelere bağlı olarak da eş zamanlı analizleri yapılmıştır. Bu amaçla hareketli faz organik çözücü yüzdesi, tampon çözelti molaritesi, kolon, akış hızı, sıcaklık ve pH kullanılarak analizler için en iyi koşullar belirlenmiştir. Optimizasyon ve validasyon işlemleri tamamlanarak geliştirilen yöntemimizde literatürdeki birçok analiz yöntemine göre daha iyi ve etkin bir ayrım ve daha iyi geri kazanım, teşhis sınırı ve tayin alt sınırı değerleri elde edilmiştir. Hesaplanan validasyon parametreleri doğrultusunda ise geliştirilen yöntemin doğru, duyarlı, kararlı bir yöntem olduğu söylenebilmektedir. Sonuç olarak bulunan veriler doğrultusunda, Aklonifen ve Bifenoks pestisit maddelerinin biyolojik numunelerden eş zamanlı analizi için hızlı, duyarlı, kesin, kolay uygulanabilir, doğru, ekonomik ve herhangi bir ön ayırma işlemi gerektirmeyen analiz yöntemi geliştirilmiştir. Geliştirilen analiz yönteminin biyolojik numunelerden bu maddelerin eş zamanlı analizine başarılı bir şekilde uygulanabilir olduğu istatistiksel olarak gösterilmiştir. Ayrıca kullanılan pestisit bileşiklerinin dolaşım sisteminde ana taşıyıcı protein olarak bulunan insan serum albümini (HSA) ile etkileşimlerinin floresans spektroskopisi ve hesaplamaları teknikleri ile incelenmesi amaçlanmış, floresans ve absorbsiyon spektroskopisinden elde edilen sonuçlar ACF/BİF ve HSA arasındaki kompleksleşmeyi doğrulamıştır. Artan sıcaklıkla beraber KSV değerlerindeki artış, HSA flüoresansının ACF/BİF kaynaklı sönümlemesinin dinamik sönümleme olduğunu göstermiştir. Oda sıcaklığında, pestisitlerin HSA ile bağlanma afiniteleri ACF–HSA kompleksi için Kf=3,47 × 105 M-1; BİF–HSA kompleksi için Kf =1 × 105 M-1 olarak bulunmuştur. Sıcaklık artışıyla beraber bağlanma sabiti değerlerinde artış gözlenmiştir. Termodinamik verilerin sayısal olarak değerlendirmesi (ACF-HSA kompleksi için ΔS= +0,864 kJ mol–1K–1, ΔH = 225,43 kJ mol–1 ve BİF-HSA kompleksi için ΔS= + 1,11 kJ mol–1K–1, ΔH = 304,63 kJ mol–1) sonucunda bulunan sonuçlar, ACF-HSA ve BİF-HSA komplekslerinin oluşumunda hidrofobik bağların daha etkili olduğunu göstermiştir.
Konjenital adrenal hiperplazi ile izlenen hastaların takiplerinde ve metabolik kontrollerinde immünoassay ve sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi (LC-MS) yöntemleri ile ölçülen steroid hormon düzeylerinin karşılaştırılması
Giriş: Konjenital adrenal hiperplazi (KAH) adrenal kortekste kolesterolden kortizol sentez basamaklarında yer alan enzimlerden birinin genetik defekti sonucu ortaya çıkan, otozomal resesif geçişli kalıtsal bir hastalıktır. Konjenital adrenal hiperplazi çocuklarda en sık görülen primer adrenal yetmezlik sebebidir. En sık görülen KAH formu 21-Hidroksilaz eksikliğidir ve tüm olguların yaklaşık %90'ını oluşturur. Bunun dışında daha az sıklıkta görülen KAH formları: 11β-Hidroksilaz, 3β-Hidroksisteroid dehidrogenaz, 17αHidroksilaz/17,20-Liyaz eksikliği, Konjenital Lipoid Adrenal Hiperplazi ve sitokrom P450 Oksidoredüktaz eksikliğidir Her enzim eksikliği steroidogenezde farklı etkiler yaparak olgularda değişik klinik ve laboratuvar bulgulara yol açarlar. KAH hastalarının tanı ve izleminde kullanılan steroid hormon düzeyleri immünoassay ve LC-MS (sıvı kromatografisikütle spektrometresi) ile çalışılmaktadır. Amaç: Çalışmada Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Anabilim Dalı, Çocuk Endokrinoloji Bölümünde KAH hastalarının takibinde kullanılan steroid hormon değerleri immunoassay ve LC-MS yöntemi ile değerlendirilerek her iki yöntemin birbiri ile korelasyonuna ve steroid hormon düzeylerin klinik kontrolle ilişkisine bakıldı. Hastalar ve yöntem: Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Anabilim Dalı Çocuk Endokrinoloji Polikliniği'nde KAH tanısıyla takip ve tedavi edilen 49 hastanın dosyası incelendi. Araştırma sürecinde uygun kriterlere sahip olan hastalar kayıt altına alınıp araştırmaya dahil edildi. Her bir hastanın demografik bilgileri, oksoloji verileri, klinik bulguları, steroid hormonların eş zamanlı immünoassay ve LC-MS sonuçları, izlemi ve tedavi sırasında oluşan komplikasyonlar değerlendirildi. Her iki yöntemle bakılan steroid hormon düzeylerin klinik kontrolle ve birbiri ile korelasyonlarına bakıldı. Verilerin analizinde SPSS 11.5 ve MedCalc 22 programından faydalanıldı. Bulgular: AÜTF Çocuk Endokrinoloji Bilim Dalı'nda izlenen 49 KAH tanılı hasta değerlendirmeye alındı. Çalışma kapsamında KAH tanılı hastaların yaş aralığı 0,48 ile 21,43 yıl arasında olup, yaş ortalaması 10,53±5,90 yıldı. Hastaların %63,3'ünü kızlar ve %36,7'sini erkekler (31 kız ve 18 erkek) oluşturmaktaydı. Olguların %51,0'i prepubertal ve %49'u pubertal dönemdeydi. Hastaların 45'inde (%91,9) KAH'ın nedeni 21-hidroksilaz eksikliğiydi. Bu hastaların 26'sı (%57,8) tuz kaybettiren, 4'ü (%8,9) basit virilizan, 15'i (%33,3) ise non-klasik form 21-hidroksilaz eksikliğine sahipti. Tüm olguların %6,1'ini (3 hasta) 11βhidroksilaz eksikliği oluşturuyordu. Ayrıca 17-alfa hidroksilaz tanılı 1 (%2,0) hasta çalışmaya dahil edilmişti. Hastalara ait tanı yaşı ortalaması 1,87±3,08 yıl olarak hesaplandı. 21-hidroksilaz eksikliği TK formu hastalarında ortalama tanı yaşı 0.8±2 yıl, BV KAH hastalarında 4,65±5,4 yıl, NK KAH formunda 4.67±9.5 yıl olarak hesaplandı.11-beta hidroksilaz eksikliği hastalarında ortalama tanı taşı 0,67±1,15 yıl olarak ölçüldü. Komplikasyon gelişen 21 KAH hastasının %18,4'ünde obezite, %12,2'sinde puberte prekoks, %18,4'ünde hipertansiyon, %4,1'inde polikistik over sendromu , %6,1'inde boy kısalığı ve %2'inde testiküler adrenal rest tümör (TART) saptandı. Çalışmada KAH tanılı hastadan 78 örnek sonuçları değerlendirildi. 17-OHP, DHEA-S, kortizol, testosteron ve estradiol için LC-MS ve immünoassay değerleri arasında anlamlı fark bulunmadı. Aldosteron için eş zamanlı gönderilen örnek sayısı az olduğu için tam değerlendirme yapılamadı. İki yöntemle ölçülen steroid hormonların tamamında laboratuvar sonuçları birbiri ile istatistiksel olarak korele bulundu. Steroid metabolitlerin immünoassay ve LC-MS değerleri arasında en az fark DHEA-S için, en yüksek fark ise 17-OHP için kaydedildi. 21-hidroksizlaz eksikliği tanılı KAH hastalarını metabolik kontrol durumlarına göre iki gruba ayırdık. 21 -hidroksilaz eksikliği olan 45 hastadan 25'i (% 55) Grup 1 (yetersiz kilnik kontrol), 20 hasta (%45) ise Grup 2 (iyi klinik kontrol) olarak sınıflandırıldı. Klinik olarak iyi ve kötü kotrollü olarak sınıflandırılan hasta grupları arasında tanı yaşı, demografik ve oksoloji veriler, hidrokortizon tedavi dozları arasında istatistiksel anlamlı fark bulunmazken, laboratuvar parametrelerden sadece androstenodion için istatistiksel anlamlı fark saptanmış oldu. Sonuç: KAH hastalarının laboratuvar takplerinde immünoassay ve LC-MS yöntemleri ile bakılan steroid hormon sonuçlarını karşılaştırdık. Her iki yöntemle bakılan hormon sonuçlarında tüm metabolitler birbiri ile uyumlu değerlendirildi. Çalışmamız sonucunda KAH hastalarının takiplerinde immünoassay ve LC-MS yöntemlerinin birbiri üzerinde belirgin üstünlüğü saptanmadı. Klinik olarak iyi ve kötü kotrollü olarak sınıflandırılan hasta grupları arasında laboratuvar parametrelerden sadece androstenodion için istatistiksel anlamlı fark saptanmış oldu. Anahtar kelimeler: Konjeniltal Adrenal Hiperplazi, 21- hidroksilaz eksikliği, 11βhidroksilaz, eksikliği, immünoassay, LC-MS
Çeşitli kayısı örneklerinde bakır spesiasyonu (türlendirme)
Bu çalışmada, ülkemiz ekonomisi ve insan sağlığı açısından yüksek beslenme değerine sahip olan Malatya yöresi kayısılarının; pestisid uygulanmış ve uygulanmamış kayısı örneklerinin, olgun, gün kurusu ve kükürtlenmiş örneklerinde bakır fraksiyonlaması yapılmıştır.Toplam element analizi için; mikrodalga ile çözünürleştirme koşulları ve FAAS için çalışma koşulları sertifikalı referans materyaller olan Standart Şeftali Yaprağı (NIST 1547) ve Standart Kabak (IAEA 359) ile belirlendikten sonra, bu koşullarda kayısı örnekleri çözünürleştirilerek toplam Cu içerikleri FAAS ile tayin edilmiştir.Kayısı matriksi içinde bulunan fenolik bileşenlerin ve polifenollerin analizi için ekstraksiyonlar hızlandırılmış ekstraksiyon cihazı ile yapılmıştır. En uygun ekstraksiyon koşullarının belirlenmesi için; farklı çözgen karışımları, sıcaklık, süre ve basınç gibi koşullar spektrofotometrik olarak Folin- Ciocaltue yöntemi kullanılarak toplam fenolik madde tayini üzerinden belirlenmiştir. Ekstraksiyonda optimum çözgen karışımı metanol:su ve su, sıcaklık; 60 C0, süre; 60 dk ve basınç; 1500 psi olarak belirlenmiştir. Ayrıca her bir polifenol bileşeni HPLC ile analizlenmiştir.Kayısı örneklerinden ekstraksiyonlar, metanol:su ve sadece su ile optimize edilmiştir. Ekstraksiyonla elde edilen ekstraktlarda; polifenol bağlı Cu Amberlite XAD-7, katyonik Cu Dowex-50X8 ve anyonik Cu Amberlite IRA 458 reçinesinde fraksiyonlandıktan sonra FAAS tayin edilmiştir. Ekstraktlardaki serbest veya labil bakır ise Cu-ISE ile analizlenmiştir. Ayrıca mide özsuyu tarafından emilen bakırın tayini için pepsin çözeltisi ile ekstraksiyonlar yapıldıktan sonra toplam ve serbest bakır içerikleri FAAS ile tayin edilmiştir. Ayrıca; metanol:su, sadece su ve pepsin çözeltilerinin her bir ekstraktının polifenol içerikleri ise HPLC ile kantitatif olarak tayin edilmiştir. Buna göre ilaçlı kabaaşı kayısı için metanol:su ekstraktlarının polifenol bağlı bakır içeriği; bu örneklerin asitle çözünürleştirmedeki toplam bakır(mg/kg) miktarı ölçü alınarak, V. Hasat için %53,06, V. Hasatın gün kurusu için %50,83 ve V. Hasatın kükürtlüsü için %31,76'sını oluştururken; ilaçsız kabaaşı kayısıda ise V. Hasat için %55,82, V. Hasatın gün kurusu % 54,55 ve V. Hasatın kükürtlüsü ise 41,78'ini oluşturmaktadır. İlaçlı kabaaşı kayısının katyonik bağlı bakır içeriği; V. Hasat için % 15,50'sini, V.hasatın gün kurusu % 15,63 ve V. Hasatın kükürtlüsü ise %13,65'ini oluşturmaktadır. İlaçlı kabaaşı kayısıda sadece saf su ekstraktlarının polifenol bağlı bakır içeriği; bu örneklerin asitle çözünürleştirmedeki toplam bakır derişimi ölçü alınarak, V. Hasatın %37,77'sini, V. Hasatın gün kurusu için %37,50 ve V. Hasatın kükürtlüsü için %16,71'ini oluştururken; ilaçsız kabaaşı kayısıda ise V. Hasat için %50,34, V. Hasatın gün kurusu % 50,51 ve V. Hasatın kükürtlüsü için ise 43,11'ini oluşturmaktadır. Kayısı örneklerinden ilaçlı kabaaşı kayısının mide çözeltisindeki bakır içeriği ise; V. Hasatın %69'unu, V. Hasatın gün kurusu için %50,83 ve V. Hasatın kükürtlüsü için ise %61,65'ini oluştururken; ilaçsız kabaaşı kayısının V. Hasatı için %65,75, V. Hasatın gün kurusu % 65,99 ve V. Hasatın kükürtlüsü için ise 56,89'unu oluşturmaktadır. Kayısı örneklerinde en fazla bulunan polifenol; gallokateşindir. Bu polifenolün dışında en fazla bulunan diğer fenolik maddeler sırasıyla; epikateşin, rutin, klorogenik asit, kateşin ve kafeik asit olarak bulunmuştur. Belirlenen bu sonuçlara göre, örnekler ile metal içerikleri ve polifenoller arasında anlamlı korelâsyonlar bulunmuştur.
Akrilamidin gıda maddelerinde oluşumuna etki eden faktörlerin incelenmesi ve miktarının tayini
Akrilamid patates cipsleri, bisküvi ve kahve gibi çeşitli gıda maddelerinde sıklıkla bulunan, sıcaklıkla oluşan gıda zehirlerinden biridir. Akrilamidin bazı nörotoksik ve karsinojenik etkiler gösterdiği ispatlanmış ve Uluslararası Kanser Araştırma Ajansı tarafından insanlar için olası karsinojen olarak 2A grubunda sınıflandırılmıştır. Bu çalışmanın amacı akrilamidin tayini için ucuz, basit ve duyarlı bir yöntem geliştirmek ve Türkiye'de üretilen bazı gıdaların akrilamid seviyelerini göstermektir. 80 örneğin akrilamid derişimi foto diyot dizisi detektörlü yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile incelenmiştir. Akrilamid ve metakrilamid (iç standart) isokratik elüsyon tekniği kullanılarak bir ters faz kolonu (GL Sciences, Inertsil® ODS-3) ile ayrılmıştır. Hareketli faz (asetonitril: su, 2: 98, v/v) 0.5 mL.dak-1 akış hızında pompalanmış ve analitler 200 nm dalga boyunda ortalama 15 dakika içinde detekte edilmiştir. Örnekler katı faz temizleme kullanılarak hazırlanmış ve sisteme ek ekstraksiyon veya ön deriştirme basamağı uygulanmadan enjekte edilmiştir. Akrilamid ppb seviyelerinde yeterli kromatografik çözünürlükle detekte edilmiştir. Sonuç olarak, gıdalarda bulunan akrilamid miktarının pişirme şartlarına bağlı olarak değiştiği ve özellikle kahve ve patates cipsleri olmak üzere birçok örnekte nispeten yüksek bulunduğu gözlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Akrilamid, gıda analizi, sıvı kromatografisi, Türk gıdaları
P maddesi ve kalsitonin gen-ilişkili peptid'in çeşitli analitik yöntemlerle ölçülmesi
Bu çalışmada sıçan beyin, beyin sapı dokusunda P maddesi ve Kalsitonin gen-ilişkili peptid'in Sıvı Kromatografisi-Tandem Kütle Spektrometrisi ve Enzim Bağlı İmmunosorbent Analiz yöntemiyle analizi gerçekleştirilmiştir. C8 kolon (150x2.1 mm, 3.5 µm) ve %0.2 formik asit içeren su-asetonitril gradiyent hareketli faz sisteminde ayrılan P maddesi ve Kalsitonin gen-ilişkili peptid için kütle spektrometri optimizasyon parametreleri belirlenmiş, ardından yöntemin validasyonu gösterilmiştir. P maddesi ve Kalsitonin gen-ilişkili peptid için pozitif polaritede elde edilen kütle spektrumu ve sırasıyla m/z 674.3→[600+254.4] ve 952.2→1214.0 iyon geçişleri kullanılmıştır. Doğrusal aralık P maddesi için 5.85-438.52 ng/mL, Kalsitonin gen-ilişkili peptid için 0.21-155.28 ng/mL'dir. Yöntemin tayin sınırları P maddesi için 5.85 ng/mL, Kalsitonin gen-ilişkili peptid için 0.21 ng/mL'dir. Yöntemin doğruluğu P maddesi için %98'den büyük, Kalsitonin gen-ilişkili peptid için %87'den büyük geri kazanım ile, tekrar edilebilirliği ise gün içi ve günler arası P maddesi için %15'den küçük, Kalsitonin gen-ilişkili peptid için %11 bağıl standart sapma ile gösterilmiştir. Bu yöntem sıçan beyin ve beyin sapı dokularına uygulanmıştır. Yöntemin beyin dokusundaki doğruluğu P maddesi için %97'den büyük geri kazanım ile, kesinliği ise %7'den küçük bağıl standart sapma ile gösterilmiştir. Beyin sapı dokusundaki doğruluğu P maddesi için %98'den büyük, Kalsitonin gen-ilişkili peptid için %95'den büyük geri kazanım ile, kesinliği ise Substance P için %7'den küçük, Kalsitonin gen-ilişkili peptid için %13'den küçük bağıl standart sapma ile gösterilmiştir. Doku numunelerinin (n=6) analizine göre, beyin sapı dokusundaki P maddesi ve Kalsitonin gen-ilişkili peptid bazal endojen derişimler sırasıyla 415.10±124.80 ng/g, 132.07±196.77 ng/g olarak, beyin dokusundaki P maddesi derişimi ise 57.95±38.01 ng/g olarak hesaplanmıştır. Beyin dokusunda Kalsitonin gen-ilişkili peptid düzeyi yöntemin tayin sınırının altında kaldığı için hesaplanamamıştır. Enzim Bağlı İmmunosorbent Analiz yöntemiyle, P maddesi ve Kalsitonin gen-ilişkili peptid için kit prosedürleri kullanılarak beyin ve beyin sapı dokusundaki derişimleri incelenmiştir. P maddesi düzeyi beyin ve beyin sapında belirlenememiştir. Kalsitonin gen-ilişkili peptid düzeyi ise beyin sapında 2351.24±292.49 ng/g, beyinde 1567.96±55.47 ng/g olarak belirlenmiştir.
Bazı gentiana türlerinin farmakognozi yönünden incelenmesi
Gentiana türleri halk arasında sindirimi kolaylaştırıcı, antidiyabetik, antiinflamatuvar, hepatoprotektif ve antihipertansif gibi pek çok tıbbi amaçla kullanılmaktadır. Gentiana asclepiadea L., G. brachyphylla Vill., G. cruciata L., G. gelida Bieb., G. olivieri Griseb., G. pyrenaica L., G. septemfida Pallas., G. verna L. subsp. pontica (Soltok.) Hayek, G. verna L. subsp. balcanica Pritchard ve ülkemiz için endemik olan G. boissieri Schott et Kotschy ex Boiss. türlerinden elde edilen ekstre ve fraksiyonların LC/MS-IT-TOF ile analizlerinde; sekoiridoitler; gentiopikrozit, sverozit, svertiamarin, loganin, svertianolin, norsvertianolin, 3'-asetil sverozit, flavon glikozitleri; östomoruzzit viteksin ve orientin bellidin, bellidifolin ve ksanton-C glikozitleri; mangiferin ve oleanolik asit tespit edilmiştir. Biyolojik aktivite sonuçlarına göre; G. boissieri, G. brachyphylla, G. cruciata metanol ekstreleri belirgin DNA hasarı koruyucu; G. cruciata, G. asclepiadea ve G. boissieri metanol ekstreleri yüksek metal şelatlayıcı; G. verna subsp. pontica metanol fraksiyonu yüksek ABTS•+ radikal katyon renksizleştirici; G. brachyphylla etil asetat ve metanol fraksiyonları yüksek DPPH• serbest radikal süpürücü antioksidan aktivite; G. pyrenaica, G. brachyphylla ve G. verna subsp. pontica metanol ekstreleri ile G. pyrenaica, G. brachyphylla metanol fraksiyonları çok yüksek MAO-A ve MAO-B inhibitör; G. olivieri metanol ekstresi çok yüksek BChE inhibitör ve orta düzeyde COX-2 inhibitör etki göstermiştir. Ayrıca Gentiana ekstrelerinin genotoksik etkiye sahip olmadığı görülmüştür. Tez kapsamında, G. boissieri, G. brachyphylla, G. gelida, G. pyrenaica, G. verna subsp. balcanica ve G. verna subsp. pontica türlerinin antioksidan, antiinflamatuvar, antikolinesteraz etkileri; G. asclepiadea, G. cruciata, G. boissieri, G. brachyphylla, G. gelida., G. olivieri ve G. septemfida türlerinin MAO-A, MAO-B inhibitör etkileri ve G. asclepiadea hariç diğer türlerin genotoksik etkileri ilk kez çalışılmıştır. Anahtar Sözcükler: Gentiana sp., LC/MS-IT-TOF, antioksidan, MAO, BChE inhibitör.
Assessment of the relationship between drug level and cytochrome p450 enzyme activities in patients demanding genetic polymorphism and escitalopram monitorization
Therapeutic Drug Monitorization (TDM) is used to determine the concentration of drug in plasma to adjust the dose of therapeutic drug. Selective and sensitive analytical methods are used to determine drug and metabolite levels for the successful application of TDM. The aim of the study was to develop and validate a new method using liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS / MS) to analyze quantitative assay of escitalopram ( S-CT) and its metabolites in human plasma and urine samples. Also, association between metabolic ratio (MR) of S-CT and its metabolites and cytochrome P450 enzyme activities (CYP2C19 and CYP2D6) of patients were assessed using this validated method in order to determine individual pharmacokinetic characteristics. It is thought that besides knowing the pharmacokinetic characteristics of patients, pharmacodynamics characteristics of individuals have an essential role in increasing the success of the treatment. Therefore, serotonin transporter protein (5-HTT) polymorphism distribution of the same patients was examined as well. With the study, it is aimed that it could help the physician provide a convenient and safe treatment dose for the patients. In this study, plasma and urine samples collected from patients using escitalopram as part of their treatment in NPİstanbul Brain Hospital were analyzed by LC-MS / MS at Üsküdar University Clinical Pharmacogenetic Laboratory and the concentration of S-CT, dimethyl escitalopram (S-DCT) and didemethyl escitalopram (S-DDCT) were measured. In addition, a genotyping study was performed from whole blood samples taken to identify CYP2C19, CYP2D6 and pharmacodynamic (5-HTT) polymorphisms of the same patients and statistical evaluation was performed by looking at the relationship between blood level results and MR of patients with their genotyping results. The mean S-DCT and S-DDCT concentrations of the 30 patients with mean plasma escitalopram concentration of 27.59 ng/mL were 85.52 ng/mL and 44.30 ng/mL, respectively. The mean S-CT / S-DCT value of the S-CT, metabolized to the S-DCT by the CYP2C19 enzyme as the major pathway, was calculated to be 0.40. In this study, it is found that the mean MR of patients in the CYP2C19 EM and IM groups is different compared to the UM group. Therefore, it is thought that by considering the S-CT / S-DCT value for many patients without genotyping analysis, a pre-assessment can be made regarding the CYP2C19 enzyme activity. Also, it is found that the mean MR of patients in the CYP2D6 EM and CYP2D6 Het. EM group is different compared to the CYP2D6 IM group. When the response of 30 patients to drug treatment with 5-HTT polymorphism distribution of patients was examined, it was observed that the difference between the groups was statistically significant (p <0.05). While a statistical significance ( p < 0.05) was detected between LL (long:long) and SS (short:short) groups in reponse to treatment, no statistical significance in the response to treatment was found between the LS (long:short) group and the other groups (p> 0.05). Evaluation of the data obtained from our study by physicians is thought to be able to contribute treatment of patients in the application of individual drug treatment.