Theses supervised by Prof. Dr. Ahmet Alver
11 theses · Karadeniz Technical University, Recep Tayyip Erdoğan University
Retroperitoneal yağ dokusu denervasyonunu takiben diyetle obez yapılmış sıçanlarda leptin sentezi ve serum seviyelerinin incelenmesi
Leptin başlıca beyaz yağ dokusunda sentezlenen ve enerji dengesini düzenleyen bir hormondur. Sentezi birçok faktörün yanı sıra sempatik sinir sistemi tarafından da düzenlenir. Çalışmamızda, yüksek yağlı ve standart diyetle beslenen sıçanlarda iki taraflı retroperitoneal yağ dokusu denervasyonunun, retroperitoneal ve epididimal yağ dokusunda leptin ekspresyonuna ve serum leptin konsantrasyonuna etkilerinin incelenmesi amaçlanmıştır. Çalışmamızda, her birinde 8 adet 100-150 g ve 3-5 haftalık Sprague Dawley ırkı sıçan bulunan 4 grup oluşturuldu: I. Grup: Retroperitonel yağ dokusu iki taraflı denervasyon yapıldı ve yüksek yağlı yem ile beslendi (YD+), II. Grup: Denervasyon yapılmadı ve yüksek yağlı yem ile beslendi (YD-), III. Grup: Retroperitonel yağ dokusu iki taraflı denervasyon yapıldı ve standart yem ile beslendi (SD+), IV. Grup: Denervasyon yapılmadı ve standart yem ile beslendi (SD-) kontrol grubu olarak kabul edildi. 10 haftalık programı sonunda sıçanlardan serum ve doku numuneleri toplandı. Serum numunelerinde, glukoz, trigliserit, insülin ve leptin seviyeleri ölçüldü. Retroperitonel ve epididimal yağ dokusunda leptin mRNA seviyesi RT-PCR ile belirlendi. Yüksek yağlı diyet kullanan ve denerve edilen grupların serum leptin seviyelerinin kontrol grubuna göre yüksek olduğu belirlendi (p=0.038). Yağlı diyet denervasyon ile birlikte gen ekspresyon sonuçlarında ciddi bir değişiklik bulunmadı (p=0.31). Sonuç olarak, denerve edilmiş sıçanlarda, diyete bağlı olarak leptin ekspresyonlarında fark bulunmadığı, serum leptin seviyelerinde farklılıklar olduğu görüldü. Gözlenen değişikliklerin diyetin diğer yağ dokularına olan etkisinden kaynaklanabileceği kanaatine varıldı.
Oksidatif olarak modifiye edilmiş karbonik anhidraza karşı otoantikor oluşumunun ve bu antikorların bazı romatoid hastalıklarla ilişkisinin incelenmesi
Karbonik anhidraz (CA) geniş doku dağılımı olan bir metaloenzimdir ve bazı romatoid hastalıklarda bu enzime karşı otoantikor oluşmaktadır. Oksidatif stresin CA otoantikor oluşumu tetiklediğine dair çalışmalar bulunmaktadır. Bu çalışmada karbonik anhidrazın 4-hidroksinonenal (HNE), malondialdehit (MDA), peroksinitrit (PN) ile modifikasyonunun CA otoantikorlarının oluşumu üzerine etkisi ve romatoid artrit (RA), ankilozan spondilit (AS), Sjögren's sendromu (SjS) hastalarında bu antikorlarla oksidan-antioksidan durum arasındaki ilişkinin incelenmesi amaçlanmıştır. Bu çalışmada eritrositlerden izole edilen CA I ve CA II izoenzimleri HNE, MDA ve PN ile modifiye edilip modifikasyonlar Western Blot ile teyit edildi. Antijeniteye modifikasyonların etkilerini incelemek amacıyla Balb-c fareler bu maddelerle immünize edildi ve serumlarında otoantikor titreleri ELISA ile belirlendi. Çalışma gruplarında CA ve modifiye CA otoantikorları belirlendi. Ayrıca hastalardan elde edilen serum ve eritrositlerde MDA, HNE, 3-nitrotirozin (3-NT), süperoksit dismutaz (SOD), katalaz (CAT), glutayon peroksidaz (GSH-Px) ölçülerek hastalardaki oksidan-antioksidan durum değerlendirildi. Antikor oluşumunu ve inflamasyonu tetikleyen sitokinler tümör nekroz faktör–α (TNF-α) ve interlökin-6 (IL-6) ölçülerek otoantikorlarla arasındaki ilişki incelendi. Bireylerde PN modifiye CA I ve CA II otoantikorları kontrolle karşılaştırıldığında bütün gruplarda anlamlı fark bulundu. Saf CA ve modifiye formların otoantikor titreleri ile kontrol grupları arasında anlamlı fark görüldü (p<0.001). Farelerde modifiye formlar saf CA formuyla karşılaştırıldığında HNE ve MDA' nın antijenik özelliği azaltırken PN' nin arttırdığı belirlendi. Sonuç olarak oksidatif modifikasyonların CA izoenzimlerinin antijenik özelliklerini değiştirdiği özellikle PN ile yapılan modifikasyonların antijeniteyi arttırdığı görüldü.
Retroperitoneal yağ dokusu denervasyonunu takiben diyetle obez yapılmış sıçanlarda adiponektin gen ekspresyonu ve serum seviyelerinin incelenmesi
Adiponektin başlıca beyaz yağ dokusu hücrelerinde sentezlenen ve antidiyabetik, antiaterojenik ve antiinflamatuar etkiler gösteren bir adipokindir. Yağ dokusunun metabolik ve sekratuvar özellikleri birçok faktörün yanısıra sempatik sinir sistemi tarafından da düzenlenir. Çalışmamızda, yüksek yağlı ve standart diyetle beslenen sıçanlarda iki taraflı retroperitoneal yağ dokusu denervasyonunun, retroperitoneal ve epididimal yağ dokusunda adiponektin ekspresyonuna ve serum adiponektin konsantrasyonuna etkilerinin incelenmesi amaçlanmıştır. Çalışmamızda, her bir grupta 8 adet 100-150 g ağırlığında ve 3-5 haftalık Sprague Dawley ırkı sıçan bulunan 4 grup oluşturuldu: I. Grup: Retroperitonel yağ dokusu iki taraflı denervasyon yapıldı ve yüksek yağlı yem ile beslendi (YD+), II. Grup: Denervasyon yapılmadı ve yüksek yağlı yem ile beslendi (YD-), III. Grup: Retroperitonel yağ dokusu iki taraflı denervasyon yapıldı ve standart yem ile beslendi (SD+), IV. Grup: Denervasyon yapılmadı ve standart yem ile beslendi (SD-) ve kontrol grubu olarak kabul edildi. 10 haftalık diyet programı sonunda sıçanlardan serum ve doku numuneleri toplandı. Serum numunelerinde glukoz, trigliserit, insülin ve adiponektin seviyeleri ölçüldü. Retroperitonel ve epididimal yağ dokusunda adiponektin mRNA seviyesi RT-PCR ile belirlendi. YD+ grubun serum adiponektin seviyelerinin kontrol grubuna göre yüksek olduğu belirlendi (p=0.010). Retroperitoneal yağ dokusundaki adiponektin gen ekspresyonunun ölçümü sonucunda, YD+ grubunda adiponektin seviyesi yüksek bulundu (p=0.023). Epididimal yağ dokusu adiponektin gen ekspresyonunun ölçümü sonucunda, YD- grubunda adiponektin seviyesi daha düşük bulundu (p=0.021). Sonuç olarak, denerve edilmiş sıçanlarda, diyete bağlı olarak adiponektin ekspresyonlarında ve serum adiponektin seviyelerinde farklılıklar olduğu görüldü. İki taraflı denervasyonun ve diyetin adiponektin seviyelerine ve sentezine farklı etkileri olabileceği kanaatine varıldı.
Yüksek sukroz içerikli diyetle beslenmiş beyin kaynaklı nörotrofik faktör heterozigot farelerin yağ dokusunda oksidatif stresin incelenmesi
Sukroz içerikli gıdaların aşırı tüketiminin insülin direnci, hiperglisemi ve obezite gibi metabolik bozukluklara yol açtığı bilinmektedir. Obezitede yağ dokusundaki oksidan-antioksidan dengenin bozulmasıyla oksidatif stres (OS) artar ve adipositlerin fonksiyonu bozulur. Yağ dokularının heterojenliğinden dolayı adipokin profilleri farklıdır ve bunların fonksiyonları OS ile değişir. BDNF beyin, karaciğer, kas ve yağ dokusu gibi enerji metabolizmasıyla ilişkili dokularda sentezlenen bir nörotrofindir. BDNF, nöronlarda çeşitli yollarla OS'yi azaltır. Çalışmamızda yüksek sukroz içerikli diyetle beslenen transgenik farelerin epididimal ve subkutan yağ dokularındaki OS üzerine BDNF'nin etkisi incelendi. Standart ve yüksek sukroz içerikli diyetlerle dört ay beslenen wild tip ve BDNF (+/-) farelerden dört grup oluşturuldu. Serum 4-hidroksinonenal (4-HNE), 3-nitrotirozin (3-NT), leptin, rezistin, adiponektin, insülin ve BDNF seviyeleri ELISA yöntemiyle ölçüldü. Subkutan ve epididimal yağ dokudan elde edilen protein fraksiyonlarda SOD, CAT, GPx aktiviteleri ile MDA seviyesi ölçüldü. Bu dokularda SOD2, GPx3 ve CAT ekspresyonları SYBR Green I boyası kullanılarak RT-PCR'da belirlendi. Yüksek sukroz içerikli diyet ile beslenen transgenik farelerde serum leptin, 4-HNE ve 3-NT seviyeleri yüksek iken BDNF ve adiponektin seviyeleri düşük bulundu. Yüksek sukroz içerikli diyet ile beslenen transgenik farelerin subkutan yağ dokularında MDA seviyesi düşük bulundu. Tüm transgenik farelerin subkutan yağ dokularındaki SOD, CAT ve GPx aktiviteleri yüksek bulundu. Her iki tür diyet ile beslenen transgenik farelerin epididimal yağ dokusunda SOD2 ekspresyonları düşük bulundu. Her iki tür diyetle beslenen transgenik farelerin subkutan yağ dokularındaki CAT ekspresyonu düşük bulundu. Ancak aynı dokuda sadece standart diyetle beslenen transgenik farelerin GPx3 ekspresyonu düşük bulundu (p<0.05). Epididimal yağ dokudaki OS'ye karşı BDNF'nin koruyucu etkisinin olabileceği ancak subkutan yağ dokudaki verilerimizin bu değerlendirme için yetersiz kaldığı kanaatine varıldı.
Beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) heterozigot farelerde yüksek yağlı diyetin bazı adipokinlerin gen ekspresyonları üzerine etkisinin incelenmesi
Beyin Kaynaklı Nörotrofik Faktör (BDNF), enerji metabolizmasının merkezi kontrolünde görev alan bir nörotrofindir. BDNF ekspresyonunun az olduğu hayvanlarda hiperfaji, obezite ve diyabet görülmektedir. Yağ dokusu, salgıladığı adipokinler vasıtasıyla besin alımı, insülin direnci, inflamasyon gibi birçok fizyolojik olayda fonksiyon gösterir. Yağ kütlesinin arttığı durumlarda, adipokinlerin sentezinde değişiklikler meydana gelmekte ve bu da obeziteyle ilgili birçok komplikasyonu beraberinde getirmektedir. Periferde etkileri çok iyi bilinmeyen BDNF'nin yağ dokusunda sentezi olmakta ve reseptörü bulunmaktadır. Çalışmamızda bu proteinin standart ve yüksek yağlı diyetle beslenen farelerde yağ dokusundan adipokin sentezine etkisinin incelenmesi amaçlanmıştır. Farklı metabolik etkileri olduğundan subkutan ve viseral yağ dokularının her ikisinde de belirlenen adipokinlerin ekspresyonları araştırıldı. C57BL/6J ırkı wild tip ve BDNF (+/-) farelerden 4 grup oluşturuldu. Bu gruplar standart ve yüksek yağlı diyetle 4 ay boyunca beslendi. Beslenme periyodunun sonunda alınan serumlarda insülin, BDNF, leptin, rezistin, PAI-1 seviyeleri ELISA kitleriyle ölçüldü. Yağ dokularında ise leptin, rezistin, adiponektin ve PAI-1 gen ekspresyonlarına bakıldı. Serum leptin, insülin seviyeleri yüksek yağlı ve standart diyetle beslenen BDNF (+/-) gruplarında yüksek, adiponektin seviyeleri ise bu gruplarda düşük bulundu. Serum rezistin seviyeleri yüksek yağlı diyetle beslenen gruplarda yüksek bulundu. Epididimal yağ dokusunda leptin ve PAI-1 ekspresyonları kontrole göre yüksek, rezistin ekspresyonu ise düşük bulundu. Adiponektin ekspresyonu yüksek yağlı diyetle beslenen BDNF(+/-) grubunda düşük bulundu. Subkutan yağ dokusunda leptin ve PAI-1 ekspresyonları yüksek bulundu (p<0.05). BDNF'nin bazı adipokinlerin sentezini ve salgılanmasını düzenleyerek yağ dokusu fonksiyonunu etkileyebileceği ve obezitede koruyucu rol oynayabileceği kanaatine varıldı.
Yüksek yağlı diyetin karaciğer karbonik anhidraz aktivitesi üzerine etkisinin incelenmesi
Prokaryotlardan ökaryotlara kadar çok geniş bir dağılıma sahip olan karbonik anhidrazlar (CA, E.C.4.2.1.1, karbonat hidroliyaz), bikarbonatın (HCO3-) dehidrasyon veya (CO) karbodioksitin hidrasyonunu dönüşümlü olarak katalizleyen, aktif bölgesinde prostetik grup olarak Zn2+ içeren bir metaloenzimlerdir. Bu enzimler CO2, H+ ve HCO3-' ün hücre içi ve hücre dışındaki konsantrasyonlarının düzenlenmesi, dokularda elektrolit salınımı, kemik resorpsiyonu, tümör oluşumu ve idrar asidifikasyonu gibi birçok fizyolojik süreçte görev almaktadır. Bu tez çalışmasında yüksek yağlı diyetin de novo lipit sentezinin öncü bileşiği olan HCO3- 'ı senteleyen CA aktivitesi üzerine etkilerinin, fare karaciğerinde incelenmesi amaçlanmıştır. Çalışma kapsamında, 16 adet erkek C57BL/6J ırkı fare Research Diets' ten alınan yüksek yağlı ve standart fare yemleri ile beslendi. Dört aylık beslenme periyodunun sonunda farelerin ağırlıkları ölçüldü ve dekapitasyon ile sakrifiye edildi. Karaciğer dokuları homojenize edildikten sonra CA aktiviteleri potansiyometrik metod ile ölçüldü. Standart diyet ile beslenen farelerin CA aktivitesi 0,87 ± 0,26 U/mg protein olarak ölçülürken;. Y üksek yağlı diyet grubundaki farelerde ise aktivite 0,60 ± 0,15 U/mg protein olarak bulundu. Yapılan istatistiksel analizler sonucunda, bu farkın istatistiksel olarak anlamlı olduğu görüldü (p= 0.038). Sonuç olarak, yüksek yağlı diyet kullanımının de novo lipit sentezinde öncü bileşiği sentezleyen CA aktivitesini fare karaciğerinde azalttığı ve bu azalışa metabolik ve hormonal değişikliklerin sebep olabileceği kanaatine varıldı. Anahtar Kelimeler: Karbonik Anhidraz, Karaciğer, Fare, Yüksek Yağlı Diyet.
Yağ dokusunda katalaz aktivitesi ölçümü için farklı izolasyon yöntemlerinin karşılaştırılması
Son zamanlarda yapılan çalışmalar yağ dokusunun yalnızca enerji deposu olmadığını, bunun yanında endokrin bir organ olduğunu gösterdi. Beyaz yağ dokusu, vücutta bol oranda bulunmasının yanında ihtiyaç fazlası enerjiyi trigliserit halinde depolayarak sakladığı ve enerji homeostazına katkıda bulunduğu bilinmektedir. Vücutta artan yağ kitlesi sonucu oluşan obezite artmış oksidatif stres ve düşük dereceli kronik inflamasyonla birlikte gözlenir. Antioksidan enzimler, daha az aktif radikal oluşmasına yol açarak veya serbest radikal zincir reaksiyonunun proteinler, lipidler, karbonhidratlar ve DNA üzerine hasarını azaltarak oksidatif stresin şiddetini bastırmaya yardımcı olan proteinlerdir. Katalaz enzimi önemli bir oksidan kaynağı olan H2O2' yi su ve oksijene parçalayarak oksidatif stresin oluşmasını engeller. Yağ dokusunun yüksek lipit ve düşük protein içeriğine sahip olması, lipit interferansının yüksek olması gibi durumlar bu dokuda protein izolasyonunu ve ölçümünü zorlaştırmaktaydı. Çalışmamızda, yağ dokusunda farklı protein izolasyon yöntemlerinin kullanılmasının CAT aktivitesi üzerine etkisinin incelenmesi ve ölçüm için gerekli şartların ortaya konulması amaçlandı. Katalaz aktivitesi ölçümleri Aebi yöntemi ile yapıldı. Sıçanlardan retroperitoneal yağ dokusu çıkarılıp üç farklı homojenizasyon yöntemi için anıldı. Homojenizasyon 1 (H1)' de organik çözücü olarak kloroform/metanol, homojenizasyon 2 (H2)' de ve homojenizasyon 3 (H3)' de sadece kloroform kullanıldı. Yapılan değerlendirmeler sonucunda H1 yönteminin ortalama spesifik aktivite değerleri diğer iki yönteme göre daha yüksek bulundu. Sonuç olarak, retroperitoneal yağ dokusunda H1 yönteminin CAT enzim aktivitesi ölçümünde daha uygun olabileceği kanaatine varıldı.
Denerve edilmiş sıçan yağ dokusunda karbonik anhidraz izoenzimlerinin gen ekspresyonlarının incelenmesi
Sempatik sinir sistemi yağ dokusu metabolizmasının düzenlenmesinde önemli rol oynamaktadır. Yağ doku denervasyon çalışmalarında denerve dokuda lipolizin azaldığı, yağ dokusu kütlesinin artığı gözlenmiştir. Yağ hücrelerinin boyut artışı aşırı TG depolanmasına bağlı olarak şekillenmektedir. Bu projede de novo lipid sentezinde substrat sağlayıcı CA II, VA ve VB izoenzimlerinin denervasyona bağlı olarak beyaz yağ dokusunda nasıl değiştiği araştırıldı. Projede 180-220 g 4-6 haftalık 16 adet erkek sıçan kullanıldı ve iki çalışma grubu oluşturuldu. 1.Grup: Sağ retroperitoneal yağ dokusu tamamen denerve edildi ve 1 ay sonra sakrifiye edildi (sol retroperitoneal yağ dokusu denerve edilmeyip, kontrol olarak kullanıldı). 2.Grup: Sağ retroperitoneal yağ dokusu tamamen denerve edildi ve 3 ay sonra sakrifiye edildi (sol retroperitoneal yağ dokusu denerve edilmeyip, kontrol olarak kullanıldı). Sakrifikasyon işlemlerinden sonra her iki retroperitoneal yağ dokusu çıkarıldı ve ağırlıkları tartıldı. Doku örneklerinde cDNA sentezi ve norepinefrin ölçümü yapıldı. Birinci ayın sonunda denerve edilen yağ dokuda Car2, Car5A veCar5B gen expresyonu düzeyi kontrol yağ dokusu ile karşılaştırıldığında artmış olarak bulundu. Üç aylık denervasyonu takiben yapılan ekspresyon çalışmalarında farklılık bulunamadı. Sonuç olarak denervasyonu takip eden ilk aydaki denerve yağ dokusundaki CA2, CCa5A ve CA5B izoenzimlerinin gen ekspreyonlarının de novo lipid sentezini destekleyecek yönde değiştiği ve bunun da denerve yağ dokusundaki kütle artışına katkı sağladığı kanaatine varıldı.
7,8-dihidroksiflavonun insan karbonik anhidraz I ve II izoenzimleri üzerine etkisinin in vitro araştırılması
Karbonik anhidraz (CA) karbondioksidin hidrasyonunu sağlayan bir metaloenzimdir. Memelilerde 16 izoenzimi keşfedilen CA'ların 15'i insanda da bulunur. İnsan karbonik anhidraz I (hCAI) ve II (hCAII) eritrosit izoenzimleri olarak bilinirler. Bu iki izoenzim kan pH'ını düzenlenmesinde, sıvı elektrolit dengesinin sağlanmasında, solunum ve sindirimde de rol alırlar. Asetazolamid (AZM) başta olmak üzere sülfonamid sınıfı ilaçlar CA inhibitörleridir ve glokom tedavisi için kullanılmaktadır. CA'lar için izoenzim seçici inhibitör ve aktivatör arayışı sürmektedir. Bitkilerde bulunan fenolik bileşikler çok zengin bir sınıfa sahiptir. Antioksidan, antidiyaretik, antialerjik, antimikrobiyal, antispazmotik, antiviral, antitromboz ve antihipertansif gibi etkiler gösterebilirler. 7,8-Dihidroksiflavon (7,8-DHF) fenolik bileşiklerin flavonoid alt sınıfının bir üyesidir. Bu bileşik Tropomiyosin reseptör kinaz B'nin agonistidir. CA üzerinde etkisi daha önce araştırılmamıştır. Bu tez çalışmasında, esteraz aktivitesi yöntemini kullanarak 7,8-DHF'nin hCAI ve hCAII izoenzimleri üzerine in vitro etkileri araştırıldı. Pozitif kontrol olarak AZM kullanıldı. Suda çözünürlüğü düşük olan 7,8-DHF'nin, %17'lik DMSO (Dimetil sülfoksit)'da 0-3 mM arasında farklı konsantrasyonlardaki çözeltileri hazırlandı. 7,8-DHF için belirtilen konsantrasyonlar arasında hCAI ve hCAII izoenzimleri %50 ve daha altında inhibisyon gözlenmedi. 7,8-dihidroksiflavonun hCAI ve hCAII için IC50 değerleri hesaplanmadı. 3 mM olan maksimum 7,8-DHF konsantrasyonunda hCAI ve hCAII izoenzimleri için sırasıyla %14.1 ve %14.7 oranında inhibisyon gözlendi. Sonuç olarak 7,8-DHF'nin hCAI ve hCAII izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine anlamlı bir inhibisyon etkisinin olmadığı görüldü.
Bdnf'nin NLRP3 inflamazomu ve NLRP3 aracılı piroptoz üzerine etkisinin incelenmesi
İnflamazomlar, patojenle ilişkili moleküler yapılar (PAMP) ya da hasarlanma ile ilişkili moleküler yapılar (DAMP) gibi çeşitli uyarılarla aktive olan ve doğuştan gelen bağışıklık yanıtında önemli bir rol oynayan multiprotein komplekslerdir. NOD-benzeri reseptör ailesi pirin domain içeren protein 3 (NLRP3) inflamazomu aktive olduğunda kaspaz-1 aracılığıyla interlökin-1β (IL-1β) ve interlökin-18 (IL-18) gibi sitokinlerin salınımı gerçekleşmektedir. NLRP3 inflamazomu aktive olduğunda hücre ölümü de gerçekleştiğinden, inflamazom aktivasyonunun regülasyonu ve inhibisyonu inflamasyonla ilişkili hastalıkların tedavisinde ve önlenmesinde faydalı bir yol olarak ortaya çıkmaktadır. Bu nedenle, inflamasyonun azaltılmasında immünomodülatör terapötik endojen moleküllere oldukça ihtiyaç vardır. İmmünomodülatör etkilere sahip bir nörotrofin olan beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF), aşırı inflamasyonu baskılamak için çekici bir adaydır. Ancak, BDNF'nin NLRP3 inflamazomu ve NLRP3 inflamazomunun neden olduğu inflamatuar hücre ölüm türü olan piroptozu nasıl etkilediği henüz araştırılmamıştır. Bu çalışmada, BDNF'nin NLRP3 inflamazom aktivasyonu, gasdermin D (GSDMD)-aracılı piroptotik hücre ölümü ve bu yolağın negatif düzenleyicileri üzerine etkisinin incelenmesi amaçlanmıştır. In vivo modelde, Bdnf (+/+) ve Bdnf (+/-) farelerde lipopolisakkarit (LPS) ve Nigerisin (Nig) uygulanarak NLRP3 inflamazom aktivasyonu sağlandı. NLRP3 inflamazom aktivasyonunun sonunda, serum örneklerinde BDNF, IL-1β ve IL-18 seviyeleri ELISA yöntemiyle, hipokampüs, korteks, karaciğer, epididimal yağ ve kas dokusu örneklerinde ise NLRP3 inflamazom yolağı ve bu yolağın negatif düzenleyicileri ile ilişkili proteinlerin seviyeleri Western blot yöntemiyle belirlendi. BDNF eksikliğinin nükleer faktör kappa B (NF-κB) inhibisyonu yoluyla NLRP3 inflamazomu ile ilişkili proteinlerin seviyelerini arttırdığı, IL-1β ve IL-18 salınımını ve piroptotik hücre ölümünü uyardığı ortaya koyuldu. Ayrıca, BDNF eksikliğinin NLRP3 inflamazom aktivasyonunun ve piroptozun inhibisyonunda önemli yollar olan otofajiyi, otofagozom oluşumunu ve plazma membran onarımını inhibe ettiği gösterildi. Sonuç olarak, BDNF eksikliği inflamazom aktivasyonunun ve GSDMD-aracılı piroptozun artmasına neden olmaktadır.
Karbonik anhidraz II'nin homosistein ve metilglioksal ile modifikasyonunun enzim aktivitesi ve antijenik özelliklerine etkisinin incelenmesi
Karbonik anhidrazlar (CA'lar), karbondioksitin hidrasyonunu geri dönüşümlü olarak katalizleyen metalloenzimlerdir. CA enzim ailesinin posttranslasyonel modifikasyonlarına (PTM'larına) dair çalışmalar genellikle veritabanlarına dayanarak değerlendirilmiştir. PTM'ler ile CA'ların fonksiyonları arasında açık bir korelasyon olduğu ifade edilse de birçok modifikasyon olayı için yeterince deneysel çalışmalar yapılmamıştır. Bu çalışmada, geniş bir doku dağılımına sahip insan karbonik anhidraz II (hCAII) izoenziminin homosistein (HCY) ve metilglioksal (MGO) ile in vitro modifikasyonlarının enzimin aktivitesi ve antijenik özellikleri üzerine etkilerinin incelenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, çalışmada kullandığımız saf hCAII izoenzimi, insan eritrositlerinden afinite kromotografisi ile saflaştırıldı. Elde edilen saf hCAII izoenzimi, HCY ve MGO ile in vitro olarak modifiye edildi. Modifikasyonların varlığı western blot ile teyit edildi. Modifiye edilen hCAII izoenzimlerinin hidrataz ve esteraz aktiviteleri ölçüldü. Modifiye olan hCAII izoenzimlerinin antijenik özeliklerini belirlemek için Balb-c fareler bu enzimlerle immünize edildi ve fare serumlarındaki antikor titreleri ELISA yöntemi ile ölçüldü. Enzim aktiviteleri ölçüldüğünde, hCAII enziminin HCY ve MGO ile modifikasyonlarında, N homosisteinilasyona bağlı olarak enzim aktivitesinde dozla ilişkili olarak inhibisyona neden olurken, glikasyona bağlı etkisininin ise düşük modifikasyon dozunda önemli ölçüde aktivasyona sebep olurken yüksek modifikasyon dozunda ise inhibisyona neden oldu. MGO ile modifikasyonun Balb-c farelerde yüksek antijenik cevap oluşturduğu, HCY'nin antijeniteyi değiştirmediği gözlendi. Sonuç olarak, MGO ile modifikasyonun hCAII enziminin hem aktivite hem de antijenik özelliklerini etkilediği, HCY ile modifikasyonun ise enzimin aktivitesinde önemli etkisi olduğu gözlenirken, antijenik olarak etkisi belirlenmemiştir.