Tıbbi Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı

Hepatosellüler karsinoma hücre proliferasyonunda lösince zengin tekrarlar içeren g-protein aracılıklı reseptör 5 (LGR5)'in önemi

Her yıl yaklaşık 700 bin yeni karaciğer kanseri olgusu tanımlanmaktadır ve bu vakaların yaklaşık %85-90'ı Hepatosellüler karsinoma (HCC)'dır. İkinci ölümcül kanser türü olan HCC için, hepatit virüsleri, kronik alkol kullanım, obesite ve aflatoksin gibi kimyasallar en iyi bilinen risk faktörleridir. Tüm HCC'lerin üçte birinde, mutasyonel ya da mutasyonel olmayan şekilde oluşan Wnt/beta-katenin sinyalizasyon bozuklukları, bu yolağın hepatokarsinogenez sürecindeki önemini göstermektedir. Örneğin bir Wnt reseptörü olan FZD-7 HCC'lerin %90'ında aşırı eksprese edilmektedir. Yine HCC'lerin %20 ile %40 aralığında, anormal sitoplazma ve çekirdekte lokalize beta-katenin birikimi bulunmaktadır. Fakat, artan nükleer beta-katenin ve onun transkripsiyonel hedeflerinin ekspresyonu arasında bir korelasyon olmaması bize HCC için bilinen hedef genlerinin ekspresyonunu kontrol eden başka sinyal yolaklarının olabileceğini ve/veya böylesine aktivasyona bağlı HCC'de bilinenlerin dışında başka hedef genlerin bulunabileceğini düşündürdü. Grubumuzca yapılan önceki çalışmalarda Lityum-aracılıklı Wnt/beta-katenin sinyalizasyonu uyarımı ile HCC hücre hatlarından HuH7'da LÖSİNCE ZENGİN TEKRARLAR İÇEREN G-PROTEİN ARACILIKLI RESEPTÖR 5 (LGR5) gen ekspresyonunun en az 10 kat arttığı gösterilmiştir. Barsak dokusunda Wnt/beta-katenin hedef genlerinden biri olarak tanımlanan LGR5'ın, son yıllarda kolon ve saç folikül hücrelerinde kök hücre belirteci olduğu ve özellikle kolon kanser kök hücrelerin tanımlanmasında kullanıldığı bildirilmiştir. Bu tez kapsamında ise LGR5'ın HCC hücre hatlarında ekspresyonları ve hücre proliferasyonundaki rolü araştırılmıştır. Buna göre, ilk olarak LGR5, 9 HCC hücre hattından (SNU398, SNU-475, SK-Hep1, HepG2, PLC, Mahlavu, Hep3B, SNU449, HuH7), yalnızca literatürde hepatik kanser kök hücre (HpCSC) içerdikleri bildirilen, daha az motil ve invaziv olan, epitelyal-benzeri HCC hücre hatlarında (HepG2, PLC, Hep3B, HuH7) yüksek düzeyde eksprese olurken, diğerlerinde yok/düşük şeklinde bulunduğu tespit edilmiştir. İkinci olarak ise, HuH7 hücrelerinde, Wnt/beta-katenin sinyal yolağını tetikleyen her hangi bir indüksiyon olmadan, pCMV6-AC-GFP-LGR5 plazmiti ile geçici transfeksiyon aracılığı ile overeksprese edilen LGR5'in boş plazmit (mock) kontrolüne karşı hücre proliferasyonunda anlamlı değişiklikler yapmadığı bulunmuştur. Çalışmalarımızda ek olarak LGR5 sinyalizasyonunu ve bu sinyalizasyonun etkilerini aydınlatmak için LGR5 overeksprese eden hücrelerde LGR5/Wnt3a/R-Spondin1 üçlü kompleksin hücre biyolojisini ve Wnt/beta-katenin sinyal yolağını nasıl etkilediği araştırılmıştır. R-Spondin1 tek başına Tcf/Lef transkripsiyonel aktivitesini artırmazken, Wnt3a tek başına Tcf/Lef transkripsiyonel aktivitesinin artışına sebep olmuştur. Ayrıca Wnt3a ve R-spondin1 ikisi bir arada oldukları durumda Tcf/Lef transkripsiyonel aktivitesi daha da artmıştır. HuH7 hücrelerinde, pCMV6-AC-GFP-LGR5 plazmiti ile geçici transfeksiyon aracılığı ile overeksprese edilen LGR5 ekspresyonunun ise bu değişimler üzerine etkisinin olmadığı yani, Wnt3a veya Wnt3a/R-Spondin1 sinyalizasyonunun LGR5'ten bağımsız olduğu sonucu cıkmaktadır. LGR5 overeksprese hücrelerde boş vektör kontrole göre, Wnt3a ve/veya R-Spondin1'in tek başlarına, bir arada ya da hiç olmadıkları durumlar arasında hücre proliferasyonunda bir değişimin olmadığı gözlenmiştir. Sonuç olarak, LGR5'in , Wnt/ß-katenin sinyal yolağını indüklemeden HCC hücre proliferasyonda anlamlı bir rolü bulunmasa da, HpCSC içeren daha az invaziv ve motil olan grupta daha fazla bulunması bize, henüz bilmediğimiz başka biyolojik davranışlarda rolü olabileceğini ve bunun ileride araştırılması gerektiğini düşündürmektedir.

Meme kanserlerinde epigenetik değişim gösteren genlerde metilasyon paternlerinin bisülfid sekanslama yöntemiyle belirlenmesi

Meme kanseri, Dünya Sağlık Örgütü (WHO) verilerine göre, en sık görülen kanser tipidir.Bu çalişmanın amacı; meme karsinogenezinde önemli rollerinin olduğu gösterilmiş olan, GSTP1 ve E-cadherin genlerin ekspresyon düzenleyici bölgelerinde bulunan CpG adalarının metillenme profillerinin, tümörlerün özellikleri ile ilişkilenrilimesidir.Hipotezimiz; GSTP1 ve E-cadherin genlerinin ifadelenmesinde DNA metillenmesinin değişebileceği ve bu farklılıkların meme kanserinin özelliklerini etikileyebileceğidir.Çalışmaya, Meme kanseri tanısı almiş 50 tümör örneği ile, aynı hastalara ait 50 adet çevre normal doku örneği, rastgele örnekleme yöntemiyle alınmiştır (patoloji Anabilim Dalı, türkiyenin 9 eylül üniversitesi hastanesinin arşivinde tarama ile). DNA izolasyonundan sonra, sodiyum bisülfit sekanslama yöntemiyle GSTP1 ve E-cadherin promotöründe CpG adacıkları belirlenerek, tümörün derecesi ve diğer kanser parametreleriyle ilişkileri `x2 korelasyon' analizleri ile yorumlanmıştır.Bu çalışmada meme kanserinde E-cadherin geninin promotör bölgesinde metillenme sıklıği %94 ve GSTP1 geninin promotörsinde % 41.3 bulundi.E-cadherin geni için tümör örneklerinin, % 44.0'ü( 50 örnekten,22'si), tam metillenmiş, % 50'si kısmen ( 50 örnekten, 25'i) ve % 6.0'I ( 50 örnekten, 3'tanesi) metillenmemiştir. Metillenme olayı tümör ve normal örneklerin arasında, anlamlı şekilde farklı gözlenmiştir. Tam olarak meme kanser dokuların % 94'ünde metillenme gözlenmiştir. Ayrıca normal meme dokuların % 76'sı ( 50 örnekten, 38'i) metillenmemiştir.GSTP1 geni için tümör örneklerinde % 28.3'ü (13 örnek 46 örnekten) tam metillenmiş, % 13'ü (6 örnek 46 örnekten) kısmen ve % 58.7'i (27 örnek 46 örnekten) metillenmemiştir. Ayrıca normal meme dokularında genellikte örneklerin % 87.2'i metillenmemiştir ve % 12.8'inda kısmen metillenme gözlenmiştir. Metillenme olayı tümör ve normal meme dokuların arasında anlamlı derecede farklıdır (p= 0.000).

Kremen1 geninin şizofreni ile ilişkisinin araştırılması

Amaç ve hipotez: Şizofreni belirtileri genellikle geç adolesan veya erken yetişkinlikte başlayıp çoğunlukla hayat boyu devam eden ve dünya nüfusunun yaklaşık %1' ini etkileyen kronik, güçten düşürücü psikotik ve ciddi bir bozukluktur. Genetik çalışmalara göre, şizofreni yaklaşık %80 oranında genetik geçişlidir. Ayrıca, şizofreninin nörogelişimsel bir hastalık olduğu düşünülmektedir. Wnt sinyal mekanizması bu gelişimsel süreci düzenlemede kritik bir rol oynar. Çalışmamızın amacı Wnt sinyal mekanizmasında bifazik (pozitif ve negatif) yanıt oluşturabilen KREMEN1 geninin şizofreni ile ilişkisini araştırmaktır.Yöntem: Araştırmamızda, 104 şizofreni olgusu ve kendisinde ya da ailesinde psikiyatrik bir hastalığı bulunmayan 51 sağlıklı kontrol olmak üzere toplam 155 birey ile çalışıldı. KREMEN1 geninde, rs713526, rs116100643 ve rs201088346 SNP bölgelerinin araştırılması için genin ilgili bölgesi PCR ile çoğaltılıp DNA dizi analizi yapıldı ve genotipler belirlendi.Bulgular: Genetik analizler sonucunda, rs713526 G>A polimorfizmi heterozigot olarak şizofreni olgu grubunda %26, sağlıklı kontrol grubunda ise %12 oranında saptandı. İki grup arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark vardır (p=0,042). Polimorfizmin homozigot formu ise saptanmamıştır. Ayrıca çalıştığımız olgu ve kontrol gruplarında rs116100643 ve rs201088346 SNP bölgelerinde varyant formlar hiç bulunmamıştır.Sonuç: Araştırmanın sonuçları; KREMEN1 genindeki rs713526 G>A polimorfizminin, şizofreni riski ile ilişkili olabileceği ve bu hastalığa yatkınlığa katkıda bulunabileceği yönündedir. Ancak, sonuçlarımız şizofreninin bu lokus ile ilişkisini vurgulamakta fikir verici olsa da, daha büyük bir örneklem grubu ile araştırmaya devam edilmelidir.Anahtar Sözcükler: Şizofreni, Wnt sinyal yolağı, KREMEN1, SNP

TAF7-CIITA etkileşiminin programlanmış hücre ölümü üzerindeki etkilerinin araştırılması

Genel transkripsiyon faktörü TFIID'nin yapısında yer alan TAF7'nin, HIV genomundaki 9 genden biri olan Tat'ın ökaryotik işlevsel homoloğu olduğu ileri sürülmüştür. TAF7, HIV-Tat'a benzer şekilde transkripsiyonel elongasyonu destekleme veya transkripsiyonu baskılayabilme özelliklerini barındırmaktadır. Daha önceki çalışmalarımızda TAF7'nin HIV-Tat'a benzer şekilde hücre ölümünü tetiklediğini destekleyen bulgular elde ettik. Tat proteininin önemli bir özelliği CIITA ile olan etkileşimidir. CIITA MHC sınıf II genleri için transkripsiyonel bir aktivatör işlevi görür ve yokluğunda MHC sınıf II proteinleri ifade edilmez. Tat, CIITA ve MHC sınıf II ekspresyonunu baskılayabilirken; CIITA over-ekspresyonu da Tat'ı ve bu yolla da HIV transkripsiyonunu baskılayabilmektedir. Buradan yola çıkarak TAF7 ile CIITA arasında da benzer bir etkileşim olup omadığını araştırmak hedeflenmiştir. HeLa ve Kelly hücrelerine tek tek ve ko-transfeksiyonla TAF7 ve CIITA genlerinin yüksek düzeyde ekspresyonu sağlanarak hücre ölümü kaspaz aktivasyonları, hücre döngüsü davranışları ölçülerek değerlendirildi. Geçici transfeksiyon deneylerinin yanı sıra TAF7 over-ekspresyonu için tetrasiklin ile regüle edilen ekspresyon sistemi kullanıldı. Ayrıca TAF7'nin tubulin polimerizasyonu üzerindeki etkisi invitro tubulin polimerizasyon deneyi ile araştırıldı. TAF7'nin Beta Tubulin proteini ile ilişkisi in vitro immün presipitasyon ve floresan mikroskobi deneyleri ile gösterildi. Bu proje kapsamında yapmış olduğumuz deneyler CIITA'in TAF7'nin apoptotik etkisini baskılayabildiğini (önceki çalışmalarımız ve bu proje ile elde edilmiş veriler) ve buna ek olarak TAF7'nın BCL-2, kaspaz2 gibi apoptotik proteinlerle doğrudan etkileştiğini gösterdik. Proje kapsamında site-directed mutagenez ile TAF7'nin fosforilasyon mutantını oluşturduk ve mutant formun hücre ölümünü indüklemede yabanıl TAF7 kadar etkili olmadığını gösterdik. Bu bulgular son 1-2 yıla kadar bir genel transkripsiyon faktörü olan TFIID'ın yapısal bir komponenti olarak kabul edilen TAF7'nin hücre döngüsüne bağlı olarak bir regülasyona tabi olduğunu; modifiye olup olmamasına bağlı olarak farklı etkinliğe sahip olduğunu düşündürmektedir.Bunlara ek olarak TAF7 ekspresyonunun indüklediği apoptozun CIITA varlığında baskılanabileceğini ve CIITA mutantları kullanarak bu etkinin oldukça spesifik olduğunu gösterdik. Bu gözlem bağışıklık sistemi için önemlidir. Bağışıklık sisteminin bu önemli molekülünün, TAF7 ile olan etkileşiminin niteliği ve bu etkileşiminin hücre ölümüne olan etkisinin açığa kavuşturulması, immun sistem biyolojisi açısından önem kazanmaktadır. Bu yönde elde edilecek tüm verilerin bağışık yanıtın oluşması, immun hücrelerin gelişimi (pozitif ve negatif seleksiyon), HIV biyolojisi gibi çok geniş alanlarda etkisi olabilir.

Wilson hastalığına yol açan ATP7B genindeki mutasyonların bakır taşınmasındaki etkilerinin saccharomyces cerevisiae model sisteminde araştırılması

Amaç : Klinik bulguları farklı Wilson Hastalarında saptanan ATP7B genindeki T788I, V1036I ve R1038G-fsX83 mutasyonları ve yaban tip ATP7B geni, yaban tip BY4741 (MAT? his3?1 leu2?0 met15?0 ura3?0) suşundan elde edilmiş CCC2 geni mutant olan (BY4741 ?CCC2) Saccharomyces cerevisiae suşuna transformasyonuyla bakır miktarındaki değişimin saptanması amaçlandı.Yöntem : Hepatoselüler karsinoma hücre dizisi HepG2?den total RNA izolasyonu yapılıp cDNA elde edildi. Yaban tip ATP7B genine özgül primerler kullanılarak ATP7B geni PCR ile çoğaltıldı, plazmid DNA?sına klonlandı.Yaban tip ATP7B?yi içeren plazmid DNA?sında bölge yönlendirilmiş mutagenez `site directed mutagenesis? yöntemi ile T788I, V1036I ve R1038G-fsX83 mutasyonları elde edildi. DNA dizi analizi ile yaban tip ATP7B, T788I, V1036I ve R1038G-fsX83 mutant hücrelerden elde edilen plazmid DNA?larının dizileri doğrulandı. Yaban tip ATP7B, T788I, V1036I ve R1038G-fsX83 mutantları Saccharomyces cerevisiae (BY4741?CCC2) transforme edildi.Konvansiyonel PCR ve real time PCR yapıldı. Komplementasyon deneyi yapılarak ICP MS analizi ile farklı ortam şartlarında, ortamdaki ve hücre pelletlerindeki bakır ve demir miktarı ölçüldü.Bulgular : BY4741 ?CCC2 suşunda , ATP7B geninin mayadaki CCC2 genini komplemente ettiğive işlevsel olduğu gösterildi. Demir sınırlı ortamda, yaban tip ATP7B?ye göre T788I, V1036I ve R1038G-fsX83 mutantlarında hücre kültür ortamındaki bakır miktarının azaldığı ve hücre pelletlerindeki bakırın arttığı gösterildi. Kontrol ortamlarında hem ortam hem de hücre pelletlerinde bakır miktarında fark saptanmadı. Aynı deney şartlarında, yaban tip ATP7B?ye göre mutantlarda hem ortam hem de pelletlerde ölçülen demir miktarında fark saptanmadı. Sonuç : Demir sınırlı ortamda yaban tip ATP7B?ye göre T788I, V1036I ve R1038G-fsX83mutasyonlarında hücre kültür ortamındaki bakırın azaldığı, hücre pelletlerindeki bakırın arttığı gösterildi. ICP-MS ile yapılan ölçümlerde yaban tip ATP7B ile üç mutant arasında bakır taşınımında fark saptandı, hipotezimiz doğrulandı. BY4741?CCC2 genetik özelliğindeki mutant maya suşuna ilk kez insan bakır taşıyıcı geni ATP7B transforme edildi ve komplemantasyon gösterildi. Farklı klinik özelliklere sahip Wilson hastalarındaki mutasyonlara ait model sistem kurulmuş oldu.Anahtar Sözcükler : Wilson hastalığı, bakır, ATP7B , mutasyon, CCC2 , maya

Nöroblastik tümörlerdeki bölgesel DNA kopya sayısı değişikliklerinin ve allelik dengesizliklerin tanımlanması

Periferal nöroblastik tümörler, özellikle nöroblastom (NB), en sık gözlenen çocukluk çağı neoplastik oluşumudur. klinik davranış bakımından kendiliğinden spontan gerileyen benign ganglionöromdan agresif ve metastatik malign tipe kadar farklılık gösterebilmektedir. NB karmaşık ve heterojen genetik değişiklikler içermektedir. En sık gözlenen değişiklikler; ploidi sapmaları, MYCN geninin amplifikasyonu, 1p, 3p, 11q delesyonları ve 17q kol kazanımlarıdır. Bu çalışmada, 249 NB tümörü olan olguda genomik skalada gözlenen genetik değişikler (MYCN geninin amplifikasyonu, 1p, 3p, 11q delesyonları ve 17q kol kazanımı) ve klinik özellikler (yaş, tümör evresi ve histolojisi) çok değişkenli lojistik regresyon analiziyle değerlendirildi. Ayrıca 11q delesyonu ve 3p delesyonu gözlenen olgularda dizin CGH çalışmaları yapıldı. Aynı zamanda amplikon gözlenen hücre hatlarında replikasyonunun hücre döngüsünün herhangi bir aşamasında olabileceğinin gösterilmesi amaçlanmıştır. Olguların tamamında; 1, 2, 3, 4, 7, 9, 11, 12, 14 ve 17. kromozom kollarında 100?den fazla prob kullanılarak hibridizasyon gerçekleştirildi. PCR ile çoğaltılan ürünlerin nicel analizi kapiller elektroforez ile gerçekleştirildi. NB tanılı olgularda MYCN amplifikasyonu % 23.3, 1p delesyonu % 31.7, 3p delesyonu % 20.8, 11q delesyonu % 26.2, 17q kazanımı % 77.2 oranında gözlendi. NAG, DDX1 ve ALK gen amplifikasyonu ile MYCN amplifikasyonu arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu. SiMa hücre hattına DM yapılarının kendini eşlemesinin hücre döngüsünden bağımsız olmadığı ve S-fazında olduğu gösterildi. MLPA sonuçlarına göre 4 tümör grubu oluşmuştur. Grup1; MYCN amplifikasyonu ve 1p delesyonundan en az birini taşıyanlar. Grup2; 11q delesyonu ve 3p delesyonundan en az birini taşıyanlar. Grup3; MYCN amplifikasyonu veya 1p ve 11q veya 3p delesyonlarından en az ikisini taşıyanlar. Grup4 ise bu anomalileri taşımayan tümörler. Grup1, 2 ve 3?de olguların çoğunluğu 12 ay üstü yaş, yüksek evre, kötü histoloji grubunda olduğu saptandı. Sonuç olarak, NB?de çoklu genetik değişikliklerin saptanmasında MLPA kullanılması etkin ve duyarlı bir yaklaşım olup, tümörlerin çoklu genetik özellikleri bakımından sınıflandırılmasını ve tedavi protokollerinin etkin bir biçimde uygulanmasına destek sağlayabilecektir.

Nöroblastom hücre hatlarındaki miRNA ekspresyon profilleriyle genetik parametreler arasındaki ilişkilerin araştırılması

Nöroblastomda delesyona uğrayan bölgelerde, çift vuruş (double hit) hipoteziyle uyumlu bir genin tanımlanamaması ve nöroblastom genetiğinde sıklıkla yapısal ve sayısal kromozomal aberasyonların gözlenmesine rağmen, gen mutasyonlarının çok nadir olarak görülmesi; son zamanlarda epigenetik değişimlerin araştırılmasına neden olmuştur. Nöroblastom örneklerinde şimdiye kadar yapılan çalışmalarda nöral krest hücrelerinin farklılaşma sürecinde rol oynayan genlerde herhangi bir mutasyonun (Phox2B hariç) ve Transkripsiyonel epigenetik bir değişimin saptanmaması, bu genlerin, post-transkripsiyonel epigenetik mekanizmalarla susturulabileceğini düşündürmektedir. Çalışmamızın temel amacı; Nöroblastomda sıklıkla delesyon gözlenen 11q veya 1p delesyonuna sahip olan hücre hatları ile delesyonun gözlenmediği hücre hatları arasındaki miRNA ekspresyon profillerini belirlemek ve nöral krest farklılaşma yolağında rol alan genlerin, ekspresyon değişikliği gözlenen miRNA?ların hedefi olup olmadıklarını belirlemektir. Çalışmamızda altı nöroblastom hücre hattının kromozomal aberasyonlarını MLPA yöntemiyle saptadık. Hücre hatlarının miRNA ekspresyon profillerini ise miRNA dizin çalışması ile gerçekleştirdik. Çalışmamızın sonucunda 1p delesyonu olan hücre hatlarında, 1p delesyonu olmayan hücre hatlarına göre istatistiksel olarak anlamlı artış gösteren 33 miRNA saptadık. Bu miRNA?lar arasından miR-410, miR-543, miR-495 ve miR-494?ün en az üç geni hedef aldığını gösterdik. Seçilen miRNA?lardan miR-543, miR-495 ve miR-494?ün ekspresyon artışlarını ise gerçek zamanlı PCR çalışması ile doğruladık. Sonuç olarak; nöroblastomda sıklıkla gözlenen 1p delesyonunun, karsinogenez süreci bilinmeyen nöroblastomun ortaya çıkış nedenine ışık tutacağını düşünmekteyiz.

Nöroblastom hücre hatlarında epigenetik değişiklikleri düzenleyen genlerin ifade örüntüsünün araştırılması

Nöroblastom (NB) sempatik sinir sistemine farklılaşan nöral krest hücrelerinden köken alan embriyonik bir tümördür. Spontan remisyondan hızlı metastatik progresyona kadar varan farklı klinik davranışlar gösterir. NB, karyotipik açıdan segmental kromozom aberasyonları ile karakterizedir. Sık gözlenen reküran kromozom anomalileri 1 no?lu kromozomun kısa kolunda (1p) ve 11 no?lu kromozomun uzun kolunda (11q) gözlenen kayıplar; 17 no?lu kromozomun uzun kolundaki (17q) kazanımlardır. NB olgularının % 22?sinde MYCN geni amplifikasyonu ileri hastalık evresi, metastatik hastalık ve agresif klinik seyirle birliktelik göstermektedir. Ayrıca, 1p, 11q delesyonları ve 17q duplikasyonu kötü prognozla ilişkilendirilmiştir. Buna karşın, söz konusu kromozom segmentlerinde, NB patogenezinde rol oynayan gen ya da genler bugüne kadar tanımlanamamıştır. Erişkin tümörlerinde gözlenen kanser genleri de NB tümörlerinde tutulum göstermemektedir. Bu çalışmanın çıkış noktası NB?deki bu prognostik faktörlerin sitogenetik anomaliler haricinde başka etmenlere dayandırılabileceği düşüncesidir. Günümüzde kanser üzerine yapılan araştırmalarda karsinogenez sürecinde epigenetik faktörlerin de rol oynadığının bulunması ve NB tümörlerinde bu tarz çalışmaların fazla olmaması, NB tümör fenotipindeki bu çeşitliliğe epigenetik faktörlerin neden olabileceği sorusunu doğurmuştur. DNA metilasyonu normal gelişim sürecinde rol oynayan bir epigenetik faktördür ve metilasyon örüntünün bozulması karsinogenezde doğrudan rol oynamaktadır. Buna ek olarak histon modifikasyonlarının, protein komplekslerinin DNA?ya bağlanma sürecini olumlu ve olumsuz yönde etkiledikleri, bu sebeple genom üzerinde belirli bölgelerin gen ifadesinde arttırıcı veya susturucu etkisi olduğu bilinmektedir. Proje kapsamında epigenetik değişikliklere yol açan 84 tane genin ifade değişimleri gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu analizleri ile belirlenmiştir. Analiz sırasında MYCN amplifikasyonu görülmeyen iki (2) adet NB hücre hattı kontrol grubu olarak kullanılmış ve MYCN amplifikasyonu gözlenen beş (5) adet NB hücre hattı üzerinde ilgili genlerin ifade değişimleri saptanmıştır. ??Ct formülü kullanılarak yapılan hesaplama sonucunda, hedef grup ile kontrol grubu karşılaştırıldığında AURKB geninin ifadesinde 6.45 kat, ESCO2 geninin ifadesinde 6.75 kat, HDAC2 geninin ifadesinde 5.41 kat, PRMT8 geninin ifadesinde 5.80 kat ve RNF2 geninin ifadesinde 4.12 kat artış gözlenmiştir. Aynı şekilde yapılan karşılaştırma sonucunda HDAC9 geninin ifadesinde 4.51 ve NEK6 geninin ifadesinde ise 4.66 kat azalış gözlenmiştir.

Hepatokarsinogenez sürecinde Cullin 2 gen ekspresyonu ve aktivasyonunun rolünün hepatoselüler karsinom hücre dizilerinde incelenmesi

Hepatosellüler karsinoma (HCC) sirotik zeminde gelişir. Sirozun tetiklediği fibrogenez süreci hipoksik bir çevrenin oluşmasına neden olur. Bu hipoksik ortamda Hipoksice İndüklenen Faktör (HIF1) birikir. HIF1 glukoz metabolizması, sağ kalım, invazyon, anjiyogenez, metastaz ile ilişkili pek çok genin ekspresyonunu başlatır. HCC'lerde HIF1 birikimi kötü prognozla ilişkilidir. HIF1 iki altbirimden oluşur: alfa ve ß. Hücrede ß alt birimi devamlı stabil durumdayken, alfa altbiriminin stabilitesi hücredeki oksijen konsantrasyonuna bağlıdır. Cullin 2 (CUL2) E3 ligazlar bu alfa alt birimini parçalanmasında görev yaparlar. Bu sayede hücrede HIF1 birikimini önlerler. Çalışmamızda önce HCC hücre dizilerinde CUL2 ekspresyon düzeyleri incelendi ve incelettiğimiz 12 hücre dizisinin tamamında farklı düzeylerde bazal ve aktif (neddile) CUL2 ekspresyonu olduğu saptandı. Daha sonra HIF1 birikimini artırdığı bilinen bir kimyasal olan Kobalt klorid (CoCl2) uygulamasının HCC hücre dizilerinde CUL2 ekspresyonuna etkisi araştırıldı. RT-PCR ve Western blot (WB) tekniği kullanarak yaptığımız çalışmamızda SK-Hep 1 ve HuH7 HCC hücre hatlarında CoCl2?nin zamana ve doza bağlı olarak CUL2 ekspresyonunu arttırdığını belirlendi. CoCl2,?ün hücre sağkalımını nasıl etkilediğini belirlemek için MTT yöntemini kullanıldı. CUL2 ekspresyonu artışının hangi mekanizma ile gerçekleştiğini belirlemek için HIF1 düzeyinin regülayonunda ve hepatokarsinogenez sürecinde rol oynadığı bilinen Hepatosit Büyüme Faktörü (HGF) /c-Met yolağının rolünü araştırdık. Bu yolağı seçmemizde daha önceki mikroarray çalışmalarımızda HGF reseptörü olarak bilinen c-Met aktive edildiğinde ekspresyonu değişen aday genlerden birinin CUL2 olması da rol oynadı. HGF veya Heparin aracılıklı c-Met aktivasyonunun CUL2 ekspresyonunu üzerindeki etkisini RT-PCR ve WB yöntemleri ile incelendi. RT-PCR ile Heparin ve HGF'nin tek başına CUL2 transkripsiyonunu arttırırken, birlikte CUL2 transkripsiyonunu baskıladığı belirlendi. WB tekniği kullanılan çalışmada Heparinin doz ve zamana bağlı olarak CUL2, HGF?nin de zamana bağlı olarak CUL2 ekspresyonunu arttırdığı saptandı. Sonuç olarak literatürde ilk kez HIF1 artışının, HGF, heparinin CUL2 ekspresyonunu düzenlediği belirlenmiştir. Bu da CUL2'nin hepatokarisnogenez sürecinde önemli rol oynayan bir protein olduğu düşündürmektedir. Anahtar kelimeler: CUL2, HIF1, CoCl2, heparin, HGF, HCC

Hepatosellüler karsinoma hücrelerinde lityumun genom düzeyine etkileri

Hepatosellüler karsinoma (HCC) dünyada ölümle sonuçlanan kanser türleri arasında üçüncü sırada yer almaktadır. Yapılan çalışmalarda, hepatik kanser kök hücrelerin de (HpKKH) hepatokarsinogenezden sorumlu olabileceğini bildirilmiştir. Çalışmamızda lityumun HuH-7 hücrelerinde transkirptoma, biyolojik yanıtlara ve HpKKH'lere etkisi araştırıldı. HCC hücre hatlarında proliferasyon inhibisyonu yaratan lityum, HuH-7 hücrelerinde adezyonu azaltırken motilite ve invazyonu artırdı. Yapılan transkriptome analizlerinde, lityumun değiştirdiği genlerin büyük kısmının metabolizma ve hücre döngüsüyle ilişkili olduğu ortaya kondu. Aynı zamanda lityumun pluripotensi ile farklılaşma genleri üzerinde yarattığı etki ve yönlendirdiği biyolojik davranışlar, hücrelere daha az farklılaşmış daha pluripotent bir fenotip kazandırdığını gösterdi. Bunun yanında çalışmalarımızın sonunda, kolon kanser kök hücreleri markeri olarak bilinen LGR5'in, HCC'de bir Wnt/b-katenin hedef geni ve bir kanser kök hücre belirteci olduğu belirlendi. Yine çalışmalarımızda, EpCAM ve CD133 yüzey molekülleri kullanarak HuH-7 hücreleri içerisinden ayrımlanan hepatik kanser kök hücrelerde (HpKKH), OCT-4, KLF4, MYC ve SOX2 pluripotensi genlerinin daha yüksek düzeyde eksprese edildiğini gösterdi. Bununla birlikte, EpCAM+/CD133+ HpKKH'lerin, morfolojik ve davranışsal olarak lityuma maruz kalmış hücrelere benzediği ortaya kondu. Aynı zamanda bu hücrelerin EpCAM-/CD133- hücrelere göre daha az proliferatif, daha az adezif ve daha motil karakterde olduğu bulundu. Lityumun HpKKH'ler üzerinde etkisini araştırdığında, EpCAM-/CD133- hücrelerin proliferasyon ve adezyon davvranışları bakımından parental HuH-7 hücreleri gibi lityuma duyarlı olduğunu, buna karşın EpCAM+/CD133+ HpKKH'lerdeki adezyon, proliferasyon ve motilite gibi biyolojik davranışların lityuma yanıt olarak etkilenmediği görüldü. Tüm verilerimiz bir arada değerlendirildiğinde, Wnt/b-katenin yolağının HpKKH karakterini ve metabolizmasını yeniden programladığı ve geliştirilecek tedavi stratejilerinde hedef alınması gerektiği düşünülmektedir. Anahtar kelimeler; HCC, Lityum, HpKKH, Wnt/b-katenin sinyal yolağı

Bipolar bozukluk (BD) olgularında CALHM1 (Kalsiyum Homeostaz Düzenleyici Faktör) geninin SNP (Mutasyon/Polimorfizm) ler yönünden incelenmesi

Bipolar bozukluk, mani/hipomani ve depresyon dönemleri ile seyreden ve genetik geçiş gösterebilen psikiyatrik bir hastalıktır. Toplumda % 1,3 oranında görülmektedir. Bipolar bozukluk tip I toplumda kadınlarda ve erkeklerde aynı sıklıkla görülür. Bipolar bozukluk tip II erkeklere kıyasla kadınlarda daha yaygın görülür. Hastalığın etiyolojisi henüz net olarak gösterilememiştir. Amacımız bipolar bozukluğa neden olabileceğini düşündüğümüz CALHM1 (kalsiyum homeostaz düzenleyici faktör 1) genini mutasyon ve polimorfizmler yönünden araştırmak ve eğer varsa, hastalıkla ilişkilerini yorumlamaktır. Hipotezimiz, 'Endoplazmik retikulum zarında ve hücre membranında bulunan ve hücrelerde kalsiyum dengesinin düzenlenmesinde önemli rol oynayan CALHM1 gen ürününün işlevini etkileyebilecek mutasyon veya polimorfizmlerin bipolar bozukluk ile ilişkili olabileceği' şeklindedir. Ekson 1 için DSM-IV-TR bipolar bozukluk tanı kriterlerine uygun olarak tanı konmuş 40 hasta, onların 10 birinci derece akrabası ve 39 sağlıklı kontrol çalışmaya alındı. Ekson 2 için 40 hasta, onların 10 birinci derece akrabası ve 38 sağlıklı kontrol çalışmaya alındı Her birinden alınan kanlardan DNA izolasyonu yapıldı. Bu örneklerde PCR yöntemi ile CALHM1 geninin birinci ve ikinci eksonu amplifiye edilerek DNA dizi analizi yapıldı. Bu eksonlardaki SNP'ler Mutation Surveyor V4.0.9 programı ile incelendi. İstatistiksel analiz SHEsis programı kullanılarak yapıldı. Gende altı adet tanımlanmış dokuz adet yeni bulunmuş toplam 15 adet SNP saptandı. Bunlardan 360G>GA SNP'nin allel frekansı hasta grubu ve kontrol grubu arasında anlamlı fark gösterdi. Çalışmada en sık rastlanılan ve MAF değeri en yüksek olan SNP'ler rs729211ve rs4918016 idi. 360G>GA SNP proteinde aminoasit değişimine neden olmaktadır. Fakat bu SNP'nin bipolar bozukluklu hastalarda CALHM1 proteininin fonksiyonunu etkilediğini gösterebilmek için örneklem grubunun genişletilmesi şarttır. Anahtar Sözcükler: Bipolar bozukluk, CALHM1, SNP

Endometriomalı hastaların ektopik ve ötopik dokuda glycodelin mrna ekspresyonlarının belirlenmesi

Amaç; Endometrioma, uterus dışında özellikle iç organların ve karın zarının üzerinde endometrial gland ve stromanın ektopik olarak bulunmasından kaynaklanan bir hastalıktır. Çalışmamızda endometriozisli kadınların ektopik ve ötopik endometrium dokularının Glikodelin mRNA ekspresyon seviyesi ile endometriozis olmayan kadınların endometrium dokularının Glikodelin mRNA ekspresyon seviyesinin karşılaştırılması amaçlanmıştır. Yöntem; Çalışmamıza 26-45 yaş arası laparaskopi ve laparatomi sırasında tanı alan, histopatalojik olarak tanısı doğrulanan endometriozis tanılı 19 hasta ve 7 kontrol grubu dahil edildi. Endometriozisli kadınların ektopik ve ötopik endometrium dokuları ile kontrol grubu endometrium dokularının Glikodelin mRNA ekspresyonu Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile karşılaştırıldı. Sonuç; Endometriozisli hastaların ektopik endometrium dokularında Glikodelin mRNA ekspresyonunun, hastanın ötopik endometrium dokusuna ve kontrol grubu endometrium Glikodelin mRNA ekspresyonuna göre daha fazla olduğu saptandı. Ayrıca hastaların demografik özellikleri; yaş, gravida, vücut kitle indeksi açısından fark gözlenmedi. Dismenore ve Kronik Pelvik ağrı şikayeti endometriozisli kadınlarda endometriozis olmayan kadınlara kıyasla daha fazla olduğu gözlemlendi. Disparoni şikayetinde ise herhangi fark saptanmadı. Tartışma; Bu çalışmada endometriozisli kadınların ektopik ve ötopik endometrium dokuları ile endometriozis olmayan kadınların endometrial dokularını karşılaştırılarak ektopik endometrium dokularında Glikodelin mRNA ekspresyonun arttığı gösterilmiştir. Glikodelin genine etki eden faktörleri kapsamlı araştırarak endometriozis hastalığının tedavisine katkı sağlanabileceği düşünülmektedir. Ayrıca ektopik ve ötopik endometrium dokuları arasındaki gen ifadesinin karşılaştırmalı çalışmaları, endometriyozisin kompleks ve multifaktöryel gelişiminde rol oynayan mekanizmalarını aydınlatabilir. Anahtar kelimeler; endometriozis, anjiyogenez, Glikodelin, mRNA ekspresyonu.

Hepatoselüler karsinom olgularında Her2/neu gen amplifikasyonunun floresan in situ hibridizasyon yöntemi ile belirlenmesi

1. ÖZETHepatoselüler karsinom (HCC) karaciğerin sık rastlanan malign tümörüdür veen çok Çin ve Afrika popülasyonunda gözlenir. 2000 yılı verilerine görekanserler arasında sıklık açısından beşinci sırada yer alırken kanserden ölümsıklıkları arasında üçüncü sırada bulunmaktadır. HCC gelişiminde birçokfaktörün önemli rol oynadığı bilinmekte; siroz, alkol kullanımı, hepatit B, Cvirüsleri ve aflatoksin risk faktörleri arasında değerlendirilmektedir.Hepatokarsinogenez sürecinde proto-onkogenler, growth faktörler ve tümörbaskılayıcı genlerin değişiklikleri rol oynamaktadır. Her-2/neu (ErbB2) 17.kromozomun uzun kolunda lokalize olmuş bir proto-onkogendir (17q11.2).Epidermal growth faktör reseptör ailesi üyesi olan Her-2/neu 185 kDa (p185)ağırlığında transmembran tirozin kinaz reseptörünü kodlar ve EGFR ile yüksekderecede homoloji gösterir. Aşırı ifadelenmesi kanserlerde kötü prognostikgöstergedir. Değişik epitel tümörlerinde Her-2/neu geninin amplifikasyonu ya dap185 proteininin aşırı ekspresyonu gösterilmiştir. Reseptörün aşırı ifadelenmesinormal kontrol mekanizmasını bozarak agresif tümör hücrelerinin oluşumunayol açmaktadır. Bu çalışmanın amacı; Her-2/neu onkogenininamplifikasyonunun HCC oluşumundaki olası rolünü araştırmak ve amplifikasyonile tümörün klinik yansıması arasındaki ilişkiyi ortaya çıkarmak olarakbelirlenmiştir. Bu kapsamda patolojik olarak HCC tanısı almış 35 olgununparafin blok doku kesitleri çalışmaya alınmış, Her-2/neu probu ile hibridizasyonutakiben yapılan FISH analizleri sonucunda 2 olguda amplifikasyon saptanırken3 olguda 17. kromozom açısından sayıca artış saptanmıştır. Bu olgularınpatolojik olarak grade 2 veya 3 olduğu, tümör çapının 3 -14 cm arasındadeğiştiği, hastalara uygulanan tedavilerin tümör büyüklüğü ve laboratuvardeğerleri ile ilişkili olduğu saptanmıştır. Çalışmanın sonuçlarıdeğerlendirildiğinde HCC patogenezinde Her-2/neu amplifikasyonunun primermekanizma olmadığı, çok aşamalı karsinogenezdeki basamakların gelişiminderol oynadığı düşünülmektedir.Anahtar kelimeler: Hepatoselüler karsinom, Her-2/neu, floresan in situhibridizasyoniii

PCR-RFLP yöntemi ile meme kanseri olgularına ait parafin blok doku kesitlerinde HER-2/NEU gen polimorfizminin belirlenmesi

Meme kanseri kadınlarda en sık görülen kanserdir ve kanser nedenli ölümler arasında akciğer kanserinden sonra ikinci sırada gelmektedir. Meme kanseri hücre büyümesi ve gelişmesine katılan önemli hücresel yolları etkileyen genetik değişimler ile çok adımlı işlemler sonucu ortaya çıkmaktadır. Rutin uygulamada meme kanserinde pratikte kullanılan en güçlü prognostik faktörler: Lenf nodu metastazı, tümör çapı, histolojik grade ve histolojik tiptir. Steroid hormon reseptör durumu ve moleküler belirteçler diğer önemli prognostik faktörlerdir. HER-2/neu kromozom 17q21'de lokalize olmuş bir proto-onkogen olup tirozin kinaz aktivitesine sahip bir transmembran glikoproteini (p185) kodlamaktadır. Bu protein epidermal büyüme faktör reseptör ailesinin bir üyesidir. HER-2/neu amplifikasyonu ve/veya aşırı ifadelenmesi kötü prognoz ile ilişkilendirilmiştir. HER-2/neu geninin 655. kodonundaki transmembran parçayı kodlayan bölgesindeki tek nükleotid polimorfizmi (SNP) adeninin guanine dönüşümü (A?G, Ile?Val) sonucunda oluşmaktadır. HER-2/neu geninin 655. kodonundaki bu SNP'nin (rs1136201), ya izolösin (Ile:ATC) ya da valin (Val:GTC) kodladığı tanımlanmıştır. Yapılan çalışmalarda Ile/Val SNP'nin artmış meme kanseri riski ile ilişkili olduğu bildirilmiştir. Ancak, pek çok çalışmada bu ilişkinin tartışmalı olduğu gösterilmiştir.Biz bu çalışmada HER-2/neu kodon 655 polimorfizmini 58 meme kanseri hastasından ve kontrol grubuna dahil edilen 55 bireyden elde edilen parafin blok doku kesitlerinde analiz ettik ve polimorfik allellerin meme kanseri ile ilişkisini değerlendirdik. DNA izolasyonunu takiben PCR-RFLP (Polimeraz Zincir Reaksiyonu-Restriksiyon Fragmenti Uzunluk Polimorfizmi) yöntemi uygulandı. Çalışılan 58 hasta ve 55 kontrol grubu bireyinde polimorfik Val alleli sıklığı %12.1 ve %17.3 olarak saptandı. Çalışmanın sonuçları değerlendirildiğinde HER-2/neu kodon 655 polimorfizmi ile meme kanseri arasında istatistiksel olarak anlamlı bir birliktelik görülmedi.Anahtar kelimeler: Meme kanseri, HER-2/neu, PCR-RFLP, Tek nükleotid polimorfizmi

Maternal ve fetal MBL2 genotiplerinin preterm doğumlarla ilişkisi

Yenidoğan döneminde, immün sistemin tam olarak gelismemesine bağlıkarsılasılan komplikasyonlara ek olarak, yenidoğanın ?prematüre? olmasıprenatal mortalite ve morbidite hızını arttıran baslıca faktördür. Görülmesıklığının %9 olması nedeni ile, günümüz perinatal tıbbının çözmeye çalıstığı veçevresel, tıbbi ve kalıtsal faktörlerin rol oynadığı çoklu değisimlere bağlı biryenidoğan sorunudur. Patogenezi aydınlatmaya yönelik yapılan çalısmalardainflamasyonun gestasyonel süreci etkilemesi, preterm etkeni olarak kabulgörmesine neden olmustur. Bu bulgu inflamatuar yanıtın olusmasında roloynayan proteinleri kodlayan genlerdeki polimorfizmlerin, preterm yatkınlıkfaktörü olarak arastırılmasını gerektirmektedir. Mannoz bağlayan lektin-2(MBL2) karaciğerden sentezlenir ve hipogammaglobulinemik fazda rol oynayanbir lektin yolağı proteinidir. Maternal serum düzeyinin gebeliğin ilk trimesterindeartısına ek olarak nidasyon, plasentasyon ve hamileliğin devamında islevselolduğunun anlasılması, MBL2'nin gebelik komplikasyonları-inflamasyoniliskisinin aydınlatılmasında belirteç olabileceğini göstermistir. Serum düzeyfarklılığı, 10q11.2-q21'e lokalize olan MBL2 geninin promotör ve 1. ekzonundakitek nükleotid polimorfizmlerinden (SNP) kaynaklanmaktadır. Promotörbölgedeki polimorfizmler genin transkripsiyonunu etkileyerek proteindüzeyindeki değisimlerden sorumludur. MBL geninin 1. ekzonunda meydanagelen gen varyantları ise proteinin homopolimer özelliğini bozarak,sitoplazmada degredasyona yatkın hale gelmesine neden olur. Bu bilgilerdoğrultusunda, çalısmamızda term ve preterm doğumlarla maternal?fetal MBL2ekzon 1 genotiplerinin iliskisi arastırılmıstır.Bu amaçla, 100 term (38,8±1,2 hafta) ve 83 pretermden (30,2±2,7 hafta) eldeedilen maternal ve kord kan örneklerinden genomik DNA izolasyonu yapılmıstır.Daha sonra MBL2 kodon 52 (db SNP ID rs5030737), 54 (db SNP ID rs1800450) ve57 (db SNP ID rs1800451) genotiplemesi PZR-RFLP analizi ile gerçeklestirilmistir.Kodon 57 polimorfizminin toplumumuza özgü olmadığı gözlenirken, termdoğumlarda maternal kodon 54 230 G/A genotipinin preterm doğum yapanannelere göre anlamlı derecede yüksek olduğu (p<0.045) saptanmıstır. Pretermgrupta, fetal-maternal kodon 54 GG genotip sıklığının term fetal-maternal grubagöre daha yüksek olduğu saptanmıstır (p<0.001).Gebelik inflamasyonun arttığı bir süreçtir. Proinflamatuar sitokin düzeyindekiartıs gestasyonel süreci de kısaltır. Önceki çalısmalarda, kodon 54 230 G/Agenotipinin düsük düzeyde MBL2 sentezlediği gösterilmistir. Bu verilerbirlestirildiğinde, gestasyonel sürecin uzamasına neden olan genotipin biravantaj sağladığı görülmektedir.Multifaktöriyel hastalıklarda rol oynayan mekanizmaların tek bir parametre ileaçıklanması söz konusu değildir. Gestasyonel sürecin devamlılığınınsağlanması için fetal-maternal immünitenin karsılıklı regülasyonunda roloynayan genler ile ilgili veri tabanlarının olusturulması, ile risk gruplarınınbelirlenmesi mümkün olabilecektir. Bu nedenle, bu çalısmanın fetal-maternalimmün regülasyonda rolü olan diğer faktörlerle birlestirilerek devam etmesigerektiği kanısına varılmıstır.Anahtar Kelimeler: Mannoz bağlayan lektin-2 (MBL2), PZR-RFLP, pretermdoğum, tek nükleotidlik polimorfizm (SNP)

Maternal ve fetal sitokin genotiplerinin preterm doğumlarla ilişkisi

Yenidoğan dönemindeki bakım olanaklarının iyileşmesi ile preterm yeni doğanların prognozunda önemli gelişmeler olmasına rağmen, preterm doğum, perinatal mortalite ve morbiditeyi etkileyen önemli bir faktördür. Multifaktöryel doğası nedeni ile preterm doğum patogenezinde rol oynayan mekanizmalar halen aydınlatılamamıştır. Gebeliğin mekanizması tam olarak açıklanamamış olmakla beraber tüm veriler anne ile fötus arasındaki matriks metabolizmasında rol oynayan pro ve anti-inflamatuar sitokinlerin ve reseptörlerinin önemine dikkat çekmektedir. Proinflamatuar sitokin ailesi üyelerinden TNF-? ve IL-1'in işlevini göz önüne alarak çalışmamızda 100 preterm ve 101 term yenidoğan ve annesinden genomik DNA örnekleri elde edilmiştir. PZR-RFLP analizi ile TNF-? (-238 G/A, -308 G/A), IL1-? (4845 G/T) ve IL-1ß (-511 C/T) genotiplemesi gerçekleştirilmiştir. TNF-? -238 G/A genotiplememizde çalışma popülasyonumuzda -238 AA genotipi saptanmamıştır. Bulgularımızda termde doğan bebeklerde -238 GA genotipi preterm bebeklere göre anlamlı derecede yüksek bulunmuştur (p<0.05). Ek olarak maternal-fetal TNF-? -238 GA genotipi term olasılığını da arttırmaktadır (p<0.05). TNF-? -308 GA ve AA genotipi term doğum yapan anne ve bebeklerde preterm grubuna göre anlamlı derecede yüksek bulunmuştur (sırasıyla p<0,05, p<0,001). Maternal?fetal genotip kombinasyonunun preterm doğum ile ilişkisi incelendiğinde ise; maternal-fetal TNF-? -308 GA heterozigotluğunun term doğum olasılığını arttırırken; heterozigot annenin bebeğinin GG genotipine sahip olması preterm doğum olasılığını arttırmaktadır (p<0.01). T allel sıklığı preterm doğum yapan anne ve bebeklerde daha yüksektir (p<0.001). Maternal IL1-? 4845 GG ve GT genotiplerinin term doğuma yatkınlığı arttırdığı gözlenirken, fetal 4845 TT genotipi, anne genotipinden bağımsız olarak preterm doğum olasılığını arttırmaktadır (p<0.01). IL-1ß -511 TT genotipi term bebeklerde preterm doğan bebeklere göre anlamlı derecede yüksek bulunmuştur. IL-1ß -511 CT genotipinde ise; preterme yatkınlık artarken, CC genotipi ile preterm arasında anlamlı bir ilişki kurulamamıştır. Annelerde de IL-1ß -511 C/T polimorfizminin term veya preterm doğum ile ilişkilendirilememiştir. Maternal IL-1ß -511 TT genotipi ile fetal CT genotipi preterme yatkınlığı arttırırken, maternal -511 CT veya -511 TT genotipi ile fötal TT genotipleri eşleştiğinde term doğum olasılığı artmaktadır (p<0.01). Proinflamatuar ve anti-inflamatuar sitokin gen polimorfizmlerinin preterm doğuma yatkınlık belirteci ve risk tabakalandırılmasında kesin rolünün tanımlanabilmesi için daha geniş kapsamlı çalışmalar gerekmektedir.Anahtar Kelimeler: TNF-? (-238 G/A), TNF-? (-308 G/A), IL1-? (4845 G/T), IL-1ß (-511 C/T), preterm doğum

İnsülinoma kökenli fare beta hücre hatlarında TRAIL'ın apoptotik etkinliğinin araştırılması

Tip 1 Diyabet'te (T1D), pankreatik beta hücrelerinin, progresif insülitis sürecinde, proinflamatuar sitokinlerin etkisi ile yıkıldığı bilinmektedir. TNF ve FasL'ın yanında, IFN-gama ve IL-1beta'nın da beta hücre ölümüne katkıda bulunarak T1D'in ortaya çıkmasında önemli rol oynadığı gösterilmiştir. 1995 yılında keşfedilen TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand'ın (TRAIL) ise, TNF ailesi üyesi diğer sitokinlerin aksine otoimmun reaksiyonları baskılayabildiği gösterilmiştir. Ancak TRAIL'ın, beta hücrelerinin ölüm mekanizmasında da rol alıyor olabileceği düşünülmektedir. Dolayısıyla, TRAIL'ın beta hücreleri üzerindeki etkisi, ve genel olarak T1D'teki kesin rolü henüz açığa çıkarılamamıştır. Sonuçlarımız, kullandığımız NIT-1 fare beta hücre hattında TRAIL hücre yüzey reseptörlerinden DR5'in en yüksek oranda sentezlendiğini, DcR1 ve DcR2 yalancı reseptörlerinin de belirgin oranda ifade edildiğini göstermiştir. Çalışmamızda, NIT-1 hücrelerinde TRAIL'ın çözülebilir formunun (sTRAIL) orta derecede sitotoksik etki yarattığı gösterilmiştir. TRAIL inflamatuar sitokinlerle birarada uygulandığında kısa dönemde (24 st) hücre canlılığını azaltıcı yönde ek bir etki göstermesine rağmen, uzun dönemde (48 st) bu etkinin kaybolduğu, koruyucu etkinin dahi ortaya çıkabildiği gözlenmiştir. Bu sonuçlarla uyumlu olarak, DR5 ölüm reseptörünün inflamatuar sitokinlerin etkisi ile 48. saatte baskılandığı görülmüştür. NIT-1 hücreleri üzerinde TRAIL ligand ekspresyonu da yine proinflamatuar sitokinlerin etkisi ile 24. ve 48. saatlerde baskılanmıştır. Bulgularımız, NIT-1 pankreatik beta hücrelerinde proinflamatuar sitokinler ile birlikte TRAIL uygulamasının, ilk aşamada ölüm oranının artırdığı, ancak sonrasında TRAIL'ın bu hücrelerde inflamatuar sitokinlerin etkisine ek olarak canlılığı inhibe edici etkisinin olmadığı, koruyucu etkinin dahi ortaya çıkabildiği gözlenmiştir. Sonuçlarımızın TRAIL'ın T1D'teki rolünün daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunacağını düşünüyoruz.

İnsülin sinyal iletiminde P38 kinazın rolünün araştırılması

IRS1 (insulin reseptör substrat protein 1), insülin resptörünün ana adaptörü olup insülin sinyal iletiminin pozitif ve negatif regülasyonundan sorumludur. İnsülin sinyal iletimi sürecinde ligant bağlayan insulin reseptörü (IR) oto-fosforilasyonla tirozin fosforilasyonuna uğrar, ardından, IRS1 bu fosfo-tirozinlere kendi SH2 domaini aracılığı ile bağlanır. İnsülin reseptörüne bağlanan IRS1 YXXM motiflerinden IR tarafından tirozin fosforilasyonuna uğratılır ve YXXM'lerin 4 tanesi C-terminalde yer alır. Bu fosforilasyon noktaları PI3K' ın p85α regülatör alt birimi için bağlanma noktalarıdır. Bu noktalara bağlanan PI3Kp85α aynı zamanda PI3Kp110α'ya da bağlanıp bunun aktivasyonunu sağlar. Aktive olan PI3Kp110α PIP2(phosphatidyl inositol di-phosphate)'den PIP3 (phosphatidyl inositol tri-phosphate) oluşturarak PDK1 aktivasyonu yapar. Aktive olan PDK1 AKT'yi S308 üzerinden fosforile ederek aktive eder. Aktive olan AKT, glukoz taşıyıcıları GLUT1 ve GLUT4 aktivasyonu yaparak glukozun hücre içine alınmasını düzenler. Her ne kadar IRS1'in Tirozin fosforilasyonu insülin sinyal iletimini olumlu etkilese de IRS1'in Serin/Treonin fosforilasyonu insülin sinyal yolağını genellikle negatif etkilemektedir. Bu nedenle, IRS1 üzerinde gözlenen S/T fosforilasyonlarını yapan enzimlerin tanımlanması insülin sinyal iletimi ve insülin direnci oluşumu mekanizmalarının gösterilmesi açısından önemlidir. IRS1' in serin/treonin fosforilasyonları genellikle LPS, osmotik stress, ER stresi, UV ve İyonize edici radyasyon gibi stres faktörleri ile artar ve bu insülin direnci/tip 2 diyabet' in ana sebeplerinden biridir. p38 MAPK da bu faktörler ile aktive olmaktadır. İnsan IRS1' inin protein yapısını incelediğimizde GYMPMS616P, DYMPMS636P, GYMMMS666P, DYMNMS736P dizilerini saptadık ve hepsi p38 MAPK fosforilasyon motifidir. Bu çalışmamızda p38 MAPK aktivatörü varlığında IRS1' in bu bölgelerden fosforile olduğunu saptadık. Bu amino asit rezidularının anlamlılığını belirlemek için ilgili amino asitleri fosforile olamayan Alanin ve fosforilasyonu taklit eden negatif yüklü Glutamik asit formlarına çevirdik. Elde ettiğimiz sonuçlara göre p38 MAPK' ın insülin direnci gelişiminde ve hücre proliferasyonu üzerinde IRS1 aracılı regülasyonda etkin rol oynadığını belirledik. Ayrıca p38 MAPK' ın IRS1' i fosforile ettiği bölgeye bağlı olarak hücrelerin proliferasyonu ve glukoz alınımları üzerinde negatif ya da pozitif etki gösterdiğini saptadık. Bu veriler ışığında da p38 MAPK aracılı IRS1 Ser/Thr fosforilasyonlarının, insülin sinyal sinyal iletiminde ve etkileri üzerinde fosforilasyon bölgesine spesifik etki gösterdiğini söyleyebiliriz.

Böbrek nakli hastalarında miRNA işlenmesinde görev alan komponentlerin ekspresyon profili

Transplantasyon alanında, klinik belirtiler ortaya çıkmadan önce greftin akıbetini önceden kestirebilmek için biyobelirteç çalışmaları yapılmaktadır. Son yıllarda mikroRNA'lar çok sayıda hastalığın teşhisi ve prognozu için biyobelirteç olmaya aday moleküllerdir. Bu doğrultuda immünsüpresanların miRNA biyogenezinde görevli komponentlerin seviyeleri üzerindeki etkilerini araştırdık. Böbrek nakli hastalarında nakil öncesi ve nakilden 3 ay sonrasında periferik kandaki mononükleer hücrelerin lizatlarında Dicer, Drosha, DGCR8, Argonaute2 ve Exportin5 ekspresyon seviyelerini inceledik. Rejeksiyon gerçekleşmeyen hastalarda Dicer, Drosha, DGCR8 ve Argonaute2 ekspresyon seviyelerinde azalma görülürken Exportin5 ekspresyonunda bir değişime rastlanmadı. Ancak kronik rejeksiyon gelişen olguda Dicer hariç diğer protein ekspresyonlarında değişimler görüldü. Akut rejeksiyon gelişen olguda ise Exportin5 ekspresyonunda artış gözlendi. Bu genlerin mRNA ekspresyon seviyeleri transplantasyon sonrası 3. ayda istatistiksel olarak anlamlı bir azalma gösterdi ve bu azalma kronik rejeksiyon gelişen olguda daha fazlaydı. Bunlara ek olarak, Everolimus kullanan hastalarda Dicer ekspresyonu değişmezken Argonaute2 ekspresyonunda artış görüldü. Sonuç olarak çalışmamız immünsüpresif ilaçların miRNA sentezini etkileyebileceğini ve nakledilen organın takibi için potansiyel bir biyobelirteç olarak kullanılabileceğini göstermektedir.

Mülleryan aplazili Türk olgularda aday gen haritalama çalışmaları

Mülleryan Aplazi (MA), diğer adlarıyla Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser (MRKH) Sendromu, Konjenital Uterus ve Vajina Yokluğu (CAUV; OMIM 277000); fallop tüpleri, uterus ve vajinanın üst 2/3'ünün konjenital aplazisi ile karakterize bir hastalıktır. İzole tip olan tip 1 ve renal, kardiyak, iskelet ya da işitme anomalilerinin eşlik ettiği tip 2 Mülleryan aplazi olmak üzere iki grupta sınıflandırılmaktadır. MA'nın insidansı, kadınlarda 1/4500 olarak belirlenmiştir. Poligenik ve multifaktöryal olduğu düşünülen hastalıkla ilgili aday gen çalışmaları sonuçları, henüz hastalığın genetik etiyolojisini tanımlamak için yeterli değildir. Kopya sayısı varyasyonları (CNV) olarak tanımlanan genomik mikrodelesyon ve mikroduplikasyonların belirlenmesi, hastalıkla ilişkili yeni aday genlerin belirlenmesi açısından son derece önemlidir. Çalışmamıza Mülleryan aplazi tanılı 66 olgu dahil edilmiştir. Olguların konvansiyonel sitogenetik analizi sonucu, hastalık etkeni olabilecek bir kromozomal abnormalite saptanmamıştır. 19 hastanın genomik DNA'sı, Affymetrix Cytoscan HD mikrodizin platformu ile CNV açısından taranmıştır. Dört hastada 1p31.1, 13p14.11 bölgelerinde mikroduplikasyon, 16p11.2, 16p13.3, Xq25 bölgelerinde mikrodelesyon saptanmıştır. CNV saptanan hastaların tamamı tip 1 Mülleryan aplazi tanılıdır. Hastalıkla ilişkili olabilecek resesif varyasyon bölgelerinin belirlenmesi için homozigosite analizi yapılmıştır ancak, ortak bir homozigot bölge tespit edilememiştir. CNV çalışmalarının yanı sıra, hastalıkla bugüne kadar en iyi ilişkilendirilen Wingless-type MMTV integration site family, member 4 (WNT4, NM_030761.4) geni ve belirlenen olası aday genlerin dizi analizi çalışmaları yapılmıştır. Toplamda 12 genin tüm ekzonları ve ekzona yakın intronik bölgelerin dizi analizinin yapıldığı çalışmamızda, Hepatosit Nüklear Faktör 1 beta (HNF1B, NM_000458.2) geni intron 2 bölgesinde c.545-49_50insTGTC (n=5), intron 8 bölgesinde c.1535+47_48insC (n=5) ve LIM Homeobox 1 (LHX1, NM_005568.3) ekzon 5 bölgesinde c.1162G>T (p.Ala388Ser) (n=5) varyasyonları saptanmıştır. Aile bireylerinin ilgili varyasyonlar açısından taranması ile, saptanan varyasyonların ailesel geçiş gösterdiği bulunmuştur. Ek olarak, LHX1 geninde saptanan p.Ala388Ser varyasyonunun, SIFT analizi aracılığıyla protein fonksiyonu üzerine etkisi, "tolere edilebilir" olarak bulunmuştur. Ayrıca, Family with Sequence Similarity 190, Member A (FAM190A/KIAA1680, NM_001145065.1) ve Katenin Alfa 3 (CTNNA3, NM_013266) genlerinde, sırasıyla c.2117A>G (p.Lys706Arg) (n=1), c.1732+13C>T (n=1) varyasyonları saptanmıştır ancak varyasyonların doğrulanması gerekmektedir. Mülleryan aplaziden sorumlu gen ya da genlerin bulunması ile ilgili çalışmamız devam etmektedir. Daha çok sayıda Mülleryan aplazili bireyde yapılacak CNV analizi, homozigosite haritalaması ve olası aday genlerin dizi analizi, hastalığın moleküler temellerinin aydınlatılması açısından önem kazanmaktadır. Elde edilecek bulgular, konjenital kadın üreme sistemi anomalilerinin tanı ve tedavisine yardımcı olabilecektir.

Meme/over kanseri ailelerinde BRCA1/BRCA2 dışı genlerin hastalık riskine etkisinin araştırılması

Meme kanseri Türkiye'de ve dünyada kadınlar arasında en sık görülen malignensidir. Mame kanseri dünya çapında kadınlar arasında her yıl 40.000 ölüme neden olur. Meme kanseri kompleks ve çok faktörlü bir hastalıktır. Meme kanserlerinin yaklaşık % 5-% 10'nu kalıtsaldır. Kalıtsal meme kanserinin %15-20'sinden BRCA1/2 genlerinin mutasyonları sorumludur. BRCA1/2 gen mutasyonları Türk toplumunda kalıtsal meme kanserinin %10'undan daha azını oluşturmaktadır. Bu sebeple BRCA1/2 genleri dışında meme kanseri yatkınlık genlerinin rolünün incelemesi gereklidir. Farklı meme kanseri yatkınlık genleri arasında P53, PTEN ve CHEK2 genleri daha fazla ön plana çıkmaktadır. Bir çok çalışmaya göre bu genler meme kanseri riskini arttırmaktadır, hatta bazen tedavi sonuçlarını da etkileyebilmektedir. Bu çalışmaya BRCA1/2 mutasyonuna shahip olmayan ve aile hikayesi güçlü olan meme kanseri tanısı almış12 birey dahil edilmiştir. Genomik DNA, periferal kandan izole edilmiştir. P53 ve PTEN genlerinde hotspot bölgeleri içeren ekzonlar (PTEN için: 2., 3., 5., 6., 7. ve 8. Ekzonları ve P53 için, 4., 5., 6., 7., 8. ve 9. ekzonları) amplifiye edildi. CHEK2 geni ise bütün kodlayıcı ekzonlar ( ekzon 2-ekzon 15 ) amplifiye edildi. PCR ile amplifiye edilmiş ekzonlar otomatik kapiler jel elektroforezi ile dizileme cihazı ile dizileri okundu ve mutasyon ya da değişim açıdan kontrol edildi. Çalışmanın sonucunda 12 hastanın tümünün P53 geninde c.215C > G (p.Pro72Arg) polimorfizmin 12 olgudan birinde homozigot oalarak, P53 geninde 6. ekzonunda c.638G > A (p.Arg213Gln) mutasyonu heterozigot olarak bulunmuştur. Oniki olgunun tümünde PTEN geninde c.802-4_802-3delTTdelesyonu heterozigot olarak saptanmıştır. CHEK2 geninde ise bir olguda c.470T (p.I157T) mutasyonu heterozigot olarak bulunmuştur. Sonuç olarak Türk popülasyonunda P53 c.215C>G (p.Pro72Arg) ve c.638G > A (p.Arg213Gln) , PTEN c.802-4_802-3delTT ve CHEK2 c.470T>C (p.I157T) değişiklikleri , meme kanserin riskini etkileyebilmektedir. Ama bu değişimlerin frekansları , meme kanserinin üzerindeki etkisi ve meme kanserinin riskini ne kadar etkilediğinin bilinebilmesi için daha fazla çalışmalara ihtiyaç vardır . Anahtar Kelimeler: Meme Kanseri, P53 Gen , PTEN Gen, CHEK2 Gen, PCR, DNA Dizileme, Mutasyon

E2F1 transkrı̇psı̇yon faktörü'nün aktı̇vasyonunda proteı̇n kı̇naz-A'nın rolünün araştırılması

Adenoviral E1 ve E2 genlerinin, transkripsiyondan sorumlu olduğunun gösterilmesi ile keşfedilen E2F1 geni, 20. kromozomun uzun kolunda yer almaktadır. Translasyon ürünü ise 437 aminoasitlik bir proteindir. Dimerizasyon partneri ile dimer oluşturduktan sonra E2F1 hücre siklusunun G1 aşamasında aktif hale geçmekte ve hücre bölünmesi ile ilgili DNA Polimeraz gibi birçok sayıda genin transkripsiyonunu kontrol etmektedir. Transkripsiyonel olarak kontrol edilebilen E2F1 aktivitesinin post-translasyonel modifikasyonlar ile de kontrol edildiği görülmektedir. Translasyon sonrası E2F1, P/CAF aracılığıyla asetilasyona, Set 9 ile metilasyona ve CHK2 aracılığıyla da fosforilasyona uğrayabilmektedir. Set 9-aracılı metilasyonu E2F1'in parçalanmasına yol açarken, CHK2 ve P/CAF modifikasyonları ise metilasyonu engelleyerek proteinin stabilizasyonunu sağlamaktadır. DNA Hasarı, UV maruziyeti gibi patolojik koşullarda post-translasyonel modifikasyonlara uğrayan E2F1'in, fizyolojik koşullarda da çeşitli moleküller tarafından post- translasyonel modifikasyonlara uğratılması mümkündür. Epinefrin, adrenalin, endotelin-1 ve çok sayıda kemokin hücre fizyolojisinde hayati fonksiyonlar görürler ve etkinliklerini GPCR (G-protein coupled receptors) olarak isimlendirilen reseptörlere bağlanarak gösterirler. Bu reseptörlerin bahsedilen ligantları tarafından aktive edilmeleri durumunda pek çok yolak aktive edilir ve bu yolaklardan biri de Adenilat Siklaz dır. Aktive edilen Adenilat siklaz ATP'den cAMP oluşturur. Bunun yanı sıra cAMP seviyesi hücre içi glukoz miktarının azaldığı durumlarda da yükselir. cAMP ilk keşfedilen ikincil mesajcı olup hücrede biyolojik etkinliğini PKA enzimini aktive ederek gösterir. Aktive olan PKA biyolojik aktivitesini hedef proteinlerinde RxxS/T konsensus dizisinde yer alan Serin (S) veya Treonin (T) amino asitlerini fosforile ederek gösterir. Genel olarak hücre içi cAMP seviyesinin artmasına bağlı PKA aktivasyonu hücre proliferasyonunu negatif olarak etkiler. Bu gerçekler ışığında, aktive edilen PKA enziminin hücre döngüsünün başlamasını kontrol eden E2F1 aktivitesini negatif etkileyeceğini düşündük. Bu bilgiler doğrultusunda, E2F1'in PKA substratı olup olmayacağını görmek için E2F1'in aminoasit dizisini incelediğimizde E2F1 proteininde üç adet muhtemel PKA konsensus fosforilasyon bölgesi saptadık. Bu fosforilasyon noktaları, 127-130, 232-235 ve 361-364 pozisyonlarında lokalize olan RYET, RLLS ve RMGS amino asit dizileridir. Bu bölgelerdeki Treonin ve Serin amino asitlerinin PKA tarafından fosforile edilebileceğini ve bu fosforilasyonların E2F1 aktivitesini etkileyeceğini düşünerek ilgili amino asitlerin kodonlarını yarattığımız ökaryotik E2F1 ekspresyon vektöründe fosforile edilemeyen Alanin ve fosforilasyonu taklit eden negatif yüklü Glutamik Asit kodonlarına çevirdik. Elde ettiğimiz sonuçlara göre, PKA-aracılı E2F1 fosforilasyonunun hücre proliferasyonu, apoptozis indüksiyonu, glukoz alımı ve Sisplatin-aracılı hücre ölümüne etki ettiğini gösterdik.

Beta talasemi majorlü hastalarda hbf indüksiyonu için genetik ve epigenetik çalışmalar

Tezimizin amacı, K562 hücre hattında ve Beta Talasemi Major hastalarının primer eritroid hücre kültürlerinde, HbF indüksiyon yolaklarında işe karışan BCL11A ve KLF1 genlerindeki genetik varyasyonlar ile resveratrol ve sodyum butiratın epigenetik mekanizmaları modifiye etme özellikleri arasındaki ilişkiyi ortaya koymaktır. K562 hücre hattı ve iyi sınıflandırılmış 30 BTM hastasının primer eritroid hücre kültürlerinde, resveratrol ve sodyum bütiratın p38, ERK1/2 ve NRF2 sinyal yolakları ile globin genleri RNA profilleri üzerine olan etkisine bakıldı. HbF miktarını regüle eden faktörler arasında KLF1 tüm gen, BCL11A rs11886868 varyantı ile XmnI polimorfizmleri Sanger Dizileme ve RFLP yöntemleri ile tespit edildi. Resveratrol ve sodyum bütiratın, K562 hücrelerinde doza bağımlı olarak hemoglobinizasyonu artırdıkları gözlendi. Her iki ajanın sinerjetik bir etkisi gözlenmedi. Yüksek dozda resveratrol kullanımının apoptotik etkisi gözlendi. Her iki ajanın da transkripsiyonel olarak gama globin indüksiyonu yapabildikleri gösterildi. K562 hücre hattında NRF2, ERK1/2 ve p38 aktivasyonu gözlenirken hastaların primer eritroid hücrlerinde p38 aktivasyonu ve ERK1/2 inaktivasyonu gözlendi. BCL11A rs11886868, XmnI polimorfizmi ve KLF1 genindeki varyasyonlar literatürle uyumlu bulundu.Beta talasemi major hastalarında, HbF indüksiyonu için kullanılacak farmakolojik ajanların seçiminde, bireysel genetik ve epigenetik faktörler dikkate alınmalıdır.

Birinci jenerasyon adenovirüs aracılı sistemik gen aktarımının deney hayvan modellerinde girişimsel olmayan yöntemlerle görüntülenmesi

Moleküler görüntüleme, canlı organizmalardaki biyolojik olayların anlaşılmasını kolaylaştıran bir teknolojidir. Günümüzde belirteç gen ifadesinin girişimsel olmayan yöntemlerle in vivo olarak görüntülenmesi, cooled charge-coupled (CCD) kameraların kullanılmasıyla mümkündür. In vivo olarak belirteç gen ifadesinin takibi, hastalık modellerinde tedavi edici genin hedef hücredeki ifadesinin takip edilebilmesi açısından önemli bir yaklaşımdır. Belirteç gen ifadesinin organizmadaki ifade yeri, yoğunluğu ve süresi, girişimsel yöntemlere ihtiyaç duyulmaksızın belirlenebilmektedir.Bu çalışmada, BALB/c farelerdeki transgen ifadesini in vivo olarak görüntüleyebilmek için yeni bir cihaz olan CCD kameranın kullanımı amaçlandı. Bu nedenle yeşil floresan protein geni taşıyan adenoviral vektörler (AdEGFP), BALB/c farelerin kuyruk veninden sistemik olarak farklı dozlarda enjekte edildi. Vektör enjeksiyonundan sonra, belirli zaman aralıklarında farelerdeki AdEGFP aracılı transgen ifadesi CCD kamera ile görüntülendi.Sonuçlarımız, adenoviral vektörlerle sistemik gen transferi sonrasında transgen ifadesinin karaciğerde olduğunu ve sentez miktarının 4. gün en üst seviye ulaşarak sonraki günlerde azaldığını ve en az 30 gün boyunca CCD kamera ile takip edilebileceğini göstermiştir. Bunun yanı sıra, derin dokulardaki transgen sentezine bağlı sinyallerin, cerrahi yöntemler ile %36 daha kolay tespit edildiği gösterilmiştir. Bu bulgular, girişimsel olmayan görüntüleme tekniğinin canlı organizmalarda transgen ifadesinin yeri, miktarı ve süresi ile ilgili bilgi verici olduğunu göstermektedir.

Tip 1 diyabet tedavisinde kullanılmak üzere adenovirüs aracılı TRAIL gen tedavi metodlarının geliştirilmesi ve etkinliklerinin diyabetik hayvan modellerinde test edilmesi

İnsülin üreten pankreatik beta hücrelerinin kalıcı yıkımı ile karakterize olan Tip 1 Diyabet, hastaya dışarıdan insülin enjeksiyonu ya da pankreas nakli yapılmadığı sürece ölümcüldür. Pankreas nakli ile karşılaştırıldığında pankreas adacık nakli, daha güvenilir ve ciddi bir operasyon gerektirmediğinden avantajlı bir yöntemdir. Adacık greftlerındeki fonksiyonel bozukluk ve nakil sonrasında oluşan greft reddi gibi sınırlayıcı faktörler pankreatik adacıkların genetik açıdan nakil öncesi ex vivo manipulasyon gerekliliğini doğurmuştur.Bu nedenlerden dolayı pankreatik adacıklara adenovirus aracılı TRAIL geni aktarımını içeren yeni gen tedavi yaklaşımı test edilerek bu yöntemin STZ ile indüklenen Tip 1 Diyabetik sıçanları otoreaktif T-hücre saldırısından koruyup korumadığı araştırıldı. Bu kapsamda genetik olarak değiştirilmiş sıçan pankreatik adacıkları, STZ ile indüklenmiş diyabetik sıçanların böbrek kapsülü altına nakledildiDiyabet tablosu adacık nakli sonrasında 90 gün süresince takip edildi. Ad5hTRAIL ile enfekte edilmiş adacıkları taşıyan sıçanlar, AdCMVLacZ ile enfekte edilmiş ya da enfekte edilmemiş adacıkların nakledildiği diyabetik sıçanlar ile karşılaştırıldığında, Ad5hTRAIL grubunun daha uzun normoglisemi sağladığı görüldü. AdCMVLacZ ile enfekte edilmiş ya da enfekte edilmemiş adacıkların nakledildiği sıçanlarda şiddetli insülitis gözlenirken, Ad5hTRAIL ile transfeksiyona uğratılan adacıkları taşıyan hayvanlarda insülitis düzeyi daha az bulundu. Sonuç olarak, pankreatik adacıklarda aşırı TRAIL geni sentezi allograft sağkalım süresini ve fonksiyonunu artırarak STZ indüklü diyabetik sıçanlarda terapötik etki sağlamıştır.

Meme ve/veya over kanserli hastalarda BRCA1 ve BRCA2 genlerinde ilk defa belirlenmiş olan değişimlerin popülasyon taraması.

BRCA1 ve/veya BRCA2 genlerinin kalıtsal mutasyonlarını taşıyan bireylerin meme ve over kanserleriyle birlikte prostat, kolon, serviks gibi diğer organ kanserlerine de yatkınlığa sahip oldukları bilinmektedir. Daha önce anabilim dalımızda yapılan bir araştırmada yüksek risk grubu 75 meme ya da over kanserli bireyde BRCA1 ve BRCA2'nin tüm kodlayıcı eksonlarında mutasyon analizi DGGE yöntemi ile yapılmıştır. Her iki gende yanlış anlamlı mutasyonlar, polimorfizmler ve intronik bölge değişimlerinin yanı sıra BRCA1 geninde H513L, H816P, S1577Y değişimleri, BRCA2'de S326R, G258P, E2903K ve N2742S değişimleri olmak üzere biyolojik açıdan tam olarak önemi bilinmeyen yedi tane ilk defa görülen mutasyon saptanmıştır. İlk defa tanımlanan bu değişimlerin polimorfizm veya işleve yönelik mutasyon olup olmadığının araştırılması gerektiğinden bu çalışmada, ailesinde herhangi bir kanser öyküsü bulunmayan ve polimorfizm amaçlı araştırmalarda kullanılmış olup saklanan 150 sağlıklı bireyden oluşan kontrol grubu DNA'ları kullanılmıştır. Önce bu DNA'ların PCR yöntemiyle amplifikasyonları yapılmış daha sonra DHPLC yöntemiyle tüm değişiklik görülen eksonları taranmış, değişik piklerin görüldüğü örnekler dizi analizine alınmıştır. Yapılan analizlerde her iki gendeki 7 değişimin 150 kontrolün hiçbirinde bulunmadığı görülmüştür. Bunun sonucunda, önceki araştırmada bulunmuş bu mutasyonların Türk toplumunda meme ve over kanseri için yeni bir hastalık yapıcı mutasyon olabileceği varsayılmaktadırYapılan bu araştırma sonucunda hasta bireylere hekimi ile birlikte mutasyon için bilgi ve genetik danışma verilmesi, daha sonra ailedeki erkek/kadın yüksek risk grubundaki bireylerin patojenik mutasyon taşıyıcısı olup olmadıklarının belirlenmesi, alınabilecek önlemler açısından önemlidir. Böylece hasta ya da incelenecek taşıyıcı bireylere yönelik genetik danışma verilebilmesi, dolayısıyla da hastalığın önlenmesine katkı sağlanabilmesi planlanmıştır. Ayrıca bu bulgular, dünyada ilk defa görülen mutasyonlar ile literatüre ve daha sonraki çalışmalara ışık tutması açısından katkı sağlayacaktır

Pediatrik obez olgularda mitokondriyal ATPaz Subünite 6 ve Sitokrom B genlerinde SNP (Tek Nükleotid Polimorfizm) analizi

Sağlığı bozacak şekilde yağ dokularında anormal ya da aşırı miktarda yağ birikmesi olarak tanımlanan obezite, dünyada prevalansı artarak epidemik bir hastalık halini almıştır. Ülkemizde de toplumun %30'undan fazlasını etkilemektedir. Çocuklarda da prevalansı artan obezite, 2009 yılında yapılmış bir çalışmaya göre 781 çocuğun %5.9'unda görülmüştürBugüne kadar, nüklear genom tarafından kodlanan, kromozom 7q'da yer alan leptin (LEP) (MIM#164160), 1p'de leptin reseptörü (LEPR), 2p'de pro-opiomelanokortin (POMC), 18q'da melanokortin 4 reseptör (MC4-R), 20q'da melanokortin 3 reseptör (MC3-R), 5q'da prohormon konvertaz 1 (PC1), 3p'de yer alan peroksizom proliferatör aktive edici reseptör gama 2 (PPAR) genleri obezite ile ilişkilendirilmiştir. Ayrıca, mitokondrinin enerji üretimi sürecindeki önemli fonksiyonları dolayısıyla, mitokondriyal genomdaki varyasyonlar da, başta obezite olmak üzere enerji ile ilişkili hastalıklar açısından değerlendirilmektedir. Mitokondriyal genomda yer alan ve oldukça polimorfik olan MTATP6 ve MTCYB genlerinde obez olgularda birçok polimorfizm saptanmıştır. MTCYB geninde saptanan bir varyant Japon obez olgular için önem kazanırken, İtalyan obez olguların yalnızca %0.6'sında saptanmıştır. Bulgulardaki farklılıklardan dolayı, mitokondriyal genom varyasyonlarının bireylerin etnik kökenine, yaşadığı coğrafya ve iklim koşullarına göre değişim göstermesi önem kazanmaktadırÇalışmamızda, pediatrik obez olgularda MTATP6 ve MTCYB genlerinin SNP profilini saptayarak, genotip-fenotip ilişkisinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışma grubumuzda yer alan 100 obez ve 100 kontrol olgunun MTATP6 ve MTCYB gen bölgelerinin dizi analizi sonucu, obez olgularda MTATP6 geninde 7 nonsinonim, 13 sinonim, MTCYB geninde 13 nonsinonim, 13 sinonim varyasyon belirlenirken; kontrol olguların MTATP6 geninde 6 nonsinonim, 7 sinonim, MTCYB geninde 9 nonsinomim, 9 sinonim varyasyon saptanmıştır. Obez olguların MTATP6 geninde saptanan 7, MTCYB geninde saptanan 5 varyasyon yeni varyasyonlar olarak belirlenmiştir. Obez olgularda saptanan sinonim, m.8614 T>C ve m.8994 G>A varyasyonları obez olgularda kontrollere göre anlamlı olarak (p<0.05) fazla saptanırken, MTCYB geninde saptanan varyasyonlarda obez ve kontrol olgular arasında anlamlı bir fark bulunmamıştırÇalışmamız, ülkemizde, MTCYB ve MTATP6 genlerinin SNP profilini ?pediatrik obez olgularda? değerlendirerek, obezite ile ilişkisini araştıran bir çalışma olması açısından önem kazanmaktadır. Pediatrik obez olguların yanında, yetişkin ve yaşlı obez bireylerde de mitokondriyal SNP profilinin değerlendirilmesi, toplumumuzda obezitenin genetik veri tabanının oluşmasına katkı sağlayacaktır.

Borderline yüzey epitel over tümörlerinde mitokondriyal mikrosatellit profilinin değerlendirilmesi

Kanser, birçok genetik değişimlerin birikimi sonucunda oluşan bir hastalıktır. Bu genetik değişimlerin başında proto-onkogen, ve/veya tümör baskılayıcı genlerdeki mutasyonlar, heterozigosite kaybı (LOH) ya da mikrosatellit kararsızlığını (MSI) etkileyen faktörler gelmektedir. Bu genetik değişimler sonucunda, hem nüklear hem de mitokondriyal genomda genomik instabilite (GI) oluşmaktadır. Genomik instabilitenin en iyi göstergesi ise mikrosatellit kararsızlığıdır.Gelişmiş ülkelerde over kanseri, kadınlarda ölüme sebebiyet veren kanserler arasında beşinci sırada yer almaktadır. Over kanserine erken evrede tanı konması oldukça güçtür. Bu nedenle çoğu hastaya (%90) hastalığın ileri evresinde tanı konmakta ve beş yıllık yaşam sürelerinin %30' dan daha az olduğu belirtilmektedir.Borderline over tümörleri, over neoplazilerinin %10-15' ini oluşturmaktadır. Düşük potansiyelli malign tümörler (LMP) olarak da adlandırılan bu grup, histopatolojik ve biyolojik özellikleri bakımından benign ve malign tümörler arasında geçiş özelliği göstermektedir. Bu nedenle epitel over tümörlerinin patogenezinin aydınlatılması açısından önem taşımaktadır.Projemizin amacı LCM (lazer mikrodiseksiyon) sonucunda toplanan spesifik borderline yüzey epitel over tümör dokularında, jinekolojik kanserlerde değişimin sık gözlendiği D-loop bölgesinin 303, 514, 16184 ve 12S rRNA bölgesinde 956 nükleotit pozisyonlarındaki (np.) mikrosatellit bölgelerinde meydana gelen özgün değişimleri saptamaktır. Çalışmamızda seröz ya da müsinöz borderline tümör tanısı almış, 16 olgunun spesifik tümör ve normal dokusu ile spesifik 8 tümör ve 1 normal dokuda ilgili bölgelere yönelik dizi analizi gerçekleştirilmiştir. Seröz borderline tümör grubundaki olguların %65' inde D-loop 303 bölgesinde [m.309_310insC(8), m.309_310insCC(1)], %32' sinde 514 bölgesinde [m.523_524insCA(6)], %14' ünde 12S rRNA geni 956 nükleotit pozisyonunda [m.961delTinsC(1)] mutasyonlar saptanmıştır. Müsinöz borderline tümör grubundaki olguların ise, %67' sinin D-loop 303 bölgesinde [m.309_310insC(15), m.309_310insCC(2), m.309_310insCCCC(1)], %37' sinin 514 bölgesinde [m.523_524insCA(8), m.522delCA(2)], %3' ünün 16184 bölgesinde [m.16189delTinsC] mutasyonları saptanmıştır. Seröz borderline olguların 16184 np. ve müsinöz borderline olguların 956 np.' da herhangi bir değişim saptanmamıştır.Bugüne kadar spesifik borderline over tümörlerinde mitokondriyal genom çalışması bulunmamaktadır. Çalışmamız sonucunda ilk kez borderline tümör tanısı almış dokuların spesifik tümör ve normal hücre populasyonlarında ilgili mikrosatellit bölgelere ait özgün değişimler ortaya konmuştur. Ayrıca elde ettiğimiz veriler, epiteliyal over tümörlerinin patogenezinde mitokondriyal genomun rolüne yönelik çalışmalara da destek sağlayacaktır.

TRAIL (TNF ile ilişkili apoptozisi aktive eden ligand) ligand ve reseptör profillerinin romatoid artrit ile ilişkisi

Romatoid Artrit (RA), kronik otoimmün inflamatuvar hastalıklar içerisinde en yaygın görülen romatizmal hastalıktır. Günümüzde halen RA' nın etiyopatogenezi açıklığa kavuşturulmamış olmasına rağmen, hastalığın gelişim sürecinde T hücrelerinin önemli bir rol aldığı bilinmektedir. Bu etkilerini makrofaj ve B hücrelerinin aktivasyonu aracılığı ile gösterirler. Merkezi ve periferal T hücrelerinin, immün yanıt esnasında oluşan aktiviteleri programlı hücre ölümü olarak bilinen apoptozis ile düzenlenmektedir. TRAIL (TNF ile ilişkili apoptozisi aktive eden ligand) ekspresyonundaki bozukluk sonucu oluşan timosit apoptozisi, otoimmün hastalıklarla sonuçlanmaktadır. Bizde burada T hücrelerinin yüzeyindeki TRAIL reseptör ve ligand kompozisyonlarını belirleyerek, RA' lı hastalarda TRAIL' in hastalığın gelişim ve ilerlemesindeki rolünün saptanması ve bunun hastalığın seyri ile ilişkisi araştırıldı. Bu sayede RA' nın patofizyolojik mekanizmasında TRAIL ve reseptörlerinin T hücrelerinin fonksiyonunu nasıl etkilediği belirlendi.Bu amaçla yapılan akış sitometrisi ile yapılan analizler sonucunda RA' lı hastalarda sağlıklı bireylerle karşılaştırıldığında, hem CD4+ hem de CD8+ T hücrelerde TRAIL ligand ve hem ölümcül (DR4/DR5) hem de dekoy reseptör (DcR1/DcR2) ekspresyonlarında belirgin şekilde artış saptandı. Bu artışlar, RA' nın klinik değerlendirmesinde, hastalığın aktivite skoru olarak kullanılan DAS28 skorlaması ile karşılaştırıldı. Burada özellikle CD8+ T hücrelerindeki, en fazla DcR1 olmak üzere DR4 ve DcR2 ekspresyonundaki artışın DAS28 ile korele olduğu saptandı.Sonuç olarak, T hücre yüzeyindeki TRAIL ligand ve reseptör ekspresyon profillerindeki farklılıklar, TRAIL' in RA patogenezinde önemli bir role sahip olabileceğine göstermiştir.

Mental retardasyonlu bireylerde ARX gen mutasyonlarının araştırılması

Mental retardasyon (MR) bireyin aynı yaş grubundaki bireylerle kıyaslandığında, zekâ ve davranış gibi özellikler yönünden adaptasyon gösterememe durumudur. Zekâ geriliğinden sorumlu genler arasında FMR1'den sonra gelen diğer bir gen, ARX genidir. Hem sendromik hem de nonsendromik MR olgularında ARX geni mutasyonları görülmektedir. En sık görülen mutasyonlar alanin amino asidi sayısının artmasına neden olan c.334ins(GCG)7 ve c.428_451dup mutasyonlardır. Mental retardasyonun yanı sıra bazı merkezi sinir sistemi ve ürogenital sistem hastalıklarında da ARX geni mutasyonları bildirilmiştir.Bu çalışmada FXS/MR ön tanısı ile Akdeniz Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalına gönderilen, FMR1 geni CGG tekrarları açısından normal bulunan, yaşları 1 ile 18 arasındaki 125 erkek pediatrik olguda periferal kandan DNA izolasyonunu takiben, PZR yöntemi ile en sık görülen c.334ins(GCG)7 ve c.428_451dup mutasyonlarının bulunduğu ARX geni ekzon-2 bölgesi çoğaltıldı. PZR ürünleri, yüksek çözünürlüklü agaroz jel eletroforezinde markıra karşılık yürütüldü. 10 hasta örneğine DNA dizileme analizi yapılarak, hedef bölgenin doğruluğu ve genomik değişimler incelendi.Araştırmanın sonucunda, klinik olarak FXS/MR ön tanısı almış, yaşları 1 ile18 arasında olan 125 erkek çocukta MR'ye sebep olan ve en sık görülen c.334ins(GCG)7 ve c.428_451dup mutasyonları tanımlanmamıştır. ARX geni ekzon-2 nokta mutasyonları ve tek nükleotit polimorfizmleri de DNA sekansı sonucunda saptanamamıştır. Sonuç olarak, en sık görülen ARX geni mutasyonlarının, Antalya ve çevresindeki mental retardasyonlu erkek bireylerde, MR etiyopatogenezinde sorumlu olmadığını söyleyebiliriz. Bununla beraber daha sağlıklı bir populasyon için gerçekçi bir genetik danışmanlık vermek üzere mental retardasyondan sorumlu ARX geni hot spot bölge mutasyonları dışlandıktan sonra tüm ARX genine DNA sekansı yapılması gerektiği düşüncesindeyiz.

Elektroforetik hareketlilik kayma yöntemi ile transkripsiyon faktör-promotör etkileşiminin belirlenmesi

DNA'da var olan bilginin kullanımı ve düzenlenmesi proteinler ile ilişki içerisindedir. DNA'ya bağlanan proteinler organizmada transkripsiyon, paketlenme, DNA tıpkı yapım (replikasyon) ve DNA onarımı gibi süreçlerin her basamağında önemli role sahiptir. Protein-DNA arasında kurulan bağın doğasını anlamak, genetik işleyişi çözmek açısından büyük öneme sahiptir.DNA-protein etkileşiminin tanımlanmasında DNaseI footprinting, nitroselüloz filtreleme, ChIP yöntemleri uygulanmaktadır. Elektroforetik hareketlilik kayma yöntemi (Electrophoretic mobility shift assay/EMSA) protein-nükleik asit etkileşimlerinin belirlenmesinde kullanılan hızlı ve duyarlı bir yöntemdir. EMSA radyoaktif temelli bir yöntem olmakla birlikte, radyoaktif olmayan işaretleme yöntemleriyle de kullanılabilmektedir.Tez çalışmasında, DNA-protein ilişkisinin tanımlanmasında sıklıkla kullanılan bir yöntem olan EMSA'yı laboratuvar koşullarımızda radyoaktif olmayan işaretleme ile optimize etmeyi amaçladık. Wnt5b, Fzd4, Fzd5 ve Fzd7 genleri çalışmamızda model olarak kullanıldı. Bu genlere ait promotör bölgelerine bağlanan transkripsiyon faktörleri biyoinformatik yöntemlerle belirlendi. Dört gene de, ortak bağlandığı hipopetik olarak gösterilen üç transkripsiyon faktörü ile çalışıldı. Bunlar; ?genomatix genom çözümleme yazılımı? kullanılarak belirlenen Sp1, Egr-1, KLFS transkripsiyon faktörleridir.Yapılan çalışmalar sonrasında radyoaktif olmayan EMSA yöntemi, laboratuvar koşullarında optimize edilmiştir. EMSA'nın ileriki çalışmalar için bir araç olarak kullanılması planlanmaktadır.Anahtar Sözcük: EMSA, protein-DNA etkileşimi, Sp1 transkripsiyon faktörü

Nöroblastom olgularında edinsel PHOX2B mutasyonlarının saptanması ve tümör davranışı ile birlikteliğinin araştırılması

Nöroblastom (NB) genellikle sporadik olarak ortaya çıkan yaygın bir çocukluk çağı tümörüdür. Klinik yönden son derece heterojen özellikler gösteren bu tümörlerde bir dizi edinsel genetik değişiklikler tanımlanmıştır. Günümüze kadar yapılan çalışmalarda NB patogenezinde rol oynadığı bilinen tek gen MYCN onkogenidir. Sempatik sinir sisteminin gelişiminde rol oynayan genlerden biri olan homeobox transkripsiyon faktörü PHOX2B'dir. Konjenital Santral Hipoventilasyon Sendromu (CCHS) etkenlerinden birinin PHOX2B geni mutasyonu olduğu saptanmıştır. PHOX2B mutasyonu taşıyan CCHS tanılı kişilerde NB oluşumunun gözlenmesi, PHOX2B geninde meydana gelen mutasyon ya da mutasyonların NB oluşumunda etkili olabileceğini düşündürmektedir. Çalışmamızda, edinsel PHOX2B mutasyonlarının saptanması bununla birlikte tümör davranışı ile PHOX2B mutasyonları arasındaki ilişkinin belirlenmesi amaçlanmıştır. PHOX2B geninin tüm ekzonlarının dizi analizi 114 NB, 7 ganglionöroblastom ve 7 ganglionörom tümör örneğinde yapılmıştır. Mutasyon analizi sonrasında bir NB olgusunda daha önce saptanmayan ve amino asit değişimine neden olan c.96G>A (D32N) nükleotid değişimi tanımlanmıştır. Ayrıca, 3 numaralı ekzonda polialanin kodlayan dizide 18 (c.1101_1118het-del18) ve 39 nükleotidlik (c.1098_1136het-del39) delesyonlar NB ve ganglionörom olgularında saptanmıştır. İki farklı tek nükleotid değişimi (c.552C>T, c.762A>C) 5 farklı NB tümör örneğinde gözlenmiştir. PHOX2B mutasyonları NB olgularında nadir bir şekilde ve histolojik olarak olgun tümör fenotipinde gözlenmektedir. Saptanan mutasyonların anlamlı prognostik etkisi yoktur. Polialanin bölgesinde meydana gelen delesyonlar PHOX2B proteinin üç boyutlu yapısında değişime neden olarak fonksiyonu etkilemesi sonucu NB oluşabilir.

Wnt gen ekspresyon düzeyinin apoptotik uyarı verilmiş hücrelerde araştırılması

Birçok çalışma Wnt sinyal yolağının programlanmış hücre ölümünü (apoptoz) çeşitli mekanizmalar üzerinden regüle ettiğini göstermektedir. Apoptotik uyarı verilmiş bazı hücre hatlarında `PCR Array' yöntemi ile yapılan çalışmalarda Wnt sinyal yolağında yer alan birçok genin ekspresyon düzeylerinde değişiklikler gözlenmiştir (yayınlanmamış veri).Bu çalışmalardan yola çıkılarak, Wnt1,Wnt4,Wnt5a,Wnt7a,Wnt7b, Wnt8a ve Wnt10a genleri tez çalışmamız için seçildi. Bu genlerin apoptotik uyarı altında ki ekspresyon seviyelerinin belirlenmesi hedeflendi. Bu amaçla, ekspresyon seviyesindeki değişikliklerin belirlenmesinde, İkili Lusiferaz Bildirici Deneyi (Dual Luciferase Reporter Assay), hücrelerin apoptotik süreçlerinin incelenmesinde (apoptotik uyarının ölçülmesinde) ise Kaspaz 3 aktivitesi ölçümü kullanıldı. Seçilen genlerden sadece Wnt7b, Wnt8a ve Wnt10a promotör dizileri bildirici vektörlere klonlandı. Bu vektörler Kelly hücre hattına transfekte edildi ve transfekte hücrelerde apoptoz tetiklendi. Apoptotik uyarının ardından bildirici vektörlerin lüsiferaz ölçümleri yapılarak veriler toplandı.Yapılan deneylerde, apoptozun tetiklendiği transfekte hücrelerde Wnt7b, Wnt8a ve Wnt10a genlerinin promotörlerinde normale göre 1,5 katlık bir artış izlendi.

G protein sinyal düzenleyici 4 geninin şizofreni ile ilişkisi

Amaç ve hipotez: RGS4 geni, yapılan çeşitli ilişkilendirme ve linkaj analizi çalışmaları sonucunda, şizofreniyle ilişkisi olabileceği düşünülen genlerden birisidir. Bu çalışmanın amacı, RGS4 geninin SNP' lerinden dört tanesinin [SNP1(rs10917670), SNP4(rs951436), SNP7(rs951439), SNP18(rs2661319)] genotiplerinin belirlenmesi ve saptanan genotiplerin şizofreni hastalığı ile ilişkisinin incelenmesidir.Yöntem: Çalışmaya katılan bireylerden alınan iki cc periferik kandan izole edilen DNA örnekleri, spesifik primerler kullanılarak PCR ile çoğaltıldı. PCR ürünleri DNA dizi analizine gönderildi. Analiz sonuçları klinik bulgularla beraber değerlendirildi.Bulgular: 52 kontrol ve 100 hasta ile çalışıldı. Genotipler için yapılan x2 testi sonucunda p değerleri SNP1' de 0.12, SNP4' te 0.73, SNP7' de 0.10, SNP18' de 0.14 bulunmuştur (p>0.05). Alleller için p değerleri; SNP1 için 0.057, SNP4 için 0.56, SNP7 için 0.06, SNP18 için 0.066 olarak hesaplanmıştır (p>0.05).Sonuç: Çalışmamızda, polimorfik bölgelerdeki değişik allel ve genotiplerin şizofreni varlığıyla arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki bulunamamıştır.Anahtar Sözcükler: Şizofreni, RGS4, SNP, aday gen, genotip

Epilepsili ve korpus kallosum anomalili çocuklarda ilişkili olabilecek genlerin araştırılması

Korpus Kallosum (KK) birçok duyu ve motor fonksiyonlarında önemli rol oynar. Üç boyutlu görebilmede, görsel bilgilerin ayrımını yapabilmede, sesin lokalizasyonunda, bimanuel koordinasyonda ve birçok öğrenme proseslerinde iki hemisferi birbirine bağlayarak görev yapmaktadır. KK displazileri (anomalileri) çok sayıda konjenital sendromlarla ilişkilidir. Bunun yanında metabolik hastalıkları ve sendromları da içeren bir çok serebral ve/veya eksraserebral anomalilerle birlikte de görülür. Prevelansı genel populasyonda 0.3% ve 0.7% arasında değişir. KK displazisi farklı sendromlarla birlikte kötü bir prognoza sahip olabilmektedir. KK displazili bireylerde en yaygın klinik özellik epileptik nöbetlerle birlikte zeka geriliğidir. Son dönem araştırmalarda AKT3 geninin KK anomalileri ile ilişkisi tartışma konusu olmuştur. Bu sebeple sahip olduğumuz olgu grubunda ilk olarak bu gende mutasyon taraması yapılmıştır. Hücre çoğalması ve farklılaşması, apoptoz, tümörijenez, gibi birçok biyolojik proseste yer alan AKT3 geninin tüm ekzonları ve ekzon intron sınırları PCR ile çoğaltılarak DNA dizi analizleri gerçekleştirildi. 47 hasta grubunda gerçekleştirilen bu çalışmada iki farklı nükleotid değişikliği saptandı. Bu iki nükleotid değişikliğinden biri ekzon içerisinde olup amino asit değişikliğine neden olmamakta (sessiz mutasyon), diğeri de intronik bölgede olup korunmuş bölgelerin içerisine girmemektedir. Bu nedenle bu değişimlerin AKT3 proteinini yapısal ve fonksiyonel açıdan etkilediği düşünülmemektedir. Eldeki veriler yardımıyla AKT3 geninin KK'un gelişimsel bozuklukları ile ilişkili olup olmadığı tartışmasına olmadığı yönünde katkı sağlanmıştır.

Multiple myeloma hasta lenfositlerinde ölümcül ligand sentezinin önemi

En sık rastlanılan ikinci hematolojik kanser olan Multiple Myeloma (MM), kanser kaynaklı ölümlerin %2'sinden sorumludur. Pek çok kanser olgusunda olduğu gibi MM hastalarında da progresif (ilerleyici) immün yetmezlik söz konusudur. Sağlıklı bir bağışıklık sistemi, tümör hücrelerine karşı bir gözetim mekanizması geliştirerek kanserleşmeyi engelleyebilir. Bağışıklık sisteminin bu amaç için kullandığı yollardan birisi, ölümcül ligand aracılı apoptoz uyarımıdır. Ölümcül ligand aracılı apoptoz uyarımının gerçekleşmesi için ölümcül ligandların hedef hücre yüzeyindeki ölüm reseptörlerine bağlanması ve ölüm reseptörlerinin de hücre içi apoptotik sinyalleşmeyi uyarması gerekir. Myeloma hücrelerinin yüzeyinde ölüm reseptörleri sentezlendiği ve bu hücrelerin in vitro ortamda ölümcül ligandlar aracılığıyla apoptoza yönlendirilebildiği bilinmektedir. Buna rağmen MM hastalarında myeloma hücrelerinin sağ kalıp çoğalabilmesi, ortamda ölümcül ligand eksikliğinin söz konusu olabileceğini düşündürmektedir. MM hastalarına ait sitotoksik lenfositlerde sağlıklı kontrol lenfositlerine nazaran azalmış FasL ve TRAIL ekspresyonu gözleneceğine dair hipotezimizi test etmek için periferal kan örneklerini akış sitometri yöntemiyle analiz ettik. Sonuçlarımız, MM hastalarının CD3+, CD3+CD4+, CD3+CD8+ ve CD3- lenfositlerinde FasL ve TRAIL protein düzeylerinde azalmayı işaret etmekte iken, CD4+CD25+ hücrelerde ise protein düzeyinde belirgin bir değişiklik gözlenmemiştir. Şaşırtıcı biçimde, iki grup arasında pozitif / negatif hücre oranları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunamamıştır. Sonuçlarımız, ölümcül ligand eksprese eden lenfosit sayılarında fark olmamasına karşın bu hücrelerin yüzey ligand sentez seviyelerinde azalma olduğunu göstermiştir.

Fasioskapulohumeral musküler distrofili olgularda 4q'35'te lokalize D4Z4 tekrar dizilerindeki delesyonların gösterilmesi

Otozomal dominant bir miyopati olan Fasioskapulohumeral Musküler Distrofi (FSHD), en sık karşılaşılan üçüncü kas hastalığı olup; yüz, omuz ve üst kol kaslarındaki progresif kas güçsüzlüğü ile karakterizedir. FSHD hastalığına, 4q35 bölgesindeki D4Z4 tekrarlarındaki delesyonlar sebep olmaktadır. Otozomal dominant kalıtım gösteren bu hastalıkta, FSHD hastalarının %95'inden fazlasında, normal bireylerde 11 ila 100 tekrar içeren D4Z4 tekrar dizileri, 1 ile 11 tekrar içermektedir.Bu çalışmada Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi Nöroloji Anabilim Dalı'nda klinik açıdan FSHD ön tanısı almış 14 olgu (5'i kadın, 9'u erkek) ele alındı. Yaş ortalaması 39 olan bu olguların periferal kanlarından tuzla çöktürme metodu ile DNA izolasyonu yapıldı. 4 numaralı kromozomun q35 lokusunda yer alan D4Z4 tekrar dizilerindeki delesyonu gösterebilmek için Southern blot yöntemi kullanıldı. Aynı zamanda klinik olarak normal bireylerden elde edilen 3 DNA örneği de kontrol olarak çalışıldı. Kontrol grubundaki D4Z4 tekrarları, normal sınırlar içinde bulunurken (11 tekrardan fazla), 14 FSHD olgunun tekrar sayısının, klinik göstergeyle paralel olarak normal sınırların altında (11 tekrardan az ) olduğu belirlendi.Elde ettiğimiz sonuçlara göre, Southern blot yöntemi hastalıkla ilişkili 4 numaralı kromozom üzerindeki D4Z4 tekrarlarındaki delesyonların belirlenmesi için uygun bir yöntem olarak gözlenmiştir. Klinik bulguyu desteklemesi, hastalıkta kesin tanıyı sağlaması ve genetik danışma açısından da büyük önem taşımasından dolayı bu yöntemin rutine uygulanması halinde fayda sağlayacağı düşünülmektedir.Anahtar Kelimeler: FSHD, D4Z4 tekrarları, Southern blot, 4 numaralı kromozom

Myasthenia gravis'li hastaların timus dokularında traıl ligand ve reseptörlerinin ve antiapoptotik nfkb molekülünün ekspresyon profillerinin araştırılması

Myasthenia Gravis (MG), farklı timus anomalilerinin eşlik ettiği, heterojen yapıda bir nöromüsküler hastalıktır. MG hastalarının yaklaşık %40-70'inde timusun foliküler hiperplazisi, %10-15'inde ise timoma gözlenir. Timusta özellikle timositlerin negatif seçilimindeki olası rolü araştırılan TNF süper ailesi üyelerinden biri, TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand'tır (TRAIL). Bu konudaki çalışmalar, TRAIL'ın bu süreçte regülatör rol üstleniyor olabileceğine işaret etmektedir, ancak TRAIL'ın MG gelişimindeki olası rolü henüz tam olarak açığa çıkarılamamıştır. TRAIL'ın farklı dokularda, ve hastalıkların farklı gelişim aşamalarında üstlendiği fonksiyonların gerçekleşebilmesinde, hem kendisinin hem de reseptörlerinin ekspresyon seviyelerindeki değişimlerin önemli olduğu bilinmektedir. Buradan yola çıkarak, çalışmamızda, timik hiperplazili 22 ve timomalı 5 MG hastasına ait timus dokularında, ve 10 normal timus dokusunda TRAIL ligand ve reseptörlerinin ekspresyon düzeyleri, ve TRAIL'ın apoptotik etkisini bloke edebildiği bilinen antiapoptotik NFkB molekülünün aktivasyon düzeyleri araştırıldı. Bunun yanında, her üç doku tipindeki apoptotik hücre oranları belirlendi ve TRAIL ekspresyon oranları ile korelasyonları araştırıldı. Sonuçlarımız, timoma dokusunda DR4, DR5 ve DcR2 reseptörlerinin, timik hiperplazi dokusunda ise DR5 reseptörünün sentez seviyelerinin normal timus dokusuna oranla anlamlı oranda yüksek olduğunu göstermiştir. Timik hiperplazi, timoma ve normal timus dokuları arasında TRAIL ekspresyonu açısından ise anlamlı farklılık gözlenmemiştir. Bunun yanında, anomalili ya da normal timus dokusunda NFkB'nin aktif formuna rastlanmamıştır. Bulgularımız, TRAIL'ın normal timustaki ve MG'de gözlenen anomalili timus dokularındaki muhtemel rolüne yönelik olarak, ve TRAIL aracılı timektominin uygulanabilirliği açısından değerlendirildi. Anahtar Kelimeler: TRAIL, Myasthenia Gravis, NFkB, Timus, Timik Hiperlazi, Timoma

Trail'ın pankreatik beta hücreleri üzerindeki proliferatif etkisinin araştırılması

Hem Tip 1 hem de Tip 2 Diyabet'te, insülin üreten pankreatik beta hücre kitlesinin giderek azaldığı görülür. Bu nedenle, fonksiyonel beta hücre kitlesini artırmaya yönelik yeni tedavi yaklaşımlarının her iki tip diyabet için de fayda sağlayacağı düşünülmektedir. Birçok kanser hücresinde apoptotik etkisi olduğu gösterilmiş olan TRAIL'ın (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand), sağlıklı bazı hücrelerde, örneğin vasküler düz kas hücrelerinde ve vasküler endotel hücrelerde proliferasyonu tetiklediği gözlenmiştir; pankreatik beta hücrelerinde ise sitokin aracılı hücre hasarına karşı koruma sağladığı düşünülmektedir. Bu bulgulardan yola çıkarak, TRAIL'ın pankreatik beta hücreleri üzerindeki biyolojik etkisini tanımlamayı ve olası proliferatif etkisini göstermeyi hedefledik. Çalışmamızda sıçan pankreatik adacıkları ve fare insulinoma hücre hattı (Min6) kullanıldı. Pankreatik adacıklar, Wistar türü sıçanlardan izole edildi ve enzimatik yolla parçalanarak primer hücre kültürü kuruldu. Adacık hücre kültürünün büyük çoğunluğunu beta hücreleri oluştururken, diğer kısmını alfa hücreleri, fibroblastlar ve diğer hücre tipleri oluşturmaktaydı. Kültürdeki hücrelere artan dozlarda (0, 1, 10 ng/ml) çözülebilir TRAIL (sTRAIL) uygulanmasının, hücre canlılığında azalmaya neden olmadığı gözlendi. Aksine, sTRAIL uygulaması primer pankreatik beta hücrelerinde proliferasyonu indükledi. Min6 beta hücre hattı kullanılarak yapılan sTRAIL uygulamaları yine hücrelerde proliferasyonu artırıcı etki ile sonuçlanırken, kontrol olarak kullanılan A549 akciğer kanser hücre hattında güçlü apoptotik etki gözlendi. Min6 hücrelerinde adenoviral vektörler aracılığıyla TRAIL gen aktarımı sonrasında, hücre yüzeyinde TRAIL sentezinin artışını takiben proliferasyon gözlenirken, A549 hücreleri aynı uygulama sonrasında apoptoza uğradı. Western Blot sonuçları, TRAIL'ın beta hücrelerindeki proliferasyon tetikleyici etkisini, ERK1/2, p38 ve Akt yolakları üzerinden gerçekleştirdiğini düşündürmektedir. Elde edilen bu sonuçlar, TRAIL'in, hem sıçan primer adacık hücrelerinde hem de fare pankreatik beta hücre hattında apoptoza neden olmadığını göstermekte, bunun yanında TRAIL'ın beta hücreleri üzerindeki proliferatif etkisine işaret etmektedir. Sonuç olarak bulgularımızın TRAIL molekülünün beta hücreleri üzerindeki biyolojik etkisinin anlaşılması yönünde literatüre katkı sağlayacağını, bunun yanında yapılacak ileri çalışmalarla TRAIL'ın beta hücre kaybının önlenmesi veya telafi edilmesinde kullanılabilecek bir aday molekül olabileceğini düşünüyoruz.

Santral seröz koryoretinopati (SSR)' de KDR gen polimorfizminin değerlendirilmesi

Santral seröz koryoretinopati, gözün makula bölgesinde seröz dokuda meydana gelen idiyopatik oküler bir bozukluktur. Popülasyon insidansı erkeklerde kadınlara oranla 6 kat fazladır. Geçmişten günümüze yapılan çalışmalar yeni damar oluşumunun göz içi kanamalarına ve sıvı birikimlerine yol açarak görmeyi azalttığını göstermiştir. Vazküler endotelyal büyüme faktörleri (VEGF' ler) anjiogenezi indükleyerek birçok retinal hastalığa sebep olur ve damar geçirgenliğini artırarak makulada ödem oluşumuna yol açar. KDR (NM_002253) geni 4q11-12' de lokalize olur, yapısı ve hücresel mekanizmaları göz önüne alındığında, KDR gen mutasyonları santral seröz koryoretinopati dekolmanı ile ilişkilendirilmiştir. Retinal hastalıklar içinde insidansı düşük olan SSR ile KDR geni ilişkilendirilerek genetik bir çalışma yapılmamıştır. Literatürde VEGF-A' nın SSR hastalığının patofizyolojisinde rol oynadığı daha önceki çalışmalarda belirtilmiştir. Bu sebeple KDR gen sekansını SSR üzerindeki olası genetik faktörlerin etkilerini açıklayabilecek aday gen ve bölge olarak belirledik. Projemizin amacı, santral seröz koryoretinopati tanısı almış olgularda KDR genindeki mutasyonları saptayarak genotip ve fenotip ilişkisini belirlemektir. Çalışmamızda yer alan SSR tanılı 32 olgu ve 32 kontrol bireyinde KDR geninin ekzonik bölgelerine yönelik Sanger sekans yöntemi ile DNA dizi analizi gerçekleştirilmiştir. Sonuç olarak bilinen rs140825421 (p>0.05) ve rs2305948 (p>0.05) yanlış anlamlı, rs35961234 (p>0.05) ve rs77722107 (p>0.05) sinonim, rs2219471 (p=0.59) ve rs2305949 (p=0.3) intronik, rs4421048 transle olmayan bölge mutasyonu ve daha önce tanımlanmamış del_TAA yeni delesyonu (p>0,05) belirlenmiştir. Çalışmamız, SSR ilişkili KDR geni mutasyon profili ile ilgili yapılan ilk genetik çalışmadır. Bu bağlamda, VEGF-A ve KDR mRNA sekansıyla yapılacak genetik çalışmalar moleküler tanı açısından önem kazanmaktadır. Ayrıca, ilgili genlerde saptanacak olan mutasyonlar popülasyonumuza tanı ve genetik danışma açısından önemli katkı sağlayacaktır.

Kronik lenfositik lösemili olgularda MDM2 onkogeninin aktivasyonunun belirlenmesi

Bu çalışmada Kronik Lenfositik Lösemi (KLL) tanısı almış olgularda Murine double minute-2 (MDM2) genine spesifik prob seti kullanılarak Floresan In Situ Hibridizasyon (FISH) tekniğiyle MDM2 gen amplifikasyonun olup olmadığının, amplifikasyonun belirlendiği taktirde, bu amplifikasyon ile hastalığın seyri, tedavi endikasyonu ile ilişkisi ve ilaca dirençlilik arasındaki ilişkinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Akdeniz Üniversitesi Hematoloji Bilim Dalı' ında çalışmaya dahil edilen KLL tanısı almış 40 olguya ve kontrol grubu olarak da KML tanısı almış 20 olguya ait rutin kromozom analizi için gelen kemik iliği aspirasyon örneklerinden harvest edilerek elde edilen kromozom yaymalarından FISH yöntemi ile 12 numaralı kromozomda lokalize olan MDM2 gen amplifikasyonuna bakılmıştır. Ayrıca hastaların rutin FISH ve konvansiyonel sitogenetik sonuçları incelenmiştir. Çalışmadaki 40 olguda ve kontrol grubu olarak 20 KML olgusunda MDM2 gen amplifikasyonu belirlenmezken, 12 hastada (%30) trizomi 12 gözlenmiştir. Ayrıca çalışma grubundaki 40 KLL hastasının rutin FISH analizinde; 16' sında (% 40) 17p13 delesyonu, 13 hastada (% 32,5) 13q14 delesyonu, 6 hastada (% 15) 11q22.3 delesyonu ve 1 hastada (% 2,5) 6q23 delesyonu saptanmıştır. KLL olgularında FISH yöntemi ile MDM2 gen amplifikasyonunun gözlenmemesi nedeni ile bu olgularda mRNA düzeyinde overekspresyon olup olmadığına bakılması gerektiği sonucuna varılmıştır. Ayrıca gen amplifikasyonu olmayan özellikle ileri evredeki olgularda MDM2 geninin 309. pozisyonundaki G/G genotipine sahip olup olmadıklarına da bakılması gerektiği düşüncesindeyiz. Hastaların 27' si (% 67,5) erken evre olup tedavi endikasyonu olmayan hastalardır. Bu hastaların takiplerinde tedavi endikasyonu gelişmesi durumunda tekrar MDM2 gen amplifikasyonuna ve ekspresyonuna bakılması MDM2 - KLL ilişkisini açıklamaya daha yararlı olacaktır.

TWIST1 transkripsiyon faktörünün aktivasyon mekanizmasının ve doğal inhibitörlerinin araştırılması

Epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT), kanser metastazına neden olan temel mekanizmadır. Bu süreçte, ekstraselüler matriks (ECM) proteinlerinin ya degradasyonu ya da ekspresyonlarının baskılanması tümör hücrelerinin hareketi ile sonuçlanır. EMT'de tümör hücrelerinin invazyon oranına bağlı olarak kanserle ilişkili ölüm oranları artar. Bu ölümlerin büyük bir çoğunluğu (yaklaşık olarak % 90) kanser metastazı ile ilişkilidir. Son zamanlarda tanımlanan ve bazik Heliks-Loop-Heliks (b-HLH) yapısal özelliği gösteren bir transkripsiyon faktörü olan TWIST1, ECM ana elemanlarından olan E-Kaderin transkripsiyonunu baskılaması nedeniyle EMT ile ilişkilendirilmiştir. TWIST1 ekspresyon artışına bağlı olarak EMT ve kanser metastazı artmaktadır. TWIST1'in EMT süreci ile ilişkisini bilmemize rağmen aktivasyon mekanizması hakkındaki bilgilerimiz sınırlıdır. TWIST1'in protein dizisini incelediğimizde RxRxxS/T konsensus motifi yapısında 3 adet AKT bağlanma bölgesini belirledik. İnsan TWIST1 yapısında bunlar Ser42, Tre121 ve Ser123 amino asitleridir. Çalışmamızda, doku özgü büyüme faktörleri ile aktive edilen AKT'nin belirlenen amino asitlerden TWIST1'i fosforile ettiğini gösterdik. Bu amino asit rezidularının anlamlılığını belirlemek için ilgili amino asitleri fosforile olamayan Alanin ve fosforilasyonu taklit eden negatif yüklü Gutamik asid formlarına çevirdik. Alanin mutantları TWIST1'i inaktive ederken Glutamik asid mutantları ise aktive etmektedir. Elde ettiğimiz sonuçlara göre; TWIST1, AKT tarafından fosforile edilmektedir ve bu fosforilasyon aktivasyonu için gereklidir. Öngörüldüğü gibi aktive olan TWIST1 E-Kaderin transkripsiyonunu baskılarken N-Kaderin ve Vimentin ekspresyonlarını ise indükler. Sonuç olarak, TWIST1 aktivasyonu AKT tarafından fosforilasyona ihtiyaç duyar ve bu durum EMT regülasyonu için gereklidir.

Mesane kanserlerinde PTEN ekspresyonunun western-blot yöntemi ile gösterilmesi

ÖZET Bu çalışmada mesane kanseri tanısı almış 31 hastada mesane tümör ve kontrol materyalinde Western-blot yöntemi ile PTEN proteininin ekspresyonu araştırılmıştır. 1 Tümör baskılayıcı PTEN (Phosphatase and Tensin homologue deleted on chromosome ten) fosfoinozitol 3'-kinaz sinyal yolu üzerine etki etmektedir. Bu apoptotik sinyal yolu tümör oluşumunun engellenmesi için çok önemlidir. Bu nedenle, PTEN aktivitesinin kaybı hücre transformasyonu ve neoplastik büyüme ile doğrudan ilişkilidir. Bununla beraber PTEN genindeki mutasyonlar mesane kanseri de dahil olmak üzere prostat, karaciğer, tiroid kanseri gibi çok çeşitli kanser tiplerinde belirlenmiştir. Bu güne kadar yapılan çalışmalar ile yalnızca hücre hatlarında PTEN protein ekspresyonu gösterilmiştir. Bu çalışmada ise mesane kanseri tanısı alan 31 olgudan cerrahi müdahale ile çıkarılan taze tümör dokusunda Western-blot yöntemi ile PTEN ekspresyonunun düzeyi araştırılmıştır. İncelenen 31 tümör materyalinin 4 tanesinde normal mesane dokusu ile karşılaştırıldığında PTEN ekspresyonunun Önemli oranda azaldığı belirlendi. PTEN ekspresyon kaybının mesane kanseri gelişimindeki rolü literatür bilgileri ile kıyaslanarak, tartışıldı. Anahtar kelimeler: Mesane kanseri, PTEN, Western-blot iv

Prostat kanserlerinde PTEN ekspresyonunun western blot yöntemi ile gösterilmesi

Prostat kanseri erkeklerde ölüme sebebiyet veren kanserler arasında akciğer kanserinden sonra ikinci sırayı almaktadır. Bir tümör süpressör olarak klonlanan, ürünü tirozin ve lipid fosfataz aktivitesine sahip PTEN geninde meydana gelen mutasyonlarm glioblastoma, endometrium, mesane ve prostat kanseri gibi birçok kanserin gelişiminde etken olduğu belirtilmektedir. Bu çalışmada prostat kanseri tanısı konmuş 43 BPH, 15 organa sınırlı ve 18 ileri evre prostat kanseri olmak üzere toplam 76 hastanın tümör materyallerindeki PTEN ekspresyon miktarının belirlenmesi için Western-Blot tekniği uygulanmıştır. Kontrol örnekleri ise organa sınırlı prostat kanseri olgularından radikal prostatektomi ile patolojik bulgusu olmayan bölgeden temin edilmiştir. Western-Blot tekniği sonrasında PTEN ekspresyon düzeyi dansitometrik analizler ile tespit edilmiştir. BPH ve organa sınırlı prostat kanseri olguları arasında istatiksel olarak anlamlı bir sonuç bulunamazken, ileri evre prostat kanseri olgularında PTEN ekspresyon miktarının oldukça azaldığı saptanmıştır. Sonuç olarak, Western-Blot tekniği kullanılarak PTEN ekspresyonunun belirlenmesinin prostat kanseri progresyonunun saptanmasında ve ileri evre prostat kanseri tedavisinde kullanılabilecek yeni yöntemlerin geliştirilmesine yardımcı olabileceği düşüncesindeyiz.Anahtar Kelimeler : PTEN, BPH, Prostat Kanseri, Western-Blot

İdiyopatik sirozlu hastalarda HFE gen mutasyonlarının PCR-RFLP yöntemiyle taranması

D YOPAT K S ROZLU HASTALARDA HFE GEN MUTASYONLARININ PCR-RFLP YÖNTEM YLE TARANMASISaffet ÖZTÜRKKaraciğerde görülen önemli hastalıklardan biri olan siroz, çeşitli dış ve iç etiyolojikfaktörler nedeniyle ortaya çıkmaktadır. Karaciğer sirozu anatomi, etiyoloji, aktivite, prognozve evresine göre sınıflandırılmaktadır. Çok iyi tanımlanmış etiyolojik faktörlerin dışlandığısiroz, kriptojenik (idiyopatik, sebebi bilinmeyen) siroz olarak adlandırılmakta ve sirozhastalarının % 5-10'nunu oluşturmaktadır. Karaciğerdeki demir birikimi, en sık görülen riskfaktörlerindendir. Demir metabolizmasında işe karışan birçok genetik faktör vardır. Bunlardanbirisi, HFE (hemokromatozise neden olan gen) genidir. HFE gen mutasyonları, karaciğerdemir birikimine ve dolayısıyla fonksiyon bozukluğuna neden olmaktadır.Projemizin amacı, idiyopatik siroz tanısı almış olan 16 hastada HFE genindeki C282Y,H63D ve S65C mutasyonları ile hastalık arasında ilişki olup olmadığını PCR-RFLP yöntemiile araştırmaktır. Periferik kandan DNA izolasyonunu takiben, her üç mutasyonun yer aldığıDNA bölgeleri PCR yöntemi ile amplifiye edildi. PCR ürünleri, mutasyon bölgelerine özgürestriksiyon enzimleriyle kesildi. Kesilen fragmentlerin elektroforezde yürütülmesiyle ortayaçıkan bant durumuna göre genotipler belirlendi.Onaltı kriptojenik siroz hastasının birisinde H63D mutasyonu heterozigot, birisinde isehomozigot olduğu gözlenirken, 141 sağlıklı kontrol bireyin 30'unda H63D mutasyonuheterozigot, 2'sinde ise homozigot olarak saptandı. C282Y ve S65C mutasyonları ise hemhasta hem kontrol grubunda görülmedi. Hasta ve kontrol bireylerinin genotipleri vebiyokimyasal demir parametreleri (serum demir konsantrasyonu, ferritin, toplam demirbağlama kapasitesi ve transferin doygunluğu) karşılaştırıldığında, ferritin, serum demirkonsantrasyonu ve transferin doygunluğu H63D mutasyonu açısından homozigot mutant olanbireylerde, heterozigot ve normal genotipli olanlara göre daha yüksek olduğu bulundu. HFEgen mutasyonlarının (C282Y, H63D ve S65C) idiyopatik sirozlu hastalarda siroz oluşumunaneden olan etiyolojik etmenlerden birisi olup olmadığı tartışıldı.Anahtar kelimeler: diyopatik siroz, HFE geni, PCR, RFLP.

İleri evre prostat kanseri hücre hatlarında TRAIL’a dirençlilik mekanizmalarının araştırılması

Tez Başlığı: İleri Evre Prostat Kanseri Hücre Hatlarında TRAIL'a DirençlilikMekanizmalarının AraştırılmasıYazar: Ahter Dilşad ŞANLIOĞLUÖZETAdenoviral yolla aktarılan TRAIL aracılı gen tedavi yaklaşımları, ileri evre prostatkanserlerinde apoptozisi indükleyici güçlü potansiyel terapötik yaklaşımlar olarakdeğerlendirilmektedir. Ancak bazı prostat kanser hücrelerinin TRAIL aracılı apoptozisedirençli olduğunun gözlenmesi nedeniyle, TRAIL dirençlilik mekanizmalarınınaraştırılması ve bu dirençliliği kıracak yeni yaklaşımların geliştirilmesi, TRAIL'ın ilerideetkili bir tedavi yaklaşımı olarak kliniğe kazandırılması açısından oldukça önemlidir.Bu nedenlerden dolayı çalışmamızda üç farklı ileri evre prostat kanser hücrehattında (DU145, PC3, LNCaP) TRAIL'a dirençlilikten sorumlu olabilecekmekanizmalardan olan hücre içi bazal ve TRAIL aracılığıyla indüklenen NF-kBaktivitesinin, ve TRAIL ölüm ve yalancı reseptör sentez oranlarının hücrelerde TRAILduyarlılığı ile ilişkisi araştırıldı. Bunun yanında, prostat kanserlerinde ilk kez denenenAd5hTRAIL ve AdIKKbetaKA ikili vektör sisteminin hücrelerde gözlenen TRAILdirençliliğini kırmaktaki etkinliği araştırıldı.Sonuçlarımız, TRAIL yalancı reseptör kompozisyonunun ve hücre içi NF-kBaktivitesinin prostat kanser hücrelerinde TRAIL dirençliliğine katkıda bulunan iki önemlifaktör olduğunu göstermiştir. Bunun yanında, IKKbetaKA aracılı IKK inhibe edicistratejilerin, hücrelerde TRAIL dirençliliğini kırmada, dirençlilik mekanizmasına bağımlıolmaksızın etkili olduğu görülmüştür. Araştırmamız, prostat kanser hücrelerinde TRAILyalancı reseptörlerinin sentez seviyesi ile TRAIL dirençliliği arasında anlamlı bir ilişkiaçığa çıkarmıştır. Bulgularımız, Ad5hTRAIL ve AdIKKbetaKA ikili vektör sistemi ileprostat kanser hücrelerinde TRAIL dirençliliğinin kırılabileceğini gösteren ilk çalışmaolması açısından da önemlidir. Bu bulgular ışığında, IKK inhibisyonu altında adenoviralyolla TRAIL gen aktarımı, ileri evre prostat kanserinde TRAIL'ın terapötik indeksinigenişletmede değerli bir yaklaşım olacaktır.Anahtar Kelimeler: TRAIL, prostat kanseri, gen tedavisi, NF-kB, adenoviral vektörler.

Akciğer kanserinde rekombinant adenovirüs aracılı TRAIL transferinin potansiyel terapötik etkisi

AKC ĞER KANSER NDE REKOMB NANT ADENOV RÜS ARACILITRAIL TRANSFER N N POTANS YEL TERAPÖT K ETK SÇ ĞDEM AYDIN ACARAkciğer kanseri ölüme sebebiyet veren kanserler arasında hem erkeklerdehem de kadınlarda birinci sırada yer almaktadır. Günümüzde akciğer kanserine karşıen yaygın olarak kullanılan tedavi şekilleri arasında yer alan kemoterapi veradyoterapinin tümöre karşı etkisini gösterebilmesi, p53 tümör baskılayıcı proteinininvarlığını gerektirir. Sonuç olarak, p53 proteini olmayan tümörler, hem kemoterapihem de radyoterapiye karşı dirençlilik gösterir. TRAIL gibi ölüm ligantları kanserhücrelerinde p53'den bağımsız olarak apoptozisi indükleyebilmektedir ve bu nedenlegen tedavisi için potansiyel tedavi edici ajanlar olarak düşünülmektedir. Buna karşın,akciğer tümörünü de kapsayan bazı tümörlerde TRAIL' a karşı dirençlilikgözlenmiştir. Ayrıca, TRAIL'ın dirençlilik mekanizması da anlaşılamamıştır.Şimdiye kadar kanser hücrelerinde TRAIL dirençliliği ile TRAIL reseptör sentezprofili arasında bir korelasyon gösterilememiştir. Aksine, böyle bir korelasyonun varolmadığına inanılmaktadır. Bu çalışmada ilk olarak, akciğer kanserli hastalar içinpotansiyel bir gen tedavi modeli olduğu düşünülen TRAIL'ın adenovirüs aracılığı ileverilimi test edildi. A549 akciğer kanser hücre hattının TRAIL aracılı hücre ölümünekarşı tamamen dirençli olduğu belirlendi. Ayrıca, IKK inhibisyonunu (AdIKKβKA)kapsayan bütünleyici bir gen tedavi metodu ile akciğer kanser hücreleri TRAIL' akarşı duyarlı hale getirildi. kincil olarak, akciğer kanser hücrelerinin TRAILreseptör kompozisyonu Real Time RT-PCR ve akış sitometrisi analizleri ile tespitedildi. A549 akciğer kanser hücre hattındaki TRAIL dirençliliği hücre yüzeyindekiTRAIL-R4 dekoy reseptör senteziyle ilişkilendirildi.Anahtar Kelimeler: Akciğer kanseri, adenovirüs, gen tedavi, TRAIL, IKKinhibisyonu

İleri evre prostat kanseri hücre hatlarında TRAIL'a dirençlilik mekanizmalarının araştırılması

Kronik miyeloid lösemi (KML) hastalarında sFRP1 geninin promotör bölgesinin epigenetik ve genetik değişikliklerinin incelenmesi

Hematolojik malignansilerde Wnt Sinyal iletiminin deregülasyonu ilk olarak Kronik miyeloid lösemi'de(KML) tanımlanmıştır. Wnt sinyal iletiminin antagonistleri olan sFRP'ler (Secreted Frizzled related protein), Wnt proteinlerinin aktivitesini inhibe etme yeteneğine sahiptirler. sFRP genlerinin epigenetik sessizleşmesi, canonical Wnt sinyal iletiminin sürekli aktivasyonuna neden olmaktadır.Bu çalışmada 48 kronik faz KML hastasında sFRP1 geninin promotör bölgesindeki genetik ve epigenetik değişiklikler incelenmiştir. Yapılan iki yönlü DNA dizi analizinde, bu değişikliğin nükleotid 38, 39, 40. nükleotidlerde (CAG) çerçeve delesyonu olduğu gözlenmiştir. Bu üç nükleotidlik delesyon, kodon 13 ve 14'ü etkilemektedir ve ardarda gelen alanin rezidülerini kodlamaktadır. Oluşan yeni kodon yine alanin'dir.48 kronik faz KML hastasının sFRP1 promotör metilasyon durumu incelendiğinde, bunların 1'inin tam metile, 41'inin metile olmayan, 6 'sının da hemimetile olduğu gösterildi. Her ne kadar sFRP1 promotör metilasyonu kronik faz KML'de sık gözlenmese de, hastalığın ilerleyişi ve terapiye dirençle ilişkili olduğu gözlenmiştir. 6 hemimetile hastanın 5'inde sadece parsiyel sitogenetik yanıt veya sitogenetik yanıt gözlenmezken, sFRP1 promotörü metile olmayan 41 hastanın tümünde majör veya tam sitogenetik yanıt izlenmiştir. Tam metile olan hastada, ek kromozomal anomalilerle birlikte sitogenetik ilerleme gözlenmiştir.sFRP1 promotör metilasyonu, hastalığın terapiye direnç gösteren ve genetik olarak stabil olmayan formunda terapiye dirençle ilişkilidir ve terapiye direnç gösteren hastalarda biyolojik farklılıklar yaratır. Ek olarak sFRP1 promotör metilasyonunun KML'de canonical Wnt sinyal iletiminin aktivasyonu için olası bir mekanizma olabileceği düşünülmektedir.

Hepatosellüler karsinoma hücre motilitesinde PKB/Akt/mTOR sinyal yolağının önemi

Karaciğer kanseri, bilinen kanser türleri içinde görülme sıklığı olarak beşinci, ölüm oranı olarak üçüncü sırada yer almaktadır. Oldukça agresif bir tümör olan ve karaciğer kanserlerinin %83' ünü oluşturan hepatosellüler karsinoma (HCC) karaciğer kanserleri arasında en önemli olanıdır. Çeşitli hücre tiplerinde başlıca proliferasyon, apoptoz ve otofaji yanıtlarında önemi bilinmekte olan PI3K/Akt/mTOR sinyal yolağının HCC' de görevli olduğu ve HCC gelişiminde çok önemli bir rol üstlendiği bilinmektedir. HCC hücrelerinde hücre motilitesinde PI3K sinyal yolağının önemi tam olarak bilinmemektedir.Çalışmamızda farklı aktif Akt seviyesine sahip olan üç HCC hücre hattı (Huh7, SNU449, MV) kullanılmıştır. Hücre hatlarında ECM bileşenleri varlığında PI3K'e özgül LY294002 inhibitörü kullanılarak hücre hareketliliklerine yara iyileşmesi ve/veya özel motilite/invazyon düzenekleri ile bakılmıştır. İntegrin ekspresyon profillerindeki değişiklikler RT-PCR yöntemi ile incelenmiştir.Kullanılan hücre hatlarında ECM bileşenlerinin hücre hareketliliğini arttırdığı gözlenirken LY294002' nin bu etkiyi engellediği tespit edilmiştir. Zamana ve kollajen I varlığına bağlı olarak beta4, alfa1, alfa2, alfa4 integrinlerin ekspresyon profillerinde değişikliklerin olduğu gözlenmiştir.Çalışmamızda HCC hücrelerinde kollajen I varlığında PI3K sinyal yolağının aktivasyonuna bağlı olarak integrin alfa 1 ekspresyonunda kollajen I uyarımlı hareketlilikte integrin alfa1 ekspresyonuna bağımlı etkisi olabileceği gösterilmiştir.Anahtar Kelimeler: Hepatosellüler Karsinoma, PI3K/AKT/mTOR sinyal yolağı, hücre dışı matriks (ECM), integrin