Bazı Salvia türlerinin sekonder metabolitlerinin analizi, genomik karakterizasyonu ve biyolojik aktivitelerinin incelenmesi

Salvia (adaçayı) türleri terpenik bitkilerce zengin olan Lamiaceae (Labiatae) familyası bitkileridir. Dünyada 900'ü aşkın Salvia türü vardır, başlıca yaygın olarak bulunduğu ülkeler Çin, Brezilya, Meksika ve çoğunlukla Akdeniz bölgesinde yer alan Avrupa ülkeleridir. Türkiye'de ise 96 tür ve 105'i aşkın takson ile temsil edilen Salvia türlerinin sekonder metabolitleri başlıca terpenoit, steroit, flavonoit ve diğer fenolik bileşiklerden ibarettir. Özellikle taşıdıkları di- ve triterpenler nedeniyle antienflamatuvar, antiviral, hepatotoksik, sitosoksik/antitümör aktivitelerinin yanı sıra taşıdıkları flavonların antioksidan, antimikrobiyal, sitotoksik vb. pek çok aktiviteye sahip olduğu bilinen bir gerçektir. Salvia divinorum bitkisi ise Avrupa ve Asya kıtasındaki türlerin aksine neo-klerodan yapısındaki diterpenoid bileşikler ve özellikle salvinorin A ve salvinorin B'ce zengindir ve kappa-opioid reseptörlerine (KOR) karşı seçicilik gösterir ve halusinojenik özellikler taşıması bakımından bitkinin diğer türlerinden ayrılır. Ülkemizde halk arasında adaçayı olarak tüketilen bitkinin türleri içerisinde halusinojenik etken madde içeriklerinin taranması son derece önemlidir. Çünkü neo-klerodan diterpen yapıdaki bileşikler Salvia türlerinde yaygın olarak bulunmaktadır. 50 yılı aşkın süredir Lamiaceae, Verbenaceae, Euphorbiaceae, Compositae (Asteraceae) gibi familyalardan bir çok neo-klerodan bileşikleri izole edilmiştir. Yapılarındaki ilave furan halkası taşımalarıyla neo-klerodan diterpenler, diterpenler içerisinde taksonomik marker olarak bilinirler. Salvinorin A bileşiği çok güçlü halusinojenik bir bileşiktir ve salvinorin B bileşiği ile birlikte beynin Kappa-Opioid reseptörlerine karşı seçicilik gösterir. Kappa-Opioid reseptör ligandları bağımlılık, depresyon, ruhsal denge bozukluğu ve şizofren gibi akıl hastalıkları rahatsızlıklarında rol oynamaktadır. Salvia türleri üzerindeki çalışmalarımızın devamı niteliğinde olan bu tez çalışmasında, ülkemizin farklı bölgelerinden toplanmış 40-45 adet Salvia türünün; i. Başlıca sekonder metabolitlerinden fenolik ve salvinorin bileşik içeriklerinin, güvenilirliği sağlanmış bir metot ile sıvı kromatografi/tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) kullanılarak tayin edilmesi, ii. Diğer sekonder metabolitlerinden olan uçucu organik bileşik içeriklerinin termal desorpsiyon gaz kromatografi kütle spektrometresi (TD-GC-MS) tekniği ile incelenmesi, iii. Salvia türlerinin genomik DNA dizi analizlerinin yapılarak gen haritalarının çıkarılması, türler arasında filogenetik benzerlik durumlarının ortaya konulması, iv. Salvia türlerinin farklı yöntemler kullanılarak antioksidan ve antimikrobiyal aktivitelerinin incelenmesi, içerdikleri sekonder metabolitler ile yapı-aktivite ilişkisinin kurulması amaçlanmıştır. Bu tez çalışmasında, Salvia türlerinin toprak üstü kısımlarının metanol ekstreleri hazırlanmıştır. Bu ekstrelerin fenolik bileşik içerikleri [7 adet fenolik asit (kafeik, klorojenik, p-kumarik, salisilik, sirinjik, rosmarinik ve t-ferulik asit), 8 adet flavonoit (apigenin, izoramnetin, kamferol, luteolin, penduletin, kersetagetin-3,6-dimetileter, kersetin ve salvigenin), 5 adet flavonoit glikozit (izokersetin, kamferol-3-rutinozit, luteolin-7-O-glikozit, kersitrin ve rutin hidrat), pirogallol, vanillin ve fumarik asit] LC-MS/MS metodu ile kantitatif olarak belirlenmiştir. Salvia türlerinde çoğunlukla kafeik asit (7,11-185,03 µg/g), fumarik asit (8,32-2119,85 µg/g), luteolin (12,92-344,68 µg/g), penduletin (3,35-740,57 µg/g), rosmarinik asit (134,6-4420 µg/g) ve rutin hidrat (5,23-7522,31 µg/g) bileşenleri tespit edilmiştir. Bu ekstrelerin salvinorin içerikleri de yine LC-MS/MS metodu ile belirlenmiştir. Salvinorin A bileşeni en fazla S. recognita, S. cryptantha ve S. glutinosa (212,86±20,46 µg/g, 51,50±4,95 µg/g ve 38,92±3,74 µg/g) bitki türlerinde olduğu tespit edilmiştir. Salvinorin B bileşiğinin ise en fazla S. potentillifolia, S. adenocaulon ve S. cryptantha (2351,99±232,22 µg/g, 768,78±75,90 µg/g ve 402,24±39,71 µg/g) türlerinde bulunduğu belirlenmiştir. Bitkilerin uçucu organik bileşikleri termal desorpsiyon gaz kromatografisi kütle spektrometresi yöntemi ile tespit edilmiştir. Uçucu organik bileşenlerin içerikleri türler arasında farklılık göstermekle birlikte başlıca borneol (%0,09-37,4), β-karyofillen (%0,23-10,27), spathulenol (%0,03-14,07), karyofillen oksit (%0,03-11,25), β-bisabolon (%0,21-7,96), bisiklogermakren (%0,06-33,31), 1,8-sineol (ökaliptol) (%0,04-23,1) ve kamfor (%0,05-13) bileşikleri tespit edilmiştir. Genomik DNA analizleri için, bitki türlerinin 5S rRNA kodlayıcı gen dizileri aydınlatılmış ve türler arasındaki evrensel akrabalık ilişkileri, benzerlikleri belirlenmiştir. Salvia bitkilerinin DNA dizileri ile GenBank'dan alınan Salvia divinorum bitkisinin DNA dizisi, çoklu sekans hizalama programları ile hizalanmış ve türlerin halusinatif etkili Salvia divinorum bitkisine olan benzerlikleri ortaya konulmuştur. Salvia türlerinin DNA dizilerinin çoğunlukla 300 bp ile 500 bp baz çifti arasında olduğu tespit edilmiştir. Ancak Salvia nemorosa (467 bp), Salvia glutinosa (466 bp), Salvia russellii (424 bp) ve Salvia verticillata (269 bp) türlerinin diğer Salvia türlerinde çoğunlukla 300 bp baz çifti uzunluğundan farklı oldukları tespit edilmiştir. Salvia divinorum bitkisinin literatürde 487 bp baz çifti uzunluğuna sahip olduğu kayıt edilmiştir. Türlerin baz dizilimleri Clusteal W çoklu sekans hizalayıcı program ile düzenlenmiştir. Böylece Salvia divinorum bitkisine benzerlikleri kemometrik ve genomik olarak incelenmiştir. Antioksidan aktivite analizleri için ekstrelerin Folin-Ciocalteu ayıracı ile toplam fenolik miktarları pirokateşole ve aluminyum nitrat yöntemi ile toplam flavonoit miktarları kersetine eşdeğer olarak tayin edilmiştir. Ekstrelerin toplam fenolik içerikleri 13,90±0,56-164,06±2,82 µg/mg aralığında, toplam flavonoit içerikleri ise 14,15±0,11-58,57±0,00 µg/mg aralığında değiştiği belirlenmiştir. ABTS katyon radikali giderme aktivitesi ve Bakır (II) iyonu indirgeme antioksidan kapasitesi (CUPRAC) ise Trolox'a eşdeğer olarak belirlenmiştir. Ekstrelerin gram ekstre başına mmol Trolox'a eşdeğer; ABTS katyon radikali giderme aktivite kapasitesi 0,16±0,00-1,55±0,00 mmol TR/g aralığında, CUPRAC aktivite kapasitesi 0,25±0,00-2,47±0,00 mmol TR/g aralığında tespit edilmiştir. DPPH serbest radikal giderimi ve lipid peroksidasyon inhibisyonu aktivitesi (β-karoten renk açılımı) % inhibisyon cinsinden 4 farklı derişimde (10, 25, 50 ve 100 µg/mL) incelenmiştir. Elde edilen sonuçlar α-tokoferol, BHT ve BHA standart maddeleriyle mukayese edilerek değerlendirilmiştir. Antimikrobiyal aktiviteleri ise sırasıyla Gram negatif bakteri E. Coli, Gram pozitif bakteri S. aureus, maya C. albicans ve mikobakteri M. Smegmatis'e karşı disk difüzyon yöntemi ile incelenmiştir. Standart olarak negatif kontrol DMSO, pozitif kontrol Gentamisin, Oxacillin, Ketoconazole ve Streptomisin antibiyotikleri kullanılmıştır. Salvia blepharochlaena ve Salvia modesta türleri M. smegmatis'e, Salvia kronenburgii ve Salvia poculata türleri ise S. aureus'e karşı aktivite göstermişlerdir. Bunun yanı sıra S. aureus'a karşı Salvia heldreichiana iyi, Salvia aucheri, Salvia hypargeia, Salvia modesta ve Salvia trichoclada orta, Salvia bracteata, Salvia euphratica, Salvia huberi, Salvia glutinosa ve Salvia nemorosa az, Salvia pachystachys ise çok az antimikrobiyal aktivite göstermiştir.