Molecular biology
115 theses under this subject heading
İnterferon-gama, HSA-MIR-24-3P ve HSA-MIR-181D-3P plazma ekspresyon seviyeleri ve IFGN RS2069727 T/C tek nükleotit polimorfizminin MS riski ve glatiramer asetat tedavisi kapsamında klinik ve ın silico yaklaşımlarla incelenmesi
Multipl skleroz (MS), merkezi sinir sisteminin (MSS) kronik otoimmün bir hastalığıdır. En sık görülen klinik tipi tekrarlayan-düzelen MS'tir (relapsing-remitting MS, RRMS). İnterferon-gama (IFN-gamma), MS'te görülen enflamatuar yolda önemli rollere sahiptir. IFNG genindeki varyasyonlar ve bazı mikroRNA'lar (miRNA) IFN-gama ifadesini etkilemektedir. IFNG rs2069727 T/C varyasyonunun MS ile ilişkisi Türk toplumunda ilk kez bu çalışma ile araştırılmıştır. Ayrıca çalışmamızda, plazmadaki IFN-gama seviyeleri ile bu seviyeyi etkilediği düşünülen IFNG rs2069727 T/C varyasyonu ve hsa-miR-24-3p ve hsa-miR-181d-3p rölatif ekspresyon seviyeleri, MS riskine ve engellilik puanlarına etkileri yönünden incelenmiştir. IFN-gama protein seviyesi ve bu seviyeyi etkilediği düşünülen hsa-miR-24-3p ve hsa-miR-181d-3p rölatif ekspresyon seviyeleri RRMS tanısı ve glatiramer asetat (GA) tedavi yanıtı açısından ilk kez birlikte değerlendirilmiştir. Bu çalışmada, "genetik polimorfizm" ve "miRNA ve ELISA" çalışma grupları olmak üzere iki çakışan grup, 2017 McDonald Revize Kriterleri'ne göre oluşturulmuştur. Genetik polimorfizm grubu için 330 RRMS hastası ve 330 kontrol dâhil edilmiştir.Bu grubun içerisinden ilaç tedavisine başlanmamış (treatment-naïve, naif) 25 RRMS hastası, GA tedavisi alan 25 RRMS hastası ve 25 kontrol, miRNA ve ELISA çalışması bölümüne dâhil edilmiştir. Genetik polimorfizm çalışma grubundaki MS hastalarının genotiplemeleri gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile gerçekleştirilmiştir. miRNA ve ELISA çalışma grubu katılımcılarının plazma hsa-miR-24-3p ve hsa-miR-181d-3p rölatif ekspresyon seviyeleri kantitatif gerçek zamanlı PCR ile; plazma IFN-gama seviyesi ise ELISA yöntemi ile belirlenmiştir. Örnekler Ankara Bilkent Şehir Hastanesi Nöroloji Polikliniği'nden alınmıştır. IFNG rs2069727 T/C varyasyonu gruplar arasında incelenmiş ve genotip dağılımları açısından anlamlı bir farklılık bulunmamıştır. Plazma rölatif ekspresyon analizinde, hsa-miR-24-3p ve hsa-miR-181d-3p seviyelerinin GA ve naif hastalarda kontrol grubuna göre anlamlı derecede yüksek olduğu; yaşa göre düzenlenmiş plazma IFN-gama seviyelerinin ise GA ve naif hastalarda kontrol grubuna göre anlamlı derecede düşük olduğu tespit edilmiştir. Çalışmada, tüm grupta yapılan analizde, düşük IFN-gama seviyesine (≤1.311 pg/mL) sahip bireylerin hsa-miR-24-3p rölatif ekspresyon seviyelerinin yüksek IFN-gama (>1.311 pg/mL) grubunda bulunan bireylerinkinden istatistiksel olarak anlamlı ölçüde yüksek olduğu; düşük hsa-miR-181d-3p seviyesine (≤ 2.90) sahip bireylerin plazma IFN-gama seviyelerinin yüksek hsa-miR-181d-3p seviyesine (>2.90) sahip bireylerinkinden istatistiksel olarak anlamlı ölçüde yüksek olduğu bulunmuştur. Bu çalışmada, IFNG genini düzenleyen miRNA'lar ve transkripsiyon faktörlerin ağı in silico analizlerle oluşturulmuştur. Dahası, hsa-miR-24-3p ile, GA tedavisiyle ilişkilendirilen genler içerisinden C-tipi lektin alan ailesi 16 A üyesi ve katepsin S arasında bir etkileşim bulunmuştur. Bu tez, ileride yeni biyosensörlerde kullanılabilecek yeni potansiyel tanı testlerinin geliştirilmesi, bu sayede RRMS'in erken teşhisi ve prognoz takibinin daha kolay bir şekilde yapılabilmesi ve hsa-miR-24-3p ve hsa-miR-181d-3p'yi RRMS tedavisi için ilaç hedefi olarak değerlendiren yeni çalışmaların gerçekleştirilmesi açısından Biyomedikal Mühendisliği alanına önemli katkılar sunan bir çalışma niteliğindedir.
Transplantasyon başarisinda etkili olan donöre özgün alloreaktif hafiza B hücre rezervinin değerlendirilmesi
Alloantikorlara ek olarak, alloreaktif hafıza B hücre (mBC) rezervi, transplantasyon süreçleri sırasında immünolojik risk değerlendirmesi için bir potansiyele sahiptir. Şu anda alloreaktif mBC değerlendirmesi için, HLA tetramer boyama kullanılarak doğrudan Akış Sitometrik (FC) analizi bir seçenektir. Poliklonal olarak uyarılmış alloreaktif mBC'ler tarafından üretilen alloantikorların in vitro kültür sisteminde değerlendirilmesi, başka bir yararlı yaklaşım gibi görünmektedir, ancak bunun daha fazla ek uygulaya ihtiyacı vardır. Bu çalışmada, mBC tespiti için in vitro poliklonal olarak aktive edilmiş mBC kültür süpernatanlarının ve potansiyel donörün lenfositlerinin kullanıldığı Akış Sitometrik Çapraz Eşleştirmenin (FCXM-süpernatant) yararlılığını araştırdık. Allosensitize edilmiş 10 böbrek nakli hastasından elde edilen poliklonal olarak aktive edilmiş mBC'lerin kültür süpernatanları ile bunların alloimmünize edilmemiş donörlerinin lenfositleri ve tam tersi olacak şekilde FCXM-süpernatant deneyleri yapıldı. HLA tiplemesi SSP yöntemi ile yapıldı. İn vitro aktifleştirilmiş alloreaktif mBC'ler tarafından üretilen anti-HLA antikorları da Luminex testleri ile değerlendirildi. mBC'lerin in vitro poliklonal aktivasyonunun başarısı, toplam IgG ELISA testi ve FC tarafından antikor salgılayan hücre analizleri ile değerlendirildi. Donöre özgü alloreaktif mBC'ler, allosensitize edilmiş 10 vakanın %45'inde FCXM-süpernatant tarafından tespit edildi. Güçlü allosensitize vakalarda tespit oranı %85 (7'de 6) idi. Allosensitizasyon olmayan kontrol vakalarında hiçbir alloreaktif mBC tespit edilmedi. Allosensitize vakaların FCXM süpernatant negatif sonuçları, süpernatanların toplam IgG antikor testleri ile değerlendirilen düşük düzeyde allosensitizasyon ve yetersiz poliklonal stimülasyon ile ilişkiliydi. Bu çalışmada, doku tipleme laboratuvarlarında gerçekleştirilen rutin bir teste kolayca dönüştürülebilmesi için FCXM-süpernatant testi kullanılarak donöre özel bir şekilde alloreaktif mBC tespiti için pratik bir metodoloji sunuyoruz.
Buğday (Triticum aestivum L.) bitkisinde kuraklık ile ilişkili bazı hareketli genetik elementlerin (transpozon) ve fizyo-biyokimyasal parametrelerin incelenmesi
Biyotik ve abiyotik stres etmenleri çeşitli bitkilerde önemli ürün kayıplarına neden olmakta, insan ve hayvan beslenmesini olumsuz yönde etkilemektedir. Kuraklık en bilinen abiyotik stres faktörlerinden birisidir. Dünya üzerindeki kullanılabilir alanlar stres faktörlerine göre sınıflandırıldığında doğal bir stres faktörü olan kuraklık stresi %26' lık payıyla en büyük dilimi içermektedir. Bitkilerde kurağa dayanıklılık mekanizmasının geliştirilmesi oldukça karmaşık ve uzun bir süre gerektiren işlemdir. Bu yüzden bitkinin bazı moleküler, biyokimyasal fizyolojik ve morfolojik özelliklerinin degişik çevre kosulları altında büyük önem taşımaktadır. Bitkilerin yetistirildikleri çevrede, kurağa dayanımını etkileyen çok sayıda faktör vardır. Bu durum, kurağa dayanıklı genotiplerin geliştirilmesini oldukça güçleştirmektedir. Kurağa dayanıklılık gösteren bitkilerdeki moleküler fizyolojik ve biyokimyasal sistemler ise karmaşık yapıyı olusturmaktadır. Kurak koşullar altında bu sistemler arasındaki etkileşimler ve verim ile olan ilişkileri yapıyı daha da karmaşık hale getirmektedir. Bu tez çalışmasında, kuraklık stresi uygulanmış farklı buğday çeşitlerinde (Gün91, Bezostaja), gen fonksiyonu ve genom üzerinde önemli etkileri bulunan bazı transpozon genlerinin ifade seviyeleri eş-zamanlı PZR ile ölçülmüştür. Elde edilen sonuçlar, bitki gelişimi için önemli olarak tanımlanan klorofil, glutatyon redüktaz, yaprak oransal su içeriği, kuru ve yaş ağırlık gibi bazı fizyo-biyokimyasal parametreler ile karşılaştırılmıştır. Dolayısı ile ekmeklik farklı buğday çeşitlerininın kuraklık stresine karşı gösterdiği moleküler fizyolojik cevaplar ortaya konulmuştur. Sonuç olarak, bu tez çalışması ile kuraklık stresi altında ki buğdayın geliştirdiği moleküler ve fizyo-biyokimyasal değişimler ile ilgili literature yeni bilgiler kazandırılmıştır. Anahtar Kelimeler: Antioksidan, Buğday, Gen İfadesi, Kuraklık Stresi, Klorofil, Transpozon
Ferula L. cinsine ait bazı türlerinin iPBS-retrotranspozon dna markörleri ile moleküler karakterizasyonu
Bu tez çalışmasında, Türkiye'de doğal olarak yayılış gösteren Ferula L. cinsine ait 20 farklı türe ait toplam 76 genotipin genetik çeşitliliği iPBS-retrotranspozon DNA markörleri kullanılarak değerlendirilmiştir. Araştırma kapsamında, iPBS belirteçleri ile genotiplerin genetik yapıları incelenmiş ve türler arasındaki genetik farklılıklar detaylı şekilde analiz edilmiştir. Kullanılan 83 iPBS primerinden 10 tanesi analizler için uygun bulunmuş ve bu primerlerle toplam 80 polimorfik bant elde edilmiştir. Primer başına gözlemlenen allel sayısı 5 ile 15 arasında değişmiş, ortalama Polimorfizm Bilgi İçeriği (PIC) değeri ise 0.251 olarak hesaplanmıştır. Genetik çeşitlilik analizleri sonucunda; ortalama etkin allel sayısı (Ne) 1.554, Nei'nin genetik çeşitlilik indeksi (h) 0.3234 ve Shannon bilgi indeksi (I) 0.4868 olarak belirlenmiştir. Elde edilen moleküler veriler NTSYSpc (Dice benzerlik katsayısı), POPGEN1.32 ve STRUCTURE yazılımları kullanılarak analiz edilmiştir. Kümeleme analizleri, genotiplerin genetik benzerlik düzeylerine göre gruplandığını göstermiştir. Genetik yapı analizi sonucunda ise bireylerin iki farklı alt gruba ayrıldığı ortaya konmuştur. Elde edilen bulgular, iPBS-retrotranspozon markörlerinin Ferula türlerinin genetik çeşitliliğini ortaya koymada etkili bir araç olduğunu göstermektedir. Bu çalışma, Ferula cinsi üzerine yapılacak genetik, filogenetik ve koruma biyolojisi araştırmalarına önemli katkılar sağlayacağı kanatindeyiz.
APP geni ekzon 16 ve 17 bölgesinin klonlanması ve protein izolasyonu
Amiloid Beta Öncü Proteini (APP), Alzheimer hastalığının gelişiminde kritik rol oynayan tip I transmembran bir glikoproteindir. İnsan 21. kromozomundaki APP geni tarafından kodlanan bu protein, sinir sistemi işlevlerinde ve hücresel sinyal yollarında önemli görevler üstlenmektedir. APP'nin proteolitik parçalanması sonucu oluşan Aβ peptitlerinin beyinde birikmesi, Alzheimer hastalığına özgü amiloid plakların temelini oluşturmaktadır. Bu tez çalışmasında, APP proteininin rekombinant formda üretimi hedeflenmiştir. Bu amaçla APP gen fragmanı içeren bir yapay vektör sistemi tasarlanmış ve moleküler klonlama yöntemleriyle uygun ekspresyon vektörüne aktarılmıştır. Rekombinant plazmid, prokaryotik bir sistemde hedef protein ekspresyonunu sağlamak üzere konak hücrelere taşınmıştır. Protein üretiminin ardından, afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırma işlemi gerçekleştirilmiş ve elde edilen ürün SDS-PAGE ile analiz edilmiştir. Sonuç olarak, hedef proteinin yüksek saflıkta elde edilmesini sağlayan bir üretim ve saflaştırma protokolü geliştirilmiştir. Bu sistemin, APP temelli biyobelirteç veya peptid terapisi çalışmalarında kullanılmak üzere güçlü bir temel oluşturabileceği öngörülmektedir. Anahtar Kelimeler: APP, Rekombinant Protein, Biyoteknoloji, E. coli
Cüce kertenkelenin, Parvilacerta parva (Boulenger, 1887), Anadolu Yarımadası'ndaki biyocoğrafyası ve haplogrup kompozisyonu üzerine araştırmalar
Bu çalışma kapsamında yayılış alanının çok önemli bir kısmı Anadolu Yarımadası olan cüce kertenkelenin (Parvilacerta parva) populasyonları arasındaki morfolojik ve filogenetik ilişkiler araştırılmıştır. Ayrıca iklimsel faktörlerin türün dağılımını günümüzde ve geçmişte (son buzul maksimumunda) nasıl etkilediği ortaya konarak, türün dağılım model haritaları çıkarılarak, olası sığınak alanları belirlenmiştir. Modelleme çalışmalarından elde edilen sonuçlar, cüce kertenkelenin Anadolu populasyonlarının kolonize olmasında özellikle iklime bağlı faktörlerin etkili olduğunu göstermiştir. Geçmişte yoğunlukla Batı Anadolu'ya ve Van yöresine sığınan kertenkeleler, günümüzde ise Anadolu'nun step habitatlarına yayılmış durumdadırlar. Morfolojik karakterler üzerinden yapılan istatistiksel analizler de, türün yayılış dinamiklerine uygun olarak, günümüz coğrafyası ve yer şekillerinden ziyade, geçmişten gelen iklim bazlı hareketliliğin bir sonucu olarak makrobölgesel düzeyde kolonileşmelerinin olduğunu göstermiştir. Bu kapsamda belirlenen Doğu, Orta ve Batı Anadolu makrobölgeleri arasında, özellikle kafa kısmına ait morfolojik karakterlerde, kademeli değişimler ve anlamlı korelasyonlar belirlenmiştir. Filogenetik analizler ise mitokondrial sitokrom b geni (862 bç) üzerinden yapılmıştır. Bu gene ait diziler, maksimum benzerlik, maksimum parsimoni ve Bayes çıkarımı ile test edilmiştir. Tür içi bir çalışma olduğu için, bazı dallara ait bootstrap değerleri çok yüksek belirlenemese de, özellikle Bayes çıkarımı analizi ile Doğu Anadolu populasyonlarının, Orta ve Batı Anadolu populasyonlarından ayrı bir kladda oldukları, Van populasyonunun Doğu Anadolu'dan ziyade, Orta Anadolu populasyonuna daha yakın bir dalda kümelendiği, en genç populasyonların ise Batı Anadolu'dakiler olduğu belirlenmiştir. Ayrılma zamanı analizleri de, türün kolonileşmesindeki ayrışmaların coğrafi bariyerlerden ziyade, iklim bazlı faktörler olduğunu göstermiştir. Zira optimal ılıman iklim koşulları, türün sığınak alanlarından yayılmasını sağlamıştır. Bu durumun bir sonucu olarak, filogenetik ağaçtaki her anlamlı dallanmanın özellikle Pleistosendeki buzullar arası dönemlere denk geldiği saptanmıştır. Ayrıca bu türün, Parvilacerta cinsinin diğer üyesi olan Fraas kertenkelesinden (Parvilacerta fraasi), Messinian tuzluluk krizinin etkilerinin görüldüğü dönemde ayrılmış olabileceği hesaplanmıştır. Anahtar Kelimeler: cüce kertenkele, Parvilacerta parva, Anadolu, morfoloji, filogeni, tür dağılım modeli
Periferik arter hastalığında pelaton geni ile RNA hasarı arasındaki ilişkinin araştırılması
Ateroskleroz; kronik inflamasyon, oksidatif stres, epigenetik ve metabolik disfonksiyonu içeren immüno-metabolik bir hastalıktır. Periferik arter hastalıkları (PAH), koroner arterler ve aort dışındaki arter hastalıklarını ifade etmektedir. PAH'ın ana nedenleri arasında ateroskleroz, vasküler darlık, inflamasyon ve endotelyal fonksiyon bozukluğu bulunmaktadır. Son yıllarda, uzun kodlanmayan RNA (lncRNA)'ların kardiyovasküler hastalıklardaki rolleri önem kazanmıştır. Yapılan çalışmalarda, bir lncRNA olan PELATON ekspresyonunun aterosklerotik plakların nekrotik, inflamatuvar ve makrofajdan zengin bölgelerinde konumlandığı gösterilmiştir. PELATON'un in vitro olarak makrofajlarda yıkımı sonucu, hücrenin fagositoz gerçekleştirme yeteneğinin önemli ölçüde azaldığı bildirilmiştir. Lipoproteinlerin veya eritrositlerin fagositozu, aterom plak ilerlemesinin ayrılmaz bir parçasıdır ve plak instabilitesinin gelişimi ile güçlü bir şekilde ilişkilidir. PELATON gibi fagositozu pozitif olarak düzenleyen bir lncRNA, bu hızı ve plak ilerlemesini azaltmada potansiyel bir hedef olabilir. Çalışmamızın amacı, PAH ve sağlıklı kontrollerde PELATON geninin ekspresyon düzeyini belirlemek ve DNA/RNA'nın oksidatif hasarında rol oynayan belirteçlerden 8-Hidroksi-2′-deoksiguanozin (8-OHdG), 8-hidroksiguanozin (8-OHG) ve 8-hidroksiguaninin plazma düzeylerini tespit etmektedir. Çalışmamızda PAH tanısı alan 100 hasta ve 100 sağlıklı kontrolde gen ekspresyonu düzeyleri Kantitatif Gerçek Zamanlı-Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qRT-PCR), DNA/RNA oksidatif hasar düzeyleri ELISA yöntemi ile belirlendi. Çalışmamızda, lncRNA PELATON ekspresyon düzeyi, PAH grubu ve sağlıklı kontrol grubu arasında kıyaslandığında anlamlı bir fark gözlenmedi (p=0.119). 8-OHG, 8-OHdG ve 8-hidroksiguanin düzeyleri iki grup arasında karşılaştırıldığında anlamlı bir fark tespit edilmedi (p = 0.31). PAH grubunda PELATON gen ekspresyonu ile CRP (r=0.024, p=0.83), total kolesterol (r=0.014, p=0.91), LDL kolesterol (r=0.117, p=0.36), kreatin kinaz MB (r= 0.273, p=0.391) düzeyleri arasında pozitif yönde korelasyon saptandı, ancak sonuçlarımız istatistiksel anlamlılık sınırına ulaşmadı. Bu durum sınırlı hasta sayısından kaynaklı olabilir. Çalışmamız, PAH hastalarında PELATON ekspresyonunun gerçekleştirildiği ilk çalışma özelliğini taşımaktadır. Sonuç olarak, PELATON ekspresyonunun PAH hasta grubunda yüksek bulunmasına rağmen istatistiksel anlamlılık sınırına ulaşmaması, PELATON geni ile PAH patogenezi arasında kuvvetli bir ilişki bulunmadığını düşündürmektedir.
Kistik fibrozis hastalarında fenotipik ciddiyeti etkileyen genlerin ve ilişkili yolakların araştırılması
Otozomal resesif kalıtılan hastalıklar arasında en sık görülen kistik fibrozis, Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) genindeki mutasyonlar sonucu oluşmaktadır. Hastalık ciddiyetinin belirlenmesinde CFTR mutasyonlarının yanı sıra ciddiyeti modifiye eden genler ve çevresel faktörler rol oynamaktadır. İlginç bir bulgu olarak, aynı CFTR mutasyonuna sahip olmalarına rağmen farklı klinik ciddiyete sahip hastalar da bulunmaktadır. Ciddiyetin hastalarda heterojenlik göstermesi ve genotip-fenotip korelasyonunun kurulamaması tedavi yaklaşımlarını oldukça zorlaştırmaktadır. Tez çalışması kapsamına; Sınıf II grubunda yer alan, F508del/F508del ve F508del/G85E mutasyonlarını içeren iki hasta kardeşten oluşan iki aile, Sınıf IV grubunda yer alan I1234V/I1234V mutasyonunu içeren üç hasta kardeşten oluşan bir aile ve kronik hastalık öyküsü olmayan üç sağlıklı kontrol dahil edilmiştir. Klinik seyirleri farklı olan (ağır/ hafif) hasta kardeşler arasında ifade farklılığı gösteren genler gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu prensibine dayalı kistik fibrozis PCR array yöntemiyle saptanmış ve bu genlerle ilişkili yolaklar tanımlanmıştır. Sınıf II grubunda yer alan ağır seyirli hastalarda, inflamasyon ve immün cevapta görevli IL-17(CXCL1, CXCL2), NF kappa B (TNFRSF11A), TNF, sitokin-sitokin etkileşimi, araşidonik asit, nekroptozis, SNARE etkileşim (STX1A) ve sodyum iyonunun geri emilim (SLC9A3R2) yolakları saptanmıştır. Sınıf IV'e özgü olarak AGE-RAGE, TLR sinyal yolakları bulunmuştur. Tüm hastaların birlikte değerlendirilerek kontrol grubu ile karşılaştırıldığında ifade farklılığı anlamlı genler ICAM1, EZR, TNFRSF1A ve HSP70 olarak belirlenmiştir. Ek olarak, hastalarda ifade farklılığı gösteren genler ile karaciğer tutulum bulguları arasında korelasyon saptanarak bu genlerin AGE-RAGE, sitokin-sitokin etkileşim ve insülin direnci sinyal yolaklarında yer aldıkları gösterilmiştir. Bu çalışma ile, aynı sınıf mutasyona sahip ağır ve hafif seyir gösteren hasta kardeşler arasında fenotipik ciddiyeti etkileyebilecek genler ve ilişkili yolaklar aydınlatılmıştır. Tez çalışması, ileri dönemde tedavi için yeni hedef moleküllerin geliştirilmesine olanak sağlayabilecektir. Anahtar Kelimeler: Kistik fibrozis, CFTR, modifiye edici genler,genotip-fenotip ilişkisi
Geç dönemde hastanede gelişen pnömoni etkenlerinin hızlı moleküler biyolojik yöntemler ile saptanması
Giriş ve Amaç: Hastaneye yatışı takip eden 5. günden sonra ortaya çıkan geç dönemde hastanede gelişen pnömonilere (HGP) genellikle çok ilaca dirençli bakteriler neden olmaktadır. Etkenlerin geç saptanması, uygun antibiyotiğin zamanında başlanamaması HGP prognozunu olumsuz olarak etkilemektedir. Son yıllarda enfeksiyon etkeni mikroorganizmaların hızlı moleküler yöntemlerle kısa sürede izole edilmesi, tedavinin daha erken ve etkin olarak başlanmasını sağlamaktadır. Bu durumun prognozu olumlu yönde etkileyeceği düşünülmektedir. Bu çalışmada, HGP'de etkenlerin hızlı moleküler yöntemlerle saptanması ve sonuçların konvansiyonel yöntemlerle karşılaştırılması amaçlanmıştır. Gereç-Yöntem: Ocak 2014 ile Ocak 2016 tarihleri arasında Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Göğüs Hastalıkları ile Anestezi ve Reanimasyon yoğun bakım ünitelerinde izlenen ve 2005 yılında yayınlanan ATS-IDSA kriterlerine göre HGP tanısı alan 62 hasta çalışmaya alınmıştır. HGP tanısı konulduğu anda hastalardan bronkoskopik (BAL, BASP) ve nonbronkoskopik (mini-BAL) yöntemlerle alt solunum yolu örnekleri alınmıştır. Alınan örnekler hem konvansiyonel yöntemler ve hem de hızlı moleküler yöntemlerle bakteriyolojik etkenler açısından incelenmiştir. Bulgular: Hasanede gelişen pnömoni tanısı alan 62 hasta (42 erkek, yaş ortalaması 69.7±15.6) alınmıştır. Hastaların %95.2'sinde ek hastalık olup, 33 hastaya invaziv mekanik vetilasyon (İMV), 28 hastaya İMV + noninvaziv mekanik ventilasyon (NİV) uygulanmıştır. Hastanede gelişen pnömoni tanısı anında 59 hastanın 39'inin akciğer grafisinde tek taraflı infiltrasyon, 20'sinde çift taraflı infiltrasyon saptanmıştır. Üç hastanın akciğer grafisinde ise tek taraflı infiltrasyon yanısıra plevral efüzyon uyumlu dansite artışı izlenmiştir. Konvansiyonel yöntem ile 62 hastanın 40'ında (%64.5) bakteriyel etken saptanırken, polimeraz zincir reaksiyon (PCR) ile 62 hastanın 57'sinde (%91.9) bakteriyel etken izole edilmiştir. Etken saptanması açısından konvansiyonel yöntem ile PCR yönteminin birbiriyle uyumlu olduğu gözlenmiştir (kappa:0.797). Ayrıca, PCR ile etken saptanma oranının anlamlı olarak yüksek olduğu görülmüştür (p=0.0004). Her iki yöntem ile en sık Acinetobacter baumannii saptanmıştır. İzlemde 62 hastanın 45'inde (% 72.6) mortalite izlenmiştir. Sonuç: Geç dönemde ortaya çıkan HGP etkenlerinin saptanmasında konvansiyonel yöntemler ile PCR arasında uyumun iyi olduğu ve PCR ile daha fazla hastada etken saptanabileceği bu çalışmada gösterilmiştir. Bakteriyel etkenlerin hızlı moleküler yöntemlerle saptanmaya başlanmasının, hastanede gelişen pnömoni etkenlerinin hızla belirlenmesi sonucu, etkin bir şekilde tedavi edilmesinin yolunu açabileceği düşünülmüştür.
Çeşitli kaynaklardan izole edilen Aspergillus section Nigri türlerinin fenotipik ve moleküler biyolojik yöntemlerle karakterizasyonu
Çalışmanın amacı, Aspergillus section Nigri grubu içerisinde yer alan mikrofungusların tür düzeyinde morfolojik ve moleküler biyolojik özelliklerine dayalı olarak karakterize edilmesidir. Bu amaç için, İzmir ili ve çevresinden çeşitli hava, toprak ve gıda örnekleri alınarak, bu örneklerde bulunan section Nigri üyesi Aspergillus kolonileri izole edilmiştir. İzole edilen mikrofungus türlerinin tanısı Klich 2002'de belirtildiği üzere 5 farklı besiyerinde makro ve mikromorfolojik özelliklerin tayini ile fenotipik olarak yapılmıştır. Moleküler tanılama amacıyla DNA izolasyonunda UltraClean® Microbial DNA Isolation Kiti (MoBio Laboratories, Inc.), EZNA Fungal DNA Kiti (Omega Bio-tek., Inc.) kullanılmıştır. Tüm Aspergillus section Nigri türlerinin kalmodulin sekans verisi ile birbirinden ayırt edilebilmesi sebebiyle Varga et al 2007'de belirtilen şekilde kalmodulin geninin filogenetik analizi gerçekleştirilmiştir. Çalışmanın sonucunda gıda ürünleri, toprak ve hava gibi çeşitli kaynaklardan toplam 150 adet Aspergillus section Nigri üyesi izole edilmiştir. Morfolojik çalışmalar sonucunda 5 farklı tür (A. awamori, A. carbonarius, A. foetidus, A. japonicus ve A. niger) elde edilirken moleküler çalışmalar sonucunda 10 farklı tür (A. acidus, A.acuelatus, A. awamori, A. carbonarius, A. foetidus, A. japonicus, A. neoniger, A. niger, A. tubingensis, A. uvarum) tanılanmıştır. Elde edilen moleküler veriler fenotipik tanıyla tanılamayan 5 türün varlığını göstermiştir. Böylelikle çalışma sonucunda özellikle Aspergillus section Nigri üyeleri olmak üzere mikrofungusların tanısında sadece fenotipik yöntemlerinin kullanımının subjektif gözlemlere dayalı olması, tanı anahtarlarının güncel olmaması nedeniyle yetersiz olduğu açığa konmuştur.
Possible interactors of alsin and effects of its expression on four motor neuron disease-related proteins
Motor neuron disorders, characterized by selective motor neuron degeneration, consist of a large group of diseases with overlapping genes and common pathological mechanisms. Mutations in ALS2, associated with three types of motor neuron disorders with early age of onset, result in a loss of function of the protein, suggesting a crucial role of the protein product, alsin, in motor neuron integrity. However, the exact function of alsin is not known yet. This study aims to gain insights into alsin?s function by investigating its relations both at mRNA and protein levels with proteins that are involved in different motor neuron disorders. Spastin (Spg4) and spartin (Spg20), selected as representative genes, are involved in upper motor neuron disorders, while heat shock protein B1 (HspB1) and heat shock protein B8 (HspB8) were selected due to their associations with lower motor neuron disorders. Since ALS2 mutations result in a loss of function, an Als2 knock-down stable cell line was generated. Q-RT PCR revealed statistically significant alterations in the expression levels of Sgp20, Spg4, HspB1 and HspB8 in this cell line, as compared to the control cell line. For the first time in literature, the inhibitory effect of Als2 on HspB1 expression under heat shock conditions implicated a possible role of alsin in heat shock response. At the protein level, it was observed that spartin and alsin were colocalized in the perinuclear region of differentiated neuronal N2a cells. Furthermore, immunoprecipitation studies revealed the co-precipitation of these proteins in the same protein complex, indicating a possible physical interaction. We hope that this thesis, the first study, showing relations of alsin with spartin and HspB1, will contribute to this unexplored field.
Identification and in vivo analysis of putative WNT target genes with effective roles in cancer
One of the most common driving forces in hepatocellular carcinoma (HCC) is the aberrant activation of the Wnt/ß-catenin signaling due to the accumulation of mutant ß-catenin in the cell. Our group previously detected several genes with altered expression levels upon the overexpression of ß-catenin in the HCC cell line, which are suggested to be novel Wnt/ß-catenin targets that may play effective roles in cancer. In this study, our aim was to elucidate the roles of these putative Wnt/ß-catenin target genes in tumorigenesis with an in vivo analysis in Drosophila. For this purpose, we downregulated the selected 16 putative Wnt/ß-catenin target genes in two Drosophila cancer models using RNA interference (RNAi) and examined their effects on tumor and metastasis formations. Results from the RNAi screen revealed novel roles for the analyzed 16 putative Wnt/ß-catenin target genes in tumorigenesis. The analyzed 13 putative Wnt/ß-catenin target genes? downregulations promoted tumor and metastasis formations in Drosophila, suggesting a tumor suppressor function; whereas the other 3 genes? downregulations suppressed the tumor and metastasis formations and hindered the development in the analyzed tissues, suggesting an oncogenic or developmental role for these genes. These findings could serve to identify novel subjects for cancer research in order to provide insight into diagnostic and therapeutic processes of several cancer types as well as further characterization of the canonical Wnt/ß-catenin signaling pathway.
Identification of novel genes involved in planar cell polarity establishment in the Drosophila eye
In multicellular organisms proper functioning of tissues requires precise patterning of cells, which is acquired by apical-basal and planar cell polarization. To establish planar cell polarity (PCP), cells have to organize themselves along the plane of the epithelium. The mechanisms leading to this organization include several signalling pathways and cytoskeletal arrangements. Although general aspects of PCP have been elucidated, a complete view has not been established yet. It is known that genetic control of planar cell polarization is highly conserved among vertebrates and invertebrates. The Drosophila eye is a remarkable model system to study PCP, which is evident in organization of photoreceptors (PRs) into trapezoidal structures pointing to opposite directions in different halves of the eye. In the process of polarization, PR clusters require correct specification of R3/R4 cells, followed by chirality establishment and ommatidial rotation. We aimed to identify novel genes involved in PCP establishment by following two approaches. In the first approach, effects of six putative R3/R4 specific genes (CG33259, cropped, faint sausage, polychaetoid, Stubble, taranis) were analyzed by RNAi down-regulation, and faint sausage (fas) was determined as a promising candidate. Then, we generated recombinant fas-mutant flies to use in further mutant analyses. In the second approach, R3/R4 cells were sorted by FACS and analyzed by RNA-Seq in order to identify differentially expressed (DE) genes that might have role in PCP establishment. From this analysis, ets domain lacking (edl) appeared to be an interesting candidate. Additionally, we used this dataset to predict putative transcription factors that might be regulating differentially expressed genes. These analyses yielded six putative regulators of the DE genes in R3/R4: Trithorax-like, Grainy head, Jim, DNA replication-related element factor, Cropped, and CG7928. Furthermore, gene regulatory network data were used to dissect the Svp targetome, hypothesizing that this targetome might be containing genes contributing to PCP in the eye. Out of four putative targets that were selected for validation (couch potato, bruchpilot, futsch, pebbled), only one, pebbled, was verified as being regulated by Svp.
Characterization of novel WNT/β-catenin pathway targets
The Wnt/β-catenin signaling pathway is an evolutionary conserved pathway which has important functions in vertebrate early development such as axis formation, cellular proliferation and morphogenesis. The activation of this pathway leads to translocation of the transcriptional activator β-catenin into the nucleus where it activates T-cell factor/Lymphoid enhancer factor (Tcf/Lef) family of transcription factors, which regulate expression of developmental and cell cycle-related genes. Apart from its roles in various cellular processes, Wnt/β-catenin signaling pathway is also one of the most important intracellular pathways implicated cancer progression. A significant number of identified target molecules of this pathway, are known to have tumorigenic characters when mutated. Previous studies confirmed BRI3 (Brain protein I3) gene to be one of the transcriptional target genes of Wnt/β-catenin pathway. We used various approaches for the functional characterization of its novel targets. As a first step in our study, IFITM3 and MGAT1 proteins were confirmed as interaction partners for BRI3 by Yeast-two Hybrid and Co-IP techniques. BRI3 was found to be upregulated in response to TNF-α treatment and overexpression of BRI3 resulted in an increase in NFkB promoter activity. On the other hand, MGAT1 is a putative novel target of Wnt/β-catenin signaling pathway and determined to be upregulated in response to β-catenin activation. Cell proliferation and migration assays showed that, Huh7 cells stably expressing each of the BRI3 and MGAT1 genes have greater proliferative and invasive capabilities compared to control Huh7 cells. Furthermore, in vivo xenograft experiments were performed and it was determined that the stable overexpression of both of these genes in Huh7 cell lines lead to increased rate of tumor growth in NUDE/SCID mice. The resulting tumors were subjected to transcriptomic analyses using RNA-Sequencing technique in order to determine which pathways and biological processes take part in the cancer initiation process.
Montivipera wagneri ve M. raddei engerek türlerinin zehirlerinden L-amino asit oksidaz enziminin kısmi saflaştırılması
Yılan zehrinin bir bileşeni olan L-amino asit oksidaz (LAAO), L-amino asidin α-keto aside oksidatif deaminasyonunu katalize ederek hidrojen peroksit (H2O2) üreten bir flavoenzimdir. L-amino asit oksidaz, apoptoz indüksiyonu, trombosit agregasyonu, kanama, hemostaz ile etkileşim, ödem oluşumu, antitümör, antiparazit, antienflamatuvar, antimikrobiyal, anti-HIV, antilayşmanyaz ve zehirlenme toksisitesi gibi çok çeşitli biyolojik aktivitelere sahiptir. Bu aktiviteleri, kanser ve AIDS gibi bazı hastalıklarda terapötik ajan olarak kullanılma potansiyeline gündeme getirmiştir. Bu tez kapsamında yapılan çalışmada Montivipera wagneri ve M. raddei zehirlerinden LAAO enziminin kısmi saflaştırılması gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla jel filtrasyon kromatografisi ile fraksiyonlama yapılmıştır. Her bir fraksiyonun enzim aktivitesi substrat olarak L-lösin kullanılarak gerçekleştirilen spektrofotometrik ölçüm ile test edilmiş ve LAAO enziminin aktif olduğu fraksiyon belirlenmiştir. Ayrıca SDS-PAGE yöntemi ile iki tür için LAAO enzim aktivitesi belirlenen fraksiyonlardaki proteinlerin indirgenmiş ve indirgenmemiş olarak molekül ağırlıkları belirlenmiştir. Sonuç olarak M. wagneri ve M. raddei türlerinin zehrinde belirgin aktiviteye sahip LAAO enzimi bulunduğu tespit edilmiş, kısmi saflaştırılması gerçekleştirilerek enzimin yapısı ve aktivitesi hakkında bilgi edinilmiştir. Mevcut tez bu amaçla gerçekleştirilmiş ilk çalışmadır. Bu çalışma ile M. raddei ve endemik tür olan M. wagneri zehirlerinden LAAO saflaştırılması ve karakterizasyonunun yapılarak enzimin biyoteknolojik açıdan değerlendirilmesi için önemli bir adım atılmıştır.
Asetat ortamında büyütülen cereıbacter sphaeroıdes O.U. 001, rhodopseudomonas palustrıs 7850 ve cuprıavıdus necator h16 ile polihidroksibütirat (PHB) üretimi ve üretilen polimerlerin karakterizasyonu
Dünyada nüfus artışı, yenilenemeyen kaynakların azalışı ve günlük hayatımızın bir parçası olan plastik ürenlerin çoğalması, petrol türevli plastiklerin doğada kalbolmaması sonucu oluşan çevre kirliliği güncel problemler arasındadır. Biyo uyumlu, parçalanabilir ve yenilenebilir özellikleriyle termoplastik bir polimer olan polihidroksibütirat (PHB) geleneksel plastiklerin birçok özelliğine sahiptir. Bu biyopolimer sentetik karbon bazlı polimerlere alternatif olarak uygundur. Alcaligenes, Rhodobacter, Bacillus, Rhizobium, Pseudomonas gibi farklı mikroorganizmalar tarafından sentezlenmektedir. Monomerlerin birleştirilmesi ve sentezi olarak enzimatik aşamaların gerçekleşmesi ile polimer biyosentezi gerçekleşir. Polihidroksibütirat (PHB) biyosentezini β-ketotiyolaz, asetoasetil-CoA, PHB polimeraz/sentaz enzimleri ve phbA, phbB, phbC genleri sağlar. PHB bakteriler, topraktaki mikroorganizmalar ve funguslar tarafından uygun koşullar altında parçalanarak karbondioksit, enerji ve su açığa çıkarmaktadır. Biyoparçalanabilir özelliğinden kaynaklı olarak tıp, ziraat, tekstil ve paketleme gibi birçok alanda kullanılmaktadır. Üretimde kullanılması açısından uygun substrat ve besi ortamı kullanıldığıda maliyet azaltılabilmektedir. Cereibacter sphaeroides, Rhodopseudomomas palustris ve Cupriavidus necator 70 mM asetat 2 mM ile sınırlandırılmış amonyum ortamında büyümeleri ve PHB üretimi incelendi. Asetat oranı 10, 25, 40, 55, 70, 85 ve 100 mM ortamlarda optik dansitelerine (OD) bakılarak karar verildi. 70 mM asetat besiyerinde C. sphaeroides, R. palustris ve C. necator'da sırasıyla 4.3, 5.7 ve 3.0 OD değerleri aynı sıra ile 9.6, 9.8 ve 9.1 pH değerleri ölçüldü. PHB granülleri Sudan Black B ve Nile red gibi lipofilik boyalarla tespit edildi. Sudan Black B boyaması ışık mikroskobunda bakıldığında bakteriler içerisinde PHB yoğunluğuna göre mor, mavi, siyah renkler arasında renkler gözlemlendi. Nile red ile floresans mikroskobunda bakıldığında ise küçük noktalar şeklinde kırmızı bir ışıma gözlemlendi. PHB'nin en iyi çözücüsü olan kloroform ile ekstraksiyonu yapıldığında C. sphaeroides'in 14,6 mg, R. palustris'in 31,1 mg, C. necator'un 5,4 mg PHB kuru ağırlıkları tartıldı. PHB verimi incelendiğinde sırasıyla bakterilerde; C. sphaeroides %0,054, R. palustris % 0,11, C. necator % 0,034 değerlerine ulaşıldı. Asetat ortamında PHB üretimine en yüksek seviyede R. palustris'de ulaşılmıştır. Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi yöntemi ile PHB karakterizasyonu yapılmış, C. sphaeroides ve R. Palustris bakterilerinden saf PHB elde edildiği, C. necator'da elde edilen PHB'nin ise diğer bakterilere kıyasla saf olmadığı ve bazı kirliliklerin de olduğu tespit edilmiştir. Bu çalışma kapsamında C. sphaeroides, R. palustris ve C. necator'da asetat besiyerinde PHB üretimi ve üretim sonucunca PHB verimi incelenmiştir.
Kavunda (Cucumis melo L.) sıcaklık stresine cevabın transkriptom düzeyinde araştırılması
Kavun (Cucumis melo L.) bitkisi ekonomik açıdan önemli bir bitkidir. Ülkemiz dünya genelinde kavun üretiminde ikinci sırada yer almaktadır. Kavunla ilgili birçok transkriptomik çalışma raporu farklı abiyotik stres koşullarında incelenmiştir. Fakat kavunda sıcaklık stresinin transkriptomik analizi ilişkin rapor eksikliği devam etmektedir. Bu nedenle, sıcaklık stresi altında kavun transkriptomunda meydana gelen değişiklikleri incelemek amacıyla mevcut araştırma yürütülmüştür. Transkriptomik çalışmalar bitkilerin karmaşık birçok özelliğinin ve işlevinin moleküler açıdan alt yapısının daha iyi anlaşılmasına olanak sağlamaktadır. Tez çalışması kapsamında kavun kısa okuma platformu kullanılarak sekanslanmıştır. Sekans sonucunda elde edilen çift yönlü okumaları Galaxy platformu içerisinde bulunan çeşitli algoritmalar kullanarak kavun genomuna haritalanmış, sayılmış ve diferansiyel ekspresyonu değişen genler tespit edilmiştir. Analiz sonucunda sıcaklık stresine cevaben istatistiksel olarak anlamlı olarak 788 genin ifade düzeyi artış gösterdiği, 134 genin ifadesinin azaldığı tespit edilmiştir. Ekspresyon değişimi tespit edilen genler literatürde incelendiğinde abiyotik stres altında benzer yanıtlar verdiği gözlenmiştir. Gen ontoloji ve KEGG analizi yapılmış genlerin fonksiyonel anotasyonu yapılmıştır. Bu tez çalışması kapsamında elde edilen sonuçların yapılacak diğer çalışmalara ışık tutacak ve literatüre özgün katkı sağlayacaktır.
Investigation of the immunotoxic effects of ochratoxin A on natural killer cell activity
Ochratoxin A (OTA) is a mycotoxin produced as a secondary metabolite by Aspergillus and Penicillium fungi species and detected in various food and animal feeds. It exhibits complex toxicity, involving alterations in different signaling pathways, including PI3K/Akt, MAPK/ERK, and NF-κB signaling pathways. It is thought that OTA exerts its immunotoxicity through reducing viability and proliferation, stimulation of inflammation, and interference with immune cell activity. Its detrimental effects on cell survival, cytotoxic activity, and cytokine release were reported in primary natural killer (NK) cells of mice and rats, whereas the molecular mechanisms underlying this toxicity remained elusive. This study aims to provide insight into mycotoxin-induced immune system impairments by unfolding the molecular mechanisms underlying OTA-induced innate immunotoxicity in NK cell activation. The findings demonstrate that OTA exposure leads to alterations in NK cell metabolism via PI3K/Akt, MAPK/ERK, and NF-κB pathways, alongside elevated degranulation levels and granzyme B expression. In addition, NK cell phenotyping revealed the upregulation of an activating receptor NKp46 levels, whose elevated expression was associated with the tumor microenvironment. Considering the potential of OTA as a human carcinogen and the elevated tumorigenesis risks associated with aberrant NK activity, this study provides valuable insights into the OTA-mediated toxicity of NK cell activation at molecular levels.
Conservation genetics of the Yelkouan Shearwater (Puffinus yelkouan) in the Mediterranean Sea
Seabird populations globally face decline from threats on breeding grounds and at sea. Seabirds form spatially structured populations and limited understanding of population connectivity hinders their conservation. Genomic approaches, generally underutilised in seabird conservation, allows to assess population connectivity and the driving historical and contemporary factors and aids in identifying relevant conservation units. This research focuses on the Yelkouan Shearwater, a Mediterranean-endemic seabird facing conservation challenges. Employing next generation sequencing and diverse analytical methods, this study unveils, for the first time, the population genomic structure of the Yelkouan Shearwater. It also evaluates contemporary factors influencing this structure and tests its utility for the conservation of the Yelkouan Shearwater. The results of this dissertation highlight the pivotal role of comprehensive range-wide sampling and high-resolution sequencing data in unravelling the population genomic structure of seabirds. It also underscores the intricate relationship between seascape features and seabird genomic structure. Given the high pace of global change and biodiversity loss, these findings should inform future seabird research and conservation management, extending their relevance beyond the Mediterranean.
Kolon kanser modelinde TGF-β1'in adamts8 gen ekspresyonuna etkilerinin belirlenmesi
ADAMTS-8, ADAMTS (A Disintegrin-like And Metalloproteinase with Thrombospondin Motifs) adı verilen hücreler arası matriks proteaz ailesinin bir üyesidir. ADAMTS-1 ve ADAMTS-8, Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü (VEGF) ve Fibroblast Büyüme Faktörü-2 (FGF-2) tarafından uyarılan, yeni damar oluşumunu engelleyen güçlü anjiyoinhibitörlerdir. TGF-β sitokini tümör oluşumunun erken fazında, tümör baskılayıcı fonksiyonlara sahipken, tümörün geç evresinde tümörün ilerlemesi ve metastazına öncülük ettiği bilinmektedir. ADAMTS-8'in TGF-β sitümülasyonuyla, kolorektal kanserdeki işlevini ortaya koyan herhangi bir çalışmaya rastlanmamıştır. Bu tez çalışması, kolorektal kanser modeli (SW480) üzerinde TGF-β'nın ADAMTS-8'in transkripsiyonel regülasyonuna katkısının belirlenmesini amaçlamaktadır. Bu tez çalışmasının sonucunda, TGF-β'nın 20 ng/mL'lik dozda SW480 kolon kanseri hücrelerinde proliferatif etkiye sahip olduğu MTT testi ile belirlenmiştir. Ardından, TGF-β sitokinin farklı zaman aralıklarında ADAMTS-8'in mRNA ve protein düzeyinde ifadesinde artışa sebep olduğu Real Time PCR ve Western Blot çalışmalarıyla belirlenmiştir. TGF-β aracılı, ADAMTS-8 promotorunun transkripsiyonel aktivitesi beş farklı uzunlukta promotor parçasının SW480 hücrelerine geçici transfeksiyonu ile araştırılmıştır. Transfeksiyon sonucunda en aktif promotor parçalarının pMet_TS-8[-223/+323], pMet_TS-8[-662/+323] ve pMet_TS-8[-851/+323] olduğu tespit edilmiştir. Yolak inhibisyon çalışmaları sonucunda, TGF-β ile uyarılan ADAMTS-8 regülasyonunun mRNA ve protein düzeyinde p38 MAPK, MEK, JNK, PI3K ve SMAD-3 hücre içi sinyal yolları üzerinden olduğu belirlenmiştir. Ayrıca, transkripsiyonel aktivitedeki artışın p38 MAPK, MEK, JNK, PI3K ve SMAD-3 yolları üzerinden düzenlendiği transfeksiyon çalışması ile belirlenmiştir. SW480 hücrelerinde TGF-β uygulamasıyla birlikte, SMAD2/3 transkripsiyon faktörünün ADAMTS-8 promotorundaki bazı bölgelere fonksiyonel olarak bağlandığı kromatin immünopresipitasyonu (ChIP) analiziyle doğrulanmıştır.
ADAMTS-8 geninin SP1 aracılı transkripsiyonel regülasyonu
ADAMTS'ler ekstraselüler matrikse salgılanarak matriksin yapısal proteinlerini parçalamaktadır ve özel trombospondin 1 motiflerini içermektedir. Metaloproteinaz olarak, ADAMTS-8, tümör büyümesi, büyüme faktörlerinin düzenlenmesi gibi invazyon ve metastaz süreçlerinde önemli rol oynamaktadır. Kolorektal kanser hücrelerinde ADAMTS-8 düşük ekspresyonunun, hücre proliferasyonunu engellediği, apoptozu tetiklediği ve HCT116, HT-29 modellerinde invazyon ve migrasyonu baskıladığı gözlemlenmiştir. SP1, memeli ve viral genleri düzenleyen, DNA bağlama bölgesini tanıyan proteindir. Aktif bölgesinde transkripsiyonu artırmaktan sorumlu üç çinko parmağı içeren SP1, GC-zengin DNA dizilerine bağlanmaktadır. SP1, KRK gelişimi ve ilerlemesinde önemli rol oynamaktadır. Çalışmada, kolorektal kanserde supresör gen olan ADAMTS-8'in, kolorektal kanserde düzenleyici SP1 ile regülasyonu incelenmiştir. Bu amaçla ADAMTS-8 geninin promotor bölgesinin transkripsiyonel aktivitesini belirlemek için beş farklı uzunluktaki promotor parçaları lusiferaz vektörüne klonlandı. SW480 hücrelerinde geçiçi transfeksiyon çalışmalarıyla bazal aktiviteler kıyaslandığında en yüksek aktiviteyi TS-8[-854/+323] promotor parçası gösterdi. Yapılan biyoinformatik analizlerle ADAMTS-8 geninin oldukça fazla SP1 bağlanma bölgesi içerdiği belirlendi. Ko-transfeksiyon çalışmalarıyla SP1'in ADAMTS-8 promotor aktivitesini özellikle TS-8[-854/+323] promotor parçasında azalttığı belirlendi. SP1'in promotora fonksiyonel olarak bağlanıp bağlanmadığını belirlemek amacıyla ChIP analizi gerçekleştirildi. ADAMTS-8(-353/-234), ADAMTS-8(-87/+38) ve ADAMTS-8(+188/+312) bölgelerine bağlanmanın gerçekleştiği doğrulandı. Sonrasında SW480 modelinde CEBP, USF ve SP1 over ekspresyonunun ADAMTS-8 protein seviyesine etkisi western blot ile belirlendi. SP1'in ADAMTS-8 protein ifadesini neredeyse yarıya düşürdüğü tespit edildi. SW480 ve yan model olarak seçilen SAOS-2 hücre hattında SP1 over ekspresyonunun ADAMTS-8 mRNA seviyesine etkisi qRT-PCR ile belirlendi. Hem SW480 hem SAOS-2 modelinde SP1 over ekspresyonunun ADAMTS-8 mRNA seviyesini azalttığı belirlendi.
SMA hastalığının tedavisinde kullanılmak üzere rekombinant SMN1 proteininin üretilmesi ve saflaştırılması
Spinal Musküler Atrofi, omurilikteki anteriyor horn hücrelerinin kalıcı bozulmasıyla oluşan kas zayıflığı ve atrofi olarak tanımlanan hastalıktır. 10000 doğumda bir çocuğu etkileyen otozomal resesif olan SMA, bebek ölümlerindeki en yaygın genetik nedendir. SMA hastalığı SMN1 genindeki defektlerle ortaya çıkmaktadır. SMA'nın, 4 tipi bulunmaktadır. Dünyada tedavi stratejileri oldukça kısıtlı ve çok pahalıdır. Bu tez çalışmasında rekombinant SMN1 proteini TAT peptidi ile birlikte oluşturulacaktır ve ilaç oluşturma potansiyeli in vitro olarak değerlendirilmesi hedeflenmiştir. Yapılan çalışmalar 3 iş paketinden oluşmaktadır. İlk olarak, SMN1 geni pEGFP/N2 vektörü içerisinden restriksiyon enzimler ile kesilerek, pET-21a vektörüne klonlanmıştır. Bu klon SMN1-pET-21a olarak isimlendirildi. İkinci aşamada bu klonun yanına SMN1 proteininin hücre membranından geçişini sağlaması amacıyla hücre geçiş protein dizileri (TAT dizisi) klonlanmıştır. Bu klonun adı TAT-SMN1-pET21-a olarak isimlendirildi. Kontrol amaçlı boş pET-21a plasmidi kullanılmıştır. Tüm plazmitler E.coli BL21(DE)3 bakteri soylarına transforme edilmiştir. İkinci iş paketinde ise, E.coli BL21(DE)3 bakterileri IPTG ile indüklenmiştir. Ardından Ni-Nta yöntemiyle üretilen protein lizatından histidin kuyruğuna sahip TAT-SMN proteini saflaştırıldı. Saflaştırma Western blot ve SDS-Page ile doğrulanmıştır. dı. Üçüncü iş paketinde ise rekombinant protein aktivitesinin in vitro koşullarda etkisinin incelenmesi için SH-SY5Y hücrelerinde SMN1 gen ifadesi lentiviral pLKO1 plasmidi ile shRNA sistemi ile susturulmuştur. Tek koloni seçiminden sonra, elde edilen kolonilerde susturmanın gerçekleştiği, mRNA ve protein seviyesinde doğrulanmıştır. Ardından, saflaştırılan rekombinant protein farklı konsantrasyonda ve zamanlarda hücrelere uygulanmıştır. Rekombinant proteinin hücre canlılığına etkisi MTT analizi ile belirlenmiştir. Hücre içerisine girip girmediği immunofloresan tekniği kullanılarak belirlendi. Daha sonra, SH-SY5Y ve SMN1 ifadesi susturulmuş hücrelere farklı konsanstrasyonlarda rekombinant TAT-SMN proteini uygulanarak, hücrelerdeki SMN protein seviyeleri immunofloresan tekniğiyle belirlendi. Üretilen ilaç adayının in vitro aktivite deneylerinde başarılı olduğu belirlenmiştir.
Hepatosellüler kanserde önemli bir LncRNA olan MIR100HG'nin transkripsiyonel regülasyonu
Son çalışmalar, uzun kodlamayan RNA'ların (lncRNA'lar) çeşitli hastalıklarda önemli rol oynadığını ortaya çıkarmıştır. MIR100HG ilk olarak bir insan transkriptom analizinde nöronal hücrelerde aşırı ekspresyon yoluyla tanımlanmıştır. Biyoinformatik ve ekspresyon çalışmaları, MIR100HG'nin nöroblastoma, lösemi, meme kanseri dahil olmak üzere insan kanserlerinde bir tümör promoteri olarak rolünü ortaya çıkarmıştır. Ancak literatürde MIR100HG geninin hepatoselüler karsinomdaki (HCC) rolüne ilişkin sınırlı bilgi bulunmaktadır. Bu tez çalışması normoksik ve hipoksik koşullar altında, farklı hepatosellüler kanser hücre hatlarında MIR100HG'nin ekspresyon seviyelerinin araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaçla epitel hücre hatları (Hep3B ve HUH-7), mezenşimal hücre hatları (SNU-398 ve SNU-475) ve sağlıklı bir karaciğer modeli (Clone-9) seçilmiştir. Hipoksik bir ortam oluşturmak için kobalt klorür kullanılmıştır. Gerçek Zamanlı PCR analizleri, spesifik MIR100HG primerleri kullanılarak yapılmıştır. Tez çalışmasının sonucunda, normoksik ve hipoksik koşullar altında MIR100HG'nin en yüksek Hep3B hücre hattında eksprese edildiği, bu sonucu SNU-398 hücre hattının takip ettiğini gösterilmiştir. Hipoksi oluşumu, HIF-1a ifadesinin mRNA ve protein seviyelerine bakılarak doğrulanmıştır. MIR100HG promotorunun transkripsiyonel regülasyonu beş farklı uzunlukta promotor parçasının Hep3B hücrelerine geçici transfeksiyonu ile hipoksik ve normoksik koşullar altında araştırılmıştır. Transfeksiyon sonucunda, en aktif promotor parçalarının -397/+231, -815/+231 ve -1031/+231 olduğu ve hipoksik koşullarda aktivitelerinin arttığı tespit edilmiştir. Hep3B hücrelerinde hipoksik şartlar altında HIF-1α'nın MIR100HG promotorunda bulunan HRE bölgelerine fonksiyonel olarak bağlandığı kromatin immunopresipitasyonu (ChIP) analiziyle doğrulanmıştır. MIR100HG geninin hücrelerin karakterizasyonu için önemli ve gerekli olduğu, Clone-9 hücrelerinde MIR100HG ifadesinin susturulması ve overekspresyonunun neden olduğu sonuçlar ilk kez bu tez çalışmasında belirlenmiştir. Overekpresyon ve susturma deneyleri sonrasında gerçekleştirilen Real Time analizi, MTT, Koloni Formasyon, Çizik Testi ve Matrijel deneyleri ile Clone-9 hücrelerinde MIR100HG'nin hücre sağkalımı, proliferasyonu, göçü gibi hücresel süreçlerde rol oynadığı kanıtlanmıştır. Bu tez kapsamında elde edilen verilerin, daha ileri kanser araştırmalarında, araştırmacılara yol göstereceği öngörülmektedir.
Mangostin meyvesinin yapısında bulunan farklı tip ksantonların mesane kanseri hücre hatlarında hücre ölüm mekanizmaları üzerindeki etkisinin incelenmesi
Mangostin (Clusiaceae bitki ailesi, Garcinia mangostana L.) tropikal bir ağaçtır. İçerdiği bileşenlerden dolayı ağacın meyvesinin besin değeri yüksektir. Bununla beraber, türde bulunan ana fitokimyasal olan ksantonlar birçok biyolojik etkiye sahiplerdir. Ksantonların farklı tiplerinin kanser üzerine etkisi birçok kanser türünde araştırılmıştır. Ancak, mesane kanseri ile ilgili yeterli bilgi bulunmamaktadır. Bu sebeple çalışmamızda, α- ve γ- mangostinin 5637 ve HT-1376 mesane kanseri hücre hatları üzerindeki sitotoksik etkilerinin belirlenmesi, akabinde hücre ölüm mekanizmalarından apoptoz ve otofaji üzerindeki etkilerinin saptanması amaçlanmaktadır. Etken maddelerin hücre hatları üzerindeki sitotoksik etkisi MTT yöntemi, apoptoz üzerine etkisi hem mitokondriyal membran potansiyelinin hem de kaspaz-3 ve -7 aktivitelerinin ölçümü, otofaji üzerinde etkisi ise lizozomal/otofajik vakuollerin floresans belirteçler yoluyla ölçümü ile tespit edilecektir. Böylelikle, mesane kanserinde etken maddelerin hangi mekanizma üzerinden hücre ölümüne sebep olduğu değerlendirilecektir.