Micro RNA
227 theses under this subject heading
Nörofibromatozis tip 1 tümör doku örneklerinde mitokondriyel miRNA verilerinin analizi ve değerlendirilmesi
Nörofibromatozis tip 1 (NF1, von Recklinghausen), toplumda 1/2500 insidansı ile ortaya çıkan bir otozomal dominant hastalık olup ciltte sütlü kahve lekeler (café au lait - CALM), çillenmeler, nörofibrom olarak isimlendirilen farklı boyutlarda iyi huylu tümörler ve malin periferik sinir kılıfı tümörleri (MPNST) gibi belirtiler verir. Bunun yanı sıra omurilikte, kafa sinirlerinde, beyinde tümörler gelişebilmekte ve omurga eğriliği gibi kemik şeklinde bozukluklar meydana gelebilmektedir. NF1 hastalarında saptanan mutasyonlar ile hastalığın fenotipi arasında bir ilişki mevcut değildir. Klinik çok değişkenlik gösterir. Hatta aynı aile içinde bile aynı mutasyonu gösteren bireylerin farklı klinik tablo gösterdiği de bilinen bir durumdur. Bu klinik değişkenliğin ortaya çıkmasındaki görüşlerden biri NF1 geni üzerindeki modifiye edici faktörlerin varlığıdır. Bu aday modifiye edici faktörlerden bir tanesi mikroRNA'lardır (miRNA). Ayrıca son yıllarda yapılan çalışmalar mitokondrilerin fonksiyonundaki değişikliklerin de bir modifiye edici faktör olarak NF1 hastalarının farklı fenotipler göstermesinde rol oynayabileceğini göstermektedir. Mitokondriler, kendine özgü sinyal yolaklarının varlığı ve hücrenin enerji üretim merkezi olmaları nedeniyle önemli organellerdir. Son yıllarda mitokondrilerle yapılan çalışmalar büyük oranda artmıştır. Mitokondrilerin, atasal bir anaerobik ökaryotik hücre tarafından hücre içine alınan bir bakteriden köken aldığı bilinmektedir, karşılaştırmalı analizler ile mitokondriyel fizyolojik süreçler ve bakterilerin olası katılımı gözden geçirilmektedir. Küçük kodlanmayan RNA'lardan olan miRNA'lar, gen ifadesinin post transkripsiyonel düzenleyicileri olarak fonksiyon gösteren RNA'lardır. Son zamanlarda, mitokondriyel miRNA'ların (mitomiR), mitokondriyel genomun translasyonel aktivitesini modüle ettiği ve mitokondriyel protein ifadesini ve fonksiyonunu düzenlediği gösterilmiştir. Mitokondrinin gelişim için gerekli olduğu doğrulanmış olsada, mitomiR'lerin enerji metabolizması, oksidatif stres, inflamasyon ve apoptoz dâhil önemli biyolojik süreçlerin düzenlenmesindeki rolleri daha yeni anlaşılmaya başlamıştır. Bu tez çalışmasında, NF1 hastalarından elde edilen kütanöz ve pleksiform nörofibrom tümör dokularındaki mitomiR'lerin ifadelerinin kontrol dokuya (CALM) göre değerlendirilmesi amaçlandı. Bunun için taze dondurulmuş 11 doku seçildi (Bir kontrol (CALM), beş kütanöz nörofibrom ve beş pleksiform nörofibrom tümör dokusu) ve bu dokularda seçilen 11 mitomiR'in ifadesi kantitatif gerçek zamanlı PZR (kRT-PZR) yöntemi ile değerlendirildi. Yapılan analiz sonucunda seçilen mitomiR'lerde anlamlı bir ifade artışı görülse de kütanöz ve pleksiform nörofibromlar arasında istatistiksel olarak bir fark görülmedi. Araştırılan mitomiR'lerin sayısının az olması nedeniyle daha geniş kapsamlı araştırmalar yapılması gerektiği öngörüldü.
Nonketotik hiperglisinemi hastalarında genotip-fenotip ilişkisinin değerlendirilmesinde etkin mikrorna'ların belirlenmesi
Nonketotik hiperglisinemi (NKH), glisin ensefalopatisi olarak bilinen otozomal resesif (OR) geçişli bir amino asit metabolizma bozukluğudur. Glisin parçalayıcı enzim kompleksindeki bozukluktan dolayı glisin vücutta birikir. Tanı beyin omurilik sıvısı (BOS) ve plazma glisin seviyelerindeki artış ile tespit edilir. NKH'de BOS/plazma glisin oranı genellikle 0,08-0.25 µmol/L'dir. BOS glisin seviyesindeki artış NKH'nin önemli bir göstergesidir ancak NKH için en güvenilir tanı yöntemi genetik analizdir. NKH'de ilk bulgular genellikle doğumda ya da ilk haftalarda meydana gelir. Glisin yüksekliği ketotik hiperglisinemi olarak adlandırılan propiyonik asidemi, metilmalonik asidemi ve beta ketothiolaz enzim eksikliğinde de görülebilmektedir. Bu hastalarda glisin yüksekliği ile ciddi asidoz ve ketozis bir aradadır. Bu duruma ketotik hiperglisinemi denilir. Ketozis, ketotik hiperglisinemide erken müdahale için uyarıcıdır. Literatürde NKH'nin ketotik hiperglisinemiden yaklaşık iki kat daha sık görüldüğü bildirilmiştir. BOS'da glisin artışı yapan bu durumlar BOS/plazma glisin oranında da yüksekliğe sebep olmaktadır. Bu durum NKH'de tanı için BOS/plazma glisin oranın yeterli bir kriter olmadığını göstermektedir ve NKH için daha spesifik bir tanı yönteminin varlığının önemini vurgulamaktadır. NKH'ye neden olan glisin parçalayıcı enzimdeki dört proteinden herhangi birindeki değişikliklerden kaynaklanan biyokimyasal patoloji iyi anlaşılmıştır ancak literatürde henüz genotip-fenotip ilişkisi bulunmamaktadır. MikroRNA'lar (miRNA) gen ifadesinin transkripsiyon ve transkripsiyon sonrası düzenleyicileri olarak fonksiyon gösteren, küçük kodlanmayan RNA'lardır. Düzenleyici rolleri nedeniyle hastalıklarda tanı ve tedavi bakımından yeni bakış açıları sağlayabilirler. Hastalıkla ilişkili miRNA'ları ve ilgili hedeflerini belirlemek, hastalığa yeni moleküler bakış açısı sağlayarak yeni terapötik stratejilerin tasarlanmasını sağlar. miRNA'lar vücut sıvılarında stabil formda bulunurlar, bu da onları rutin klinik işleme ve analize uygun hale getirir ve yeni hastalık biyobelirteçleri olarak kullanımlarının ve tedaviye yanıtın değerlendirilmesinde kullanılır. NKH gibi metabolik blok sonucu toksik madde birikimi ile giden kalıtsal metabolik hastalıklarda erken tanı hayati önem taşımaktadır. Dolayısıyla kalıtsal metabolik hastalıklarda erken tanı için alternatif metotların geliştirilmesi önemlidir. miRNA'ların NKH gibi kalıtsal metabolik hastalıkların erken tanı için daha spesifik ve daha hızlı bir biyobelirteç olarak kullanılabileceğini düşünmekteyiz. Dolaşımdaki miRNA'ların biyobelirteç olarak kullanımları sayesinde; hızlı müdahale için bir hastalığın erken evrelerini tespit etmek, böylece hastalığı önlemek, iyileştirmek veya yavaşlatmak, benzer etiyolojilere sahip patolojileri ayırt etmek, prognozu tahmin etmek ve tedaviye yanıtın izlenmesinde faydalı olacağı düşünülmektedir. Literatürde pek çok kalıtsal metabolik hastalık miRNA çalışması yapılmış olmasına rağmen daha önce NKH miRNA ilişkisini inceleyen bir araştırma bulunmamaktadır. Bu çalışmasında NKH hastalığı ve miRNA'lar ile ilgili daha önce elde ettiğimiz bilgi birikimizi kullanarak NKH'daki miRNA'ların rolünü araştırmayı amaçlıyoruz. Çalışmada NKH hastaları ve sağlıklı bireylerden oluşan kontrol grubuna ait kan, idrar ve BOS sıvılarından izole edilen miRNA'lar karşılaştırılıp büyük ölçekli miRNA profillemesi gerçekleştirilecektir. Elde edilen miRNA'ların ifadesi analiz edilecek ve elde edilen sonuçlara göre kontrol ve hasta grubu arasında ifadesi önemli derecede farklılık gösteren miRNA'lar seçilerek qRT-PCR analizi ile doğrulanacaktır. Son olarak aday miRNA'nın NKH'de fenotipe olan etkisine bakılacaktır. Çalışmamız NKH miRNA ilişkisini inceleyen ilk çalışma olacaktır.
Wwox aracılı miR-182 regülasyonunun meme kanseri hücrelerinde cisplatin direnci ile ilişkisinin CRISPR/CAS9 knockout yöntemi ile araştırılması
Tez projesinin amacı Wwox ifade etmeyen TNBC hücre hattında (MDA-MB-231) gelişen cisplatin direncinin miR-182 regülasyonuna bağlı olup olmadığını açıklığa kavuşturmaktır. Bu amaçla bir onkomiR olduğu bilinen miR-182'nin CRISPR yöntemi ile knockout ya da alternatif bir yöntem olarak düşündüğümüz miRNA inhibitörleri ile knockdown edilmesiyle cisplatinin etkisinin araştırılması hedeflenmiştir. miRNA knockout deneylerinde sıklıkla kullanılmayan fakat günümüzde gen tedavisi çalışmalarında sıklıkla kullanılan CRISPR knockout için miR-182 gen bölgesine spesifik rehberRNA'lar (gRNA) tasarlandı. Agoroz jelde knockout oluşumunu doğrulayacak bir indel (insersiyon/delesyon) gözlemlenmedi. Amacımızı gerçekleştirmek için alternatif bir yöntem olarak belirlediğimiz anti-miR (mikroRNA inhibitörü) kullanılarak knockdown yapılması kararlaştırıldı. Anti-miR182 inhbitörü MDA-MB-231 hücrelerine lipofektamin RNAimax ile transfekte edildi. cDNA sentezi ile Gerçek Zamanlı PZR yapılarak miR-182 geninin knockdown edildiği gösterildi. Anneksin V ile apoptoz testi gerçekleştirildi. Anti-miR182 ve cisplatin uygulanan hücrelerin hücrelerin %20,02'sinin apoptozda olduğunu %20,10'unun ise geç apoptozda olduğunu saptadık. Anti-miR182 ve cisplatin uygulanmayan hücrelerin %11,71'i apoptozda, %18,37'sinin geç apoptozda olduğunu saptadık. Ardından flow sitometri ile hücre döngüsü analizi çalışmaları yapıldı. miR-182 inhibitörü ve cisplatin uygulanan hücrelerde cisplatin ve anti-miR182 uygulanmayan MDA-MB-231 hücrelerine göre G2 fazında %12,23 oranında daha fazla artış saptandı. Sonuçlar, Wwox ifade etmeyen TNBC hücrelerindeki cisplatin direnci ve miR-182 arasındaki bu olası ilişkinin meme kanseri tedavisinde cisplatin direnci için yeni bir gen tedavisi stratejisinin geliştirilmesinde kullanabileceğini önermektedir.
Kistik fibrozis hastalığında belirlenen aday miRNA'ların hasta nazal ve serum örneklerinde analizi
Kistik fibrozis transmembran regülatör (CFTR) genindeki mutasyonların sebep olduğu kistik fibrozis (KF), otozomal resesif kalıtılan ve yaygın görülen genetik bir hastalıktır. Bir klor kanalı olan CFTR proteini, cAMP ve protein kinaz A'ya bağımlı çalışmaktadır. Epitel yüzeyindeki sıvı homeostazisini sağlayan CFTR proteini, diğer klor kanallarının ve epitel sodyum kanallarının düzenlenmesinden sorumludur. Günümüze kadar yapılan çalışmalarda CFTR geninde 2100'den fazla mutasyon olduğu saptanmıştır. CFTR proteininin fonksiyonuna bağlı olarak sınıflandırılan mutasyonlar, CFTR proteininin sentezi, katlanması, taşınması, yerleşmesi ve doğru fonksiyon göstermesi gibi aşamalarına etki ederek hastalık ciddiyetinde önemli rol oynamaktadır. CFTR mutasyonlarının tanımlanması, hastalığın teşhis edilmesini sağlamakta ancak hastalık ciddiyeti, fenotipi ve ilerleyişi hakkında bilgi vermemektedir. Son yıllarda yapılan çalışmalar ile birlikte immün ve inflamatuar cevap, protein katlanması, iyon taşınımı ve oksidatif stres ile ilişkili genlerin ifadelerinin yanı sıra miRNA ifadelerinde gözlenen farklılıkların da hastalık patogenezini etkilediğine dair bulgular artmıştır. Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı ve Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Anabilim Dalı Göğüs Hastalıkları Ünitesi iş birliği ile gerçekleştirilen ön çalışmalar sonucunda, aynı mutasyonu taşımasına rağmen ağır ve hafif klinik ciddiyete sahip kardeşler saptanmıştır. F508del mutasyonuna sahip ağır (n=2) ve hafif (n=2) seyir gösteren hasta kardeşlerden nazal sürüntü örnekleri alınmıştır. Nazal epitel hücreler kullanılarak elde edilen RNA'lar ile miRNA Array yöntemi gerçekleştirilmiş ve elde edilen ham veriler Transcriptome Analysis Console (TAC) programı ile analiz edilmiştir. Yapılan analiz sonrası ifadesi 2 kat ve üzeri artan ya da 2 kat üzeri azalan ortak, miR-449c-5p, miR-34c-3p, miR-34c-5p ve miR-4793-3p olmak üzere 4 miRNA tanımlanmıştır. Önerilen tez çalışmasında amacımız; grubumuzun ön veri olarak elde ettiği 4 miRNA'nın F508del mutasyonuna sahip ağır ve hafif seyirli KF hastalarının serum ve nazal sürüntü örneklerinde valide edilmesi, ekspresyonlarının karşılaştırılması, valide edilen miRNA'ların hedef genlerinin belirlenmesi ve hedef genler ile ilişkili yolakların tanımlanmasıdır. Elde edilen veriler KF'de hastalık seyrinin erken dönemde belirlenmesine kolaylık sağlayacak prognostik miRNA'ların belirlenebilmesini sağlayacak ve KF patogenezi ile ilişkili olan yeni yolaklar aydınlatılabilecektir.
MikroRNA-21 baskılanmış meme kanseri kök hücrelerinin insan kemik iliğinden izole edilen telositler ve telosit kaynaklı mitokondriler ile ko-kültürü
Bu tez çalışmasının amacı, meme tümöründe de tanımlanmış telositlerin ve telosit kaynaklı mitokondrilerin, meme kanseri kök hücrelerinin tümör gelişimine katkısının miR-21-5p'in üzerinden incelenmesidir. Bu tez çalışması kapsamında, ilk olarak insan kemik iliği mononükleer hücrelerinden CD34 ve CD117 pozitif telositlerin izolasyonu yapılarak akım sitometri, immün floresan boyama ve TEM analiz yöntemleri ile karakterizasyonu gerçekleştirildi ve telosit hücrelerinden mitokondriler izole edilerek immün floresan boyama ile karakterize edildi. Sonraki aşamada MDA-MB-231 meme kanseri hücre hattından CD24- ve CD44+ kanser kök hücreleri izole edilerek akım sitometri ile karakterizasyonları yapıldı. Ardından kanser kök hücrelerinin miR-21-5p ifadeleri anti-miR-21-5p inhibitörünün transfeksiyonu ile baskılandı. Yapılan ko-kültür çalışmalarıyla kemik iliği kökenli telositlerin ve mitokondrilerin miR-21-5p baskılanmış kanser kök hücre idamesindeki rollerini incelenmek üzere vimentin ve ALDH1A1 protein seviyelerindeki değişimler Western Blot ile analiz edildi. SNAI1, LZTFL1, OCT3/4, ABCC11, CHD1 (E-Kaderin) ve CHD2 (N-Kaderin) gen ekspresyon değişimleri RT-qPCR yöntemi ile değerlendirildi. İzole edilen telositler CD44/CD117/α-SMA/CD31/CD45 ve CD34 yüzey belirteçlerini ifade ettiği, aynı zamanda vimentin ve PDGF-β'ya pozitif oldukları görüldü. Telositlerden izole edilen mitokondriler immünfloresan boyama ile takip edildi. Kanser kök hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu sonucunda miR-21-5p inhibisyonu gerçekleştirildi ve miR-21-5p gen ifadesinin inhibitör kontrole göre 132 kat azalmış olduğu RT-qPCR ile doğrulandı. Telositlerin ve mitokondrilerin miR-21-5p inhibe edilmiş kanser kök hücreleri ile ko-kültür sonrasında ise miR-21-5p, SNAI1, ABCC11, N-Kaderini, vimentin ve ALDH1A1 ifadelerinin düştüğü; E-Kaderin ve LZTFL gen ifadelerinin artığı saptandı. Bu tez ile ilk defa meme kanserinin ilerlemesinde telositlerin ve telosit kaynaklı mitokondrilerin miR-21-5p üzerinden EMT geçişini düşürebileceğini ve kanser metastazını azaltıcı bir etki gösterebilme potansiyeli bulunabileceğini gen/protein seviyesindeki analizlerle ortaya konmuştur.
Sirkadiyen ritmin aşı ile edinilen bağışıklık yanıtına etkisinin CRISPR/CAS9 tekniğiyle araştırılması
Sirkadiyen ritimler, gen ekspresyonunun zaman içinde düzenlenmesiyle ortaya çıkan biyolojik süreçlerdir. Bu süreçler, uyku ve uyanıklık döngüsü, hormonal salım, metabolizma ve bağışıklık fonksiyonları gibi birçok biyolojik süreci etkiler. Bu nedenle sirkadiyen ritimler, genlerin düzenli bir şekilde ifade edilmesi ve vücudun uygun bir şekilde düzenlenmesi için önemlidir. Bir sirkadiyen gen olan TIMELESS, hücre döngüsü, DNA hasar yanıtı gibi çeşitli biyolojik süreçlerde de rol oynadığından, geniş bir araştırma alanı oluşturmaktadır. Bu tez çalışması kapsamında, TIMELESS sirkadiyen geninin bağışıklık sistemiyle ilişkisi araştırılmıştır. Bu amaçla, öncelikle in silico yöntemler kullanılarak TIMELESS'ın fizikokimyasal özellikleri, hücre içi lokalizasyonu ve 3 boyutlu protein yapısı incelenmiştir. Ardından filogenetik ağaç ve motif analizi yapılarak TIMELESS'ın evrimsel ilişkileri belirlenmiştir. Daha sonra in silico yollarla TIMELESS'ı hedefleyen 52 miRNA tespit edilmiştir. Bu miRNA'ların kanserle, bağışıklık ve enfeksiyonla ilişkili olduğu biyoinformatik yollarla belirlenmiştir. Ek olarak, CRISPR/Cas9 yöntemi kullanılarak, HEK293 hücrelerinde TIMELESS geni nakavt edilmiş ve BCG aşısı aracılığıyla innate ve adaptif 84 genin ekspresyon düzeyleri incelenmiştir. Edinilen bulgular sonucunda TIMELESS geninin bağışıklık sistemi fonksiyonlarıyla ilişkili olduğu tespit edilmiştir. Bu tez çalışması TIMELESS geni ve diğer sirkadiyen genlerin fonksiyonlarının daha iyi anlaşılması, sağlık ve hastalık üzerindeki sirkadiyen ritimlerin etkilerinin daha iyi araştırılması ve tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesine yardımcı olabilir.
Mide kanserinde polimorfik Helicobacter Pylori CagA genotiplerinde miR-200a-3p, miR-223-5p ve miR-29a-3p ekspresyon analizi
Mide kanseri, dünyada en yaygın beşinci malignite olup kansere bağlı ölümlerin önde gelen üçüncü nedenidir. Helicobacter pylori, mide kanser gelişimiyle ilişkili cagA virülans faktörü içermektedir. CagA geninin 3' değişken bölgesindeki dizi varyasyonlarının (A, B, C EPIYA motiflerinin sayısı ve R1, R2, R3 bölgelerinin organizasyonuyla oluşan A, B, C ve D cagA yapısı) mide kanser riskini etkilediği saptanmıştır. Özellikle birden fazla EPIYA-C motifi içeren C-tipi cagA'ya sahip suşların, mide kanser riskini artırdığı gösterilmiştir. Helicobacter pylori virülans faktör cagA' nın, let-7 dahil birçok miRNA ifadesini değiştirdiği tespit edilmiştir. Bu çalışmada kanserli mide dokularından izole edilen Helicobacter pylori suşlarının cagA geninin 3' değişken bölgesindeki dizi varyasyonlarını saptamak üzere PZR analizi yapıldı. Helicobacter pylori enfekte kanserli mide dokularında, miR-200a-3p, miR-223-5p ve miR-29a-3p miRNA'larının ifade değişimi kantitatif gerçek zamanlı PZR ile analiz edildi. CagA 3' değişken bölgedeki dizi varyasyonlarına (ABC EPIYA motifli A-tipi cagA ve AB-ABC EPIYA motifli A ve C tipi cagA) sahip suşlarla enfekte dokularda, miR-29a-3p ve miR-200a-3p ifadesinin azaldığı, miR-223-5p ifadesinin ise arttığı belirlendi.
Mide kanserinde polimorfik Helicobacter pylori vaca genotiplerinde miR-200a-3p, miR-223-5p AND miR-29a-3P miRNA'larının ekspresyon analizi
Mide kanseri insidansı ve mortalitesi oldukça yüksek olan bir kanser türüdür. Küresel çapta kansere bağlı ölüm oranlarında ikinci sırada yer almaktadır. H. pylori mide kanseri risk faktörü olarak bilinmektedir. H. pylori'den vakuol oluşturucu bir protein salınmaktadır. Vakuol oluşturucu proteinin vacA adı verilen gen tarafından kodlandığı bilinmektedir. VacA'nın kodladığı protein prekürsör halde 140 kDa boyutundadır. Salgılanan proteinden proteolotik prosesler sonucunda 88 kDa'lık aktif toksin bölgesi oluşmaktadır. Aktif toksin bölgesi p33 ve p55 adlı iki koldan meydana gelmektedir. Bu iki kol üzerinde s-, m- ve i- bölgeleri mevcuttur. H. pylori vacA toksin bölgelerinde farklı alleller (S1/M1/i1 veya S2/M2/İ2) içeren formlar bulunmaktadır. S1/M1/İ1 allelleri en polimorfik formlardır. H. pylori vacA'nın vakuol oluşturma yeteneği ile apoptozu tetiklemesi ve T lenfositlerinin proliferasyonunun baskılanması gibi diğer etkileri arasında doğrudan bir ilişki mevcuttur. H. pylori virülans faktör VacA'nın, let-7 dahil birçok miRNA ifadesini değiştirdiği tespit edilmiştir. Bu çalışmada kanserli mide dokularından izole edilen H. pylori suşlarında VacA geninin polimorfik bölgelerini saptamak üzere PZR analizi yapıldı. Farklı VacA formlarına sahip kanserli mide dokularında, miR-29a-3p, miR-200a-5p ve miR-223-3p miRNA'larının ifade değişimi kantitatif gerçek zamanlı PZR ile analiz edildi. Farklı VacA formlarının mide kanseri dokularında, çalışılan miRNA'ların ifade seviyesini etkileyebileceği gözlemlendi.
Pankreas kanseri hücre hattında TFAM ekspresyon düzeyinin hücre fonksiyonları üzerine etkisi
Pankreas kanseri genellikle geç bir aşamada farkedilir çünkü çok ileri evrelere ulaşana dek semptomları görülmez. Kilo kaybı, karın bölgesinde ağrı, sarılık (karaciğerdeki toksik yapılanma nedeniyle cildin sarıya dönmesi) en yaygın görülen semptomlardır. Bunlar genellikle tümör belli bir büyüklüğe eriştikten sonra ortaya çıkar ve çoğu zaman bereberinde karaciğer metastazı vardır. Karsinomaların metastaz yapması için, epitelyal tümör hücreleri, birincil bölgede istila, ikincil bir yerde yayılma ve kolonizasyonu içeren karmaşık bir dizi olaydan geçer. Bu metastatik kaskadı, sadece tümör hücrelerinde çalışan sayısız sinyal yolu ile değil aynı zamanda stromal hücrelerle olan ilişkileri de modüle edilebilir. İstilacı yetenekler elde etmek için, epitelyal tümör hücreleri, hücre- hücre adezyonlarının kaybını kolaylaştıran ve hücre hareketliliğini, kök hücre benzeri özellikleri ve apoptoza karşı direnci arttıran bir işlem olan bir epitel-mezenkimal geçişine (EMT) maruz kalabilir. Bu özellikler, tümörün farklılaşmasını arttırdığı ve metastaza gidişi arttırdığı bilinmektedir. MikroRNA'ların hücre çoğalması, farklılaşması, kök hücrenin yenilenmesi ve apoptoz gibi birçok biyolojik süreçte düzenleyici işlevlerinin olduğu bilinmektedir. miRNA'lar, hedefledikleri mRNA'lara göre onkojenik veya tümör baskılayıcı özellik kazanabilirler. Kanserin gelişimini arttırdığı düşünülen miRNA'lar 'onkomir' olarak tanımlanmaktadır. Onkogen olarak işlev gösteren bu miRNA'lar hedefi olan tümör baskılayıcı genleri baskılayarak tümörün gelişmesine katkı sağlarlar. Genellikle kanserlerde kontrolsüz büyümeyi arttırıcı ya da antiapoptotik olarak fonksiyon gösterdikleri rapor edilmiştir. Görevleri bir onkogenin ekspresyonunu kontrol etmek olan miRNA'lar ise 'tümör baskılayıcı miRNA'lar' olarak tanımlanmaktadır. Tümör baskılayıcı miRNA'ların ekspresyonundaki azalışın onkogenlerin ekspresyonunu arttırdığı ve sonuçta tümör oluşumuna neden olduğu bilinmektedir. mir200 ailesinin düşük ekspresi, invazyon ve metastaz malign tümör ilerlemesinin göstergelerindendir. Taranan literatür bilgilerine göre mir200a; meme, over, prostat, kolorektal kanser, mide ve pankreas kanserlerinde tümör baskılayıcı olarak görev almıştır. Bu çalışmada, mir200a'nın tümör baskılayıcı özelliği üzerinde durularak araştırmalar yapılacaktır. Oksidatif fosforilasyondan sorumlu olan mitokondri, hücresel enerjinin üretim merkezidir. Warburg'un, kanserin oksidatif fosforilasyondaki veya mitokondrideki bozulmalardan kaynaklandığını öne sürmesiyle son yıllarda mitokondri ve kanser arasındaki ilişkiyi belirlemeye yönelik çok sayıda çalışma yapılmıştır. Elde edilen verilere göre kanser hücrelerinde mtDNA'da mutasyon birikimi çekirdek DNA'sına göre 10 kat daha fazladır. Bu mutasyonlar çoğu kez homoplazmiktir ve erken evre kanser hücrelerinde belirlenebilir. Bu bulgular mtDNA mutasyonlarının kanserin işaretçisi olarak kullanılabileceği fikrini doğurmuştur. Aynı zamanda bu işaretlerin erken evre kanserlerde belirlenebilmesi kanser tedavisine erken başlama olanağını sunması açısından da önemlidir. İnsan mitokondrilerindeki transkripsiyon, POLRMT adı verilen DNA'ya bağlı bir RNA polimerazı tarafından yönlendirilir. Transkripsiyonun başlatılması, POLRMT'nin TFAM (mitokondriyal transkripsiyon faktörü A) ve TFB2M (mitokondriyal transkripsiyon faktörü B2) ile ilişkisini gerektirir. TFAM, transkripsiyon aktivasyonuna ek olarak DNA'yı nükleoid içinde paketleyen bir DNA bağlayıcı proteindir. mir200a, TFAM'ı hedefleyerek downregüle etmektedir. Bu tezde, pankreas kanseri hücre hattında TFAM ekspresyon düzeyinin kanser hücre fonksiyonları üzerine etkisi, mir200a ile TFAM ilişkisi üzerinden araştırılacaktır.
Otoinflamatuvar hastalıklarda rolü olan MRNA ve MİRNA moleküllerinin meta-analizi
Otoinflamatuvar hastalıklar, doğal bağışıklık sisteminin etkilenmesi sonucunda inflamasyon yanıtlarının arttığı bir hastalık grubudur. Bu hastalıklar genetik özellikleri açısından monogenik ve poligenik olarak gruplandırılabilmektedir. Bu hastalıklar içerisinde tez kapsamında incelenen; PFAPA poligenik olarak, AAA, CAPS, TRAPS, MKD hastalıkları ise farklı genlerde oluşan mutasyonlar sonucunda ortaya çıkmaktadır, ancak bu hastalıklarda görülen benzer fenotip, benzer yolakların ve moleküllerin etkilendiğini düşündürmektedir. Literatürde otoinflamatuvar hastalıklar ile ilişkili omik temelli çalışmalar mevcuttur. Tez kapsamında, bu verilerin birlikte değerlendirilmesi amaçlanmış, mRNA ve miRNA temelli omik çalışmaların mikrodizin veri setleri R (4.0.5), BRB-ArrayTools ve MeV gibi programlar kullanılarak analiz edilmiştir. İfadesi değişen genler, DAVID ve InnateDB programlarıyla analiz edilerek inflamasyonla ilişkili olanlar belirlenmiştir. Sonrasında, bu hastalıklarda ortak olarak ifadesi değişen mRNA'lar, ifadesi değişen miRNA'ların hedef genleri olabileceğinden, veri setlerinden elde edilen mRNA ve miRNA'ların bağlanma olasılıkları TargetScan veri tabanı kullanılarak gösterilmiştir. Son aşamada, anlamlı olarak ifadesi değişen mRNA ve miRNA'ların hedeflediği proteinler tanımlanmış, bu proteinlerin arasındaki protein-protein ilişkileri STRING analizleri ile belirlenmiştir. Analizler sonucunda, inflamasyon açısından önemli proteinler olan STAT1, NAIP, FAS, MAPK14 proteinleri öne çıkmış ve seçilen hastalıklara sebep olan genlerin kodladığı proteinler ile ilişkisi oldukları gösterilmiştir. Elde edilen bu ön bilgiler, seçilen hastalıklarda ortak moleküllerin patogenezi etkilediği hipotezini desteklemiş, bu bulguların laboratuvar ortamında incelenmesi önem kazanmıştır. Bu tez, otoinflamatuvar hastalıklarda inflamasyona sebep olan yolakların aydınlatılarak hastalıkların daha iyi sınıflandırılması ve uzun vadede tedavi hedefi olabilecek moleküllerin belirlenmesine yönelik önemli katkılar sağlayabilecektir.
Kolşisin direnci olan ailevi akdeniz ateşi hastalarında ifadesi değişen miRNA'ların inflamasyon ve ilaç direnci ile ilişkisinin belirlenmesi
Ailevi Akdeniz ateşi klinik heterojenitenin görüldüğü monogenik bir sistemik otoinflamatuvar hastalıktır. Ailevi Akdeniz ateşinde en yaygın tedavi yöntemi günlük kolşisin kullanımıdır. Fakat hastaların %2-5'lik kısmında kolşisin direnci görülmektedir. İlaç direncinin gelişiminde epigenetik mekanizmaların özellikle kodlamayan RNA'lardan mikroRNA'ların rol oynadığına dair çalışmalar mevcuttur. Bu sebeple kolşisin dirençli hastalarda ifadesi değişen mikroRNA'ların ilaç direnci ve inflamasyon ile muhtemel ilişkisinin değerlendirilmesi gerektiği düşünülmüştür. Grubumuz tarafından daha önce gerçekleştirilen miRNA 4.0 array ile mikroRNA ifade analizi yeniden değerlendirilmiş; kolşisin dirençli ve duyarlı hasta grupları arasında ifadesi en az 2 kat değişen 25 mikroRNA bulunmuştur. Bu mikroRNA'lardan ilaç direnci ile yüksek oranda ilişkili bulunanlar hasta grubunda kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile valide edilmiş, miR-183-5p ve miR-15b-5p'nin ifadesinin kolşisin dirençli hastalarda anlamlı şekilde azaldığı, miR-125a-5p'nin ifadesinin anlamlı olmayan bir azalış gösterdiği bulunmuştur. Biyoinformatik araçlar kullanılarak hem inflamasyon hem de ilaç direnci ile ilişkili genlerin listesi oluşturmuş, kolşisin dirençli hastalarda anlamlı azalış gösteren mikroRNA'ların ilaç direnci ve inflamasyonla ilişkili olası hedef genleri belirlenmiştir. Genlerin ifade analizi için yapılan kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu deneylerinde, kolşisin dirençli hastalarda azaldığı görülen mikroRNA'ların olası hedef genleri olarak seçilen NR3C1 ve NFKB1'in ifadesinin, aynı hasta grubunda arttığı gösterilmiştir. Grubumuzun önceki projeleri sırasında oluşturulmuş kolşisin dirençli hücre hattında da aynı mikroRNA'ların ve hedef genlerinin hasta grubuyla benzer değişim gösterdiği saptanmıştır. Bu çalışma sonucunda belirlenen ifadesi değişen mikroRNA'ların, ileride kolşisin direncinin erken tanısı için biyobelirteç olma potansiyeli taşıdığı düşünülmektedir. Anahtar kelimeler: AAA, kolşisin direnci, mikroRNA
Besin alerjisi patogenezinde kısa ve uzun kodlamayan RNA'ların rolü
Zararsız olan bir besin antijenine yönelik uygunsuz bir bağışıklık yanıtı olarak tanımlanan besin alerjisi multifaktöriyel bir hastalıktır. Diğer alerjik hastalıklarda olduğu gibi besin alerjisinin sıklığı da tüm dünyada giderek artmaktadır. Bu artışın sebeplerinden birinin de epigenetik mekanizmalar olduğunu gösteren çalışmalar vardır. Epigenetik mekanizmalardan biri olan miRNA ve IncRNA'ların ifade paterni, farklı hücre tiplerine ve hastalık koşullarına göre değişmektedir. miRNA'lar ve IncRNA'lar stabildir ve serum, idrar ve tükürük gibi farklı vücut sıvılarında tespit edilebildiği için önemli birer biyobelirteç olabilme potansiyeline sahiptirler. Bu çalışmada, seçilen miRNA'lar ve IncRNA'ların besin alerjisi gelişimi ve patogenezindeki etkisinin araştırılması ve besin alerjisi için bir biyobelirteç adayı olabilme potansiyellerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. 26 besin alerjisi hastası ve 30 sağlıklı kontrolün serumunda miRNA (miR-19a ve miR-98) ve IncRNA (Inc-MALAT-1 ve lnc-GATA3-AS1) ifadesi gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (GZ-PZR) ile tespit edildi. Serum IL-4, IL-10, IL-13 ve TGF-β seviyeleri ELISA yöntemi kullanılarak ölçüldü. Çalışmamızın sonucunda miR-98'in besin alerjili çocuklarda, sağlıklı çocuklarla kıyaslandığında anlamlı derecede daha az ifade edildiği görülmüştür (p<0,05). miR-19a ve MALAT1 gen ifade seviyeleri sağlıklı çocuklar ile besin alerjili çocuklar arasında kıyaslandığında fark görülmemiştir (p>0,05). Hasta ve kontrollere ait serum örneklerinde GATA3-AS1 lncRNA tespit edilememiştir. Örneklerde serum IL-4 ve IL-10 seviyeleri ölçülebilir düzeyde bulunamazken, TGF-β seviyeleri sağlıklı çocuklarda besin alerjili çocuklarla kıyaslandığında anlamlı derecede daha fazla olduğu görülmüştür (p<0,05). miR-98 ile ilişkili olduğu düşünülen IL-13'ün sağlıklı çocuklara kıyasla besin alerjili çocuklarda serum protein seviyelerinde bir fark görülmemiştir (p>0,05) Çalışmamızda hastalar ile sağlıklı grup arasında sadece miR-98'nin ifade düzeyleri bakımından fark gözlemlendi. Literatürdeki verilerle beraber değerlendirildiğinde, miR-98'nin besin alerjisi için bir biyobelirteç adayı olabileceği düşünülmektedir.
Sağlıklı ve pyometralı köpeklerde uterus dokusunda miR-155, miR-451'in ifadelenme düzeylerinin belirlenmesi
Köpeklerde pyometra, veteriner hekimliğinde sıklıkla karşılaşılan ve ölümle sonuçlanabilen bir hastalıktır. Kistik endometrial hiperplazi (KEH)-pyometra kompleksi, ilk defa 1957 yılında tanımlanmış olup, hormonal değişiklikler sonucu uterusun sekonder enfeksiyonlara karşı hassas olması nedeni ile pyometra oluşumunu tetiklediği şeklinde açıklanmıştır. Köpeklerde pyometra hastalığının prevalansının araştırılmasına yönelik çalışmalar oldukça sınırlıdır. Yapılan çalışmalar incelendiğinde rutin uterus muayenesinde teşhis edilen endometritis prevalansı yaklaşık %43, ülkemizde yapılan çalışmada ise pyometra prevalansı %35 olarak bildirilmiştir. Bu veriler hastalığın dünya ve ülke genelinde mortalitesinin yüksek olduğu, teşhis ve tedavisi için var olan yöntemlerin daha ileri bir seviyeye taşınması gerekliliğini göstermiştir. Yapılan çalışmalar, mikro ribonükleik asitlerin (miRNA'ların) diyabet, ateroskleroz, böbrek hastalıkları, kanser gibi birçok hastalığın tanısıyla ilişkili olduğunu göstermiştir. Normal uterusun fizyolojik durumunda ve patolojik bozukluklarında miRNA'ların düzenleyici işlevleri değerlendirilmiş olup, endometritis ve sağlıklı uterusa sahip hayvanlar uterus inflamasyonu varlığında miRNA ekspresyon profili yönünden incelenmiş ve çeşitli aday miRNA'ların varlığı belirtilmiştir. Tez çalışmamızda, miRNA gibi epigenetik mekanizmalarda rol oynayan, hastalıkların tanısında spesifik olarak biyobelirteç özelliği gösterebilen, hedefe yönelik tedavide büyük önem taşıyan yaklaşık 22 nükleotidden meydana gelen kodlama özelliği olmayan yapıların, sağlıklı olan ve pyometra teşhisi konmuş köpeklerden alınan uterus örneklerinde ifadelenme düzeylerinin karşılaştırılmasını hedefledik. Aday olarak belirlenen ve yangı (inflamasyon) durumlarında ilgili dokulardan spesifik olarak ifadelenebilen miR-155 ve miR-451'in özellikle pyometralı hayvanların uterus dokularında, sağlıklı olanlara nazaran daha fazla ifadelendiği sonucuna ulaşmış olduk. Tez çalışmamız ile bu kapsamda, iki adet miRNA'nın uterusta şekillenen ve geç saptanabilen pyometra hastalığının erken teşhisine ciddi katkılar sağlayacağını ifade etmek isteriz. Çalışmamızdan elde ettiğimiz sonuçların pyometra teşhis ve tedavisine yeni bir bakış açısı sağlayacağı düşünülmektedir.
Kokain kullanım bozukluğu olan erkek bireylerde periferik kandaki miRNA ekspresyon düzeylerinin araştırılması
Birçok hayvan ve hücre çalışması mikroRNA'ların kokain, alkol, eroin ve metamfetamin bağımlılığı dahil olmak üzere psikotrop madde bağımlılıklarının gelişmesinde ve ilerlemesinde önemli roller oynadığını göstermiştir. Uluslararası literatürde kokain kullanım bozukluğunun, insan periferik kanında mikroRNA düzeyindeki etkisini araştıran bilimsel çalışmaların sınırlı sayıda olduğu gözlenmektedir. Bununla birlikte, ülkemizde mikroRNA'ların kokain bağımlılığı üzerine periferik kanda potansiyel biyobelirteçler olarak rolü henüz keşfedilmemiştir. Bu bağlamda, bu çalışma kokain bağımlılarının periferik tam kanında yer alan bazı mikroRNA'ların (miR-9-5p, miR-26b-5p, miR-132-3p ve miR-134-5p) ifadelerindeki değişimi saptayarak, kokain bağımlılığı düzenlenmesinde rol oynayabilecek aday mikroRNA'ları tanımlamayı hedeflemiştir. Bu çalışma, uluslararası literatüre göre kokain bağımlısı insan periferik kanında ilgili mikroRNA'ların analizinin yapıldığı ilk çalışmadır. Bu çalışmada, kokain bağımlısı olan 12 erkek birey bağımlı grubunu, kokain bağımlılığı tedavisi gören 11 birey tedavi grubunu ve herhangi bir madde bağımlılığı olmayan 16 sağlıklı birey kontrol grubunu oluşturmaktadır. Bağımlı ve tedavi grubu bireylerine ait kan örnekleri Balıklı Rum Hastanesi Anatolia Kliniği'ne tedavi edilmek üzere başvuran ve çalışmaya katılmayı kabul eden gönüllü bireylerden toplanmıştır. Bireylerden alınan periferik kan örneklerinden total RNA izolasyonu gerçekleştirildikten sonra ters transkriptaz ile cDNA sentezi gerçekleştirilmiştir. MikroRNA'ların ifadelerindeki değişim kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu yöntemi ile belirlenmiştir. 2-ΔΔCT formülüne göre mikroRNA ekspresyon düzeylerindeki ''fold change'' (kat değişimi) değeri belirlenmiştir. İstatiktiksel analizlerde mikroRNA'ların ekspresyonu için ΔCt değerleri üzerinden analizler yapılmıştır. Bağımlı, tedavi ve kontrol grupları arasında aday mikroRNA'ların ΔCt değerleri açısından fark olup olmadığı One-way ANOVA testi ile analiz edilmiştir. Post-hoc test olarak LSD testi ya da Tamhane's T2 testi kullanılmıştır. Tüm analizlerde p<0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. Periferik kan mikroRNA'larının tanısal yeterliliğini değerlendirmek için ROC analizi yöntemi kullanılmıştır. Çalışmanın sonucunda, bağımlı grubu ile tedavi grubu arasında yalnızca miR-132-3p (p=0,003) ve miR-134-5p'nin (p=0,020) ΔCt değerleri açısından anlamlı bir fark olduğu belirlenmiştir. Bağımlı grubu ile tedavi grubu arasında sırasıyla miR-9-5p (p=0,012), miR-26b-5p (0,009), miR-132-3p (p=0,026) ve miR-134-5p'nin (p=0,023) ΔCt değerleri açısından anlamlı bir fark olduğu belirlenmiştir. Tedavi grubu ile kontrol grubu arasında, yalnızca miR-9-5p (p=0,019) ve miR-26b-5p'nin (0,024) ΔCt değerleri açısından anlamlı bir fark olduğu belirlenmiştir. Yapılan ROC eğrisi analizleri kontrol grubu ile karşılaştırıldığında bağımlı grubunda miR-132-3p için AUC değeri 0,778; miR-134-5p için AUC değeri 0,744 ile anlamlı bulunmuştur. Bu sonuçlar miR-132-3p ve miR-134-5p'nin kokain bağımlısı olan bireylerde tanıda etkili yardımcı parametreler olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlarla birlikte gelecekte benzer bulguların başka çalışmalarla ortaya konması durumunda, özellikle kokain bağımlılığı patolojisinde rol oynayabilecek mikroRNA'ların tespit edilmesi ve bu mikroRNA'ların kokain bağımlılığının tedavisinde potansiyel bir hedef olabileceği düşünülmektedir.
Kistik fibrozis patogenezinde aday miRNA ve hedef genlerinin biyoinformatik araçlarla tanımlanması
Kistik fibrozis transmembran regülatör (CFTR) genindeki mutasyonların sebep olduğu kistik fibrozis (KF) otozomal resesif kalıtılan oldukça yaygın görülen genetik bir hastalıktır. Hastalık ciddiyeti mutasyonların CFTR proteini üzerindeki etkisiyle ilişkilendirilse de aynı mutasyonu taşıyan hastalarda hastalık ciddiyetini epigenetik faktörlerin de etkilediği bilinmektedir. Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı ve Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Anabilim Dalı Göğüs Hastalıkları Ünitesi iş birliği ile gerçekleştirdiğimiz ön çalışmalar sonucunda aynı mutasyonu taşımasına rağmen hastalık ciddiyeti farklı seyreden kardeşler saptanmıştır. Gerçekleştirdiğimiz ön çalışmalarda hasta kardeşlerden elde ettiğimiz nazal sürüntüler kullanılarak; hedeflenmiş transkriptomik Kistik Fibrozis PCR Array yöntemi ile ifade farklılığı gösteren genler ve yolaklar saptanmıştır. Bu tez çalışmasında amacımız, aynı CFTR mutasyonuna sahip olmalarına rağmen farklı klinik ciddiyete sahip hasta kardeşlerde ifade değişikliği gösteren, fenotipik farklılığı açıklamaya yönelik ortak miRNA'ların ve hedef genlerinin tanımlanmasıdır. Bu amaç ile Hacettepe Üniversitesi Kapsamlı Araştırma Projesinde (TSA 201816629) gerçekleştirilmiş olan miRNA array ham verisi farklı biyoinformatik araçlarla tanımlanmış, kardeşler arasında klinik heterojeniteye sebep olabilecek aday miRNA'lar ve hedefleriyle ilişkili yolaklar saptanmıştır. BRB-ArrayTool, TAC 4.0 ve MeV programları kullanılarak Affymetrix miRNA 4.0 Array mikrodizin sonuçlarının ham verileri analiz edilmiş ve aday miRNA'lar seçilmiştir. Analizler sonucunda ağır seyirli hastalarda hafif seyirli hastalara göre ve Sınıf IV hasta grubunda ağır seyirli hastada hafif seyirli hastalara göre ifadesi artan miR-145-5p saptanmıştır. miR-145-5p'nin hedef genlerine ait yolak analizleri sonucunda miRWalk ve miRNET programlarında ortak ErbB sinyal yolağı elde edilmiştir. Ön çalışmamızın çıktılarında yer alan aday genlerin miRNA hedefleri olma durumu da araştırılmıştır. KF patolojisi ile uyumlu ve p değeri en yüksek IL-17 sinyal yolağı miR-145-5p için tanımlanmıştır. Ayrıca hastalarda kontrol bireylere göre ifadesi artan miR-92a-3p tanımlanmıştır. miR-92a-3p'nin hedef genlerine ait yolak analizleri sonucunda miRWalk ve miRNET programlarında en çok hedef geni içeren endositoz yolağı elde edilmiştir. Bu çalışma ile KF hastalarının klinik seyrini ve KF'ye eşlik eden diğer hastalıkların erken dönemde saptanmasını kolaylaştıracak, prognostik bir miRNA imzası tanımlanabilecek ve hastalık patogenezi ile ilişkili yeni yolaklar aydınlatılabilecektir.
Hücre kültüründe aromataz/sirtuin-1 etkileşiminin miRNA ifade düzeyine olan etkisinin araştırılması"
Birçok fizyolojik ve patolojik süreçte yer alan Sirtuin-1ʹin (SIRT1) ve aromatazın aktivasyon/inhibisyonlarındaki değişiklikler nörodejeneratif hastalıklarda önemli rol oynar. MikroRNA'lar (miRNA'lar), gen ekspresyonunun temel düzenleyicileridir ve birçok hastalıkta yer alan birden fazla moleküler yolağı düzenler. Bu çalışmanın amacı, insan nöroblastoma hücrelerinde aromataz ve SIRT1 arasındaki etkileşimi ve bu etkileşim ile miRNA ekspresyonu arasında nasıl bir bağlantı olduğunu araştırmaktır. İnsan nöroblastoma hücreleri, serumdan yoksun besiyerinde 6, 12 ve 24 saat süreyle inkübe edildi ve aromataz ile SIRT1 ekspresyonu Western blot yöntemi ile değerlendirildi. SIRT1 aktivatörü (SRT1720), SIRT1 inhibitörü (EX527) ve aromataz inhibitörlerinin (letrozol ve fadrozol) IC50 konsantrasyonu XTT yöntemi kullanılarak tespit edildi. SIRT1 siRNA, IC50 konsantrayonunda SRT1720, EX527, letrozol ve fadrozol uygulamalarının aromataz ile SIRT1 üzerine etkileri değerlendirildi. Son olarak, SIRT1, aromataz ekspresyonu ve miRNA hedef gen analizleri biyoinformatik yaklaşımlar ve istatistiksel parametrelerle tüm gruplarda değerlendirildi. Sonuçlara göre, serumdan yoksun ortamda 24 saat inkübe edilen hücrelerde aromataz ve SIRT1 protein seviyeleri önemli ölçüde arttı (p ≤ 0,05). Ayrıca, SH-SY5Y hücrelerinde SIRT1 FBS içeren/içermeyen ortamlarda CYP19A1'i pozitif olarak regüle etti. Ek olarak, SIRT1 siRNA transfeksiyonu, insan nöroblastoma hücrelerinde LC3, ATG5 ve LAMP2 ekspresyonlarının azalmasına neden oldu. Bu çalışmada, fenol kırmızısı içermeyen besiyeri ortamındaki SH-SY5Y hücrelerinde IC50 değeri SRT1720 için 13,55 μM, EX527 için 308,22 μM, letrozol için 26,81 μM, fadrozol için 3 μM, fenol kırmızısı varlığında ise IC50 değeri SRT1720 için 14,45 μM, EX527 için 316,10 μM, letrozol için 23,92 μM ve fadrozol için 4,57 μM olarak belirlendi. Ek olarak 6, 12, 24 ve 48 saat serum yoksunluğu oksidan/antioksidan sistemde de değişikliğe neden oldu. Oksidatif Stres İndeksi (OSI), 24 saat FBS yokluğunda azalma eğiliminde iken, 48 saat serum yokluğunda kontrole kıyasla anlamlı bir azalma gösterdi (p ≤ 0,001). Biyoinformatik analizler sonucunda, SIRT1 ve CYP19A1'i potansiyel olarak düzenleyebilecek 3 miRNA belirlendi. Hedef genler kullanılarak yapılan yolak zenginleştirme analizi sonucunda sinir sistemi veya bu sistemle ilişkili hastalıklarla ilgili birçok yolak tespit edildi. Ek olarak, hsa-miR-27a-3p ve hsa-miR-181a-5pʹnin 24 saat ve 12 saatteki ifade değişimlerinin birbiri ile korele olduğu tespit edildi ve bu miRNA'ların ifadesinde önemli bir azalma olduğu belirlendi. Öte yandan, hsa-miR-30c-5p ifadesi, 12 saat uygulamaya kıyasla 24 saatte önemli ölçüde artış gösterdi. Bu sonuçlar, gelecekteki çalışmalarda mevcut tedavilerle tamamlayıcılık açısından daha fazla araştırma stratejisi için yeni bir yaklaşım sağlayabilir ve nöroloji ile ilişkili hastalıkların anlaşılmasında katkıda bulunabilir.
miRNA kullanılarak NOTCH1 ınhibisyonu ile kanser kök hücre ve tümör mikroçevresinin hedeflenmesi
Pankreas kanseri, 6 ay ortalama hasta sağkalımı ile son derece zayıf sağkalım oranlarına sahip en agresif kanserlerden biridir ve karşılanamayan bir terapötik zorluğu temsil etmektedir. Pankreas kanseri ilerleyişini ve mekanizmaları hala tam olarak anlaşılamamıştır. Yalnızca tümör hücrelerini hedef alan stratejilerin pankreas kanseri hücrelerini ortadan kaldırmada başarısız olduğu ve metastazı, ilaca direnci ve hasta ölümlerini önlediği kanıtlanmıştır. Kanser kök hücreleri hücre göçü / istilası, ilaç direnci ve metastaz özellikleri sebebiyle önemli klinik etkilere sahiptir. NOTCH ve ilişkili sinyal yolaklarının kanser kök hücrelerinde yüksek/artmış aktivite gösterdikleri; bu hücrelerin sürdürülmesi ve sağkalımı için önemli olduğu bilinmektedir. NOTCH1'in pankreas kanseri kök hücrelerinin regülasyonundaki fonksiyonel rolü açıklığa kavuşmamıştır. Planlanan çalışmayla klinikte kullanılan toksik olmayan nanolipozom teknolojisi ile NOTCH1'i hedefleyen miRNA temelli tedavi modeli uygulanmıştır. NOTCH1 hedef alınarak kanser kök hücre özelliklerinin baskılandığı, tümör büyümesi ve yayılmasının durduğu görülmüştür. Tedavi yaklaşımı olarak etkin bir şekilde kullanılabileceği öngörülmektedir .
Akciğer kanseri hücre serilerinde epidermal büyüme faktörü reseptörünün inhibisyonunun claudinler üzerine etkisinin araştırılması
Sıkı bağlantılar epitelial, endotel ve mezotel hücrelerinde bulunan membrana bağlı yapılardır. Hem epitel hem de endotel hücre tabakalarının bitişik hücreleri arasında bağlantı sağlayan çoklu protein kompleksleridir. PIKfyve inhibitörü YM201636'nın sıkı bağlantı proteinleri CLDN1 ve CLDN2'nin endositik geri dönüşümünü inhibe ederek sıkı bağlantı yapılarını bozduğu bildirilmiştir. Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR), hücre zarında bulunan bir transmembran glikoproteindir ve hücre proliferasyonunun düzenlenmesinde kritik önemi bulunmaktadır. Kanser hücrelerinde EGFR işlevini inhibe etmek için hücre içi tirozin kinaz sinyalizasyonunu engelleyen moleküller veya EGFR'ye ve ligandlarına karşı nötrleştirici antikorlar kullanılmaktadır. Canertinib (CI-1033), in vitro koşullarda EGFR, HER2 ve HER4'ü inhibe eden bir tirozin kinaz inhibitörüdür. Bu tez çalışmasında sıkı bağlantıların yapısal bir bileşeni olan claudinler ve EGFR arasındaki ilişkinin aydınlatılması amaçlanmıştır. Bunun için EGFR mutant ve wild type akciğer kanseri hücre serileri HCC827 ve H1299 kullanılmış, CI-1033 ve YM201636 etken maddelerinin sitotoksik ve apoptotik etkileri ile birlikte EGFR ve claudin mRNA ve protein düzeylerine etkileri araştırılmıştır. Sitotoksisite analizlerinde XTT, apoptoz analizlerinde Annexin/PI boyaması, mRNA ve protein düzeylerinin belirlenmesinde kantitatif RT-PCR ve western blot yöntemleri kullanılmıştır. CI-1033'ün HCC827 ve H1299 hücre serilerinde IC50 dozu sırasıyla 2.17 ve 16.42 µM bulunmuştur. YM201636, EGFR mutant HCC827 hücre serisinde 11.07 µM'da sitotoksik etki gösterirken, EGFR wild type H1299 hücrelerinde 75 µM konsantrasyonda hücre canlılığını etkilememiştir. YM201636 etken maddesi HCC827 hücrelerinde EGFR, CLDN1 ve CLDN3 mRNA ekspresyon düzeylerinde anlamlı artışa neden olmuştur, H1299 hücrelerinde ise YM201636 uygulandıktan sonra CLDN1 mRNA düzeyi anlamlı olarak azalmıştır. CI-1033 ve YM201636 inhibitörleri EGFR mutant ve wild type hücre serilerinde CLDN ekspresyonlarına farklı yönde etki etmiştir. Anahtar kelimeler: akciğer kanseri; sıkı bağlantılar; claudin; EGFR
Amiloid β (1-42) ile indüklenen alzheimer hastalığı deney modelinde hidroksipropil-β-siklodekstrin (HP- β -CD) ve HP-CD içeren polimerik nazal mikrokürelerin bazı pro-inflamatuar mRNA ve CAV-1 mRNA ekspresyonu üzerindeki etkilerinin araştırılması
Beyinde amiloid (Aβ) plakların birikimi Alzheimer hastalığı (AH)'nın nöropatojenezinde rol oynayan anahtar olaylardan biridir. Bu süreçte hastalığın gelişimine neden olan faktörlerden biri de nöroinflamasyondur. Aβ kaynaklı nörotoksik süreçte rol oynayan en önemli nörotoksisitedeki nedensel rolü sebebiyle nöronal membranlardaki "lipid sal" yapılarının hedeflenmesi ve bu yapılardaki kolesterol düzeylerinin değiştirilmesi AH için nöroprotektif bir yaklaşım olarak düşünülmektedir. Bir siklodekstrin (CD) türevi olan 2-hidroksipropil-β-siklodekstrin (HP-β-CD)'in membran kolesterol düzeyini seçimli olarak değiştirebildiği öne sürülmektedir. Bu çalışmada sıçanlarda amiloid β- peptid (1-42)'nin stereotaksik olarak beyine uygulanmasıyla oluşturulan Alzheimer hastalığı deney modelinde tek başına 2-hidroksipropil-β-siklodekstrin (HP-β-CD) veya HP-β-CD yüklü polimerik nazal mikrokürelerin nöroprotektif etkileri incelenmiştir. Bu amaçla beyin korteks dokularında kolesterol bağlayıcı bir protein ve lipid sal yapılarının bir elemanı olarak Cav-1 mRNA ve temel bir nöroinflamasyon göstergesi olarak da NF-κB mRNA ekspresyon düzeyleri temel moleküler biyolojik yöntemler kapsamında saptanmıştır. Sonuçlarımıza göre Aβ (1-42) uygulaması korteks dokusunda Cav-1 mRNA ekspresyon düzeylerini azaltmış, NF-κB mRNA ekspresyon düzeylerini artırmaktadır. Aβ (1-42) uygulamasına karşı tek başına HP-β-CD veya HP-β-CD yüklü polimerik nazal mikrokürelerin uygulanması Cav-1 mRNA ekspresyon düzeyini yükseltirken, NF-κB mRNA düzeylerini düşürmektedir. Bu bulgular çerçevesinde HP-β-CD'nin AH'na karşı potansiyel bir nöroprotektif yaklaşım olarak ele alınmasının söz konusu olabileceği düşünülmüştür. Anahtar Kelimeler: Alzheimer Hastalığı, 2-hidroksipropil-β-siklodekstrin, Cav-1, NF-κB
Yüksek dozda glikoza maruz bırakılan H9C2 hücre serisinde sırt1 gen ekspresyonu ve sırt1'i hedef alan miRNA'lar arasındaki ilişkinin araştırılması
Bu çalışmanın amacı hiperglisemi ile karakterize olan diyabette SIRT1'i hedef alan miRNA'lar arasındaki ilişkiyi ve SIRT1 gen ekspresyonunun rolünü belirlemektir. H9c2 rat kardiyomiyositleri yüksek dozda glukoza maruz bırakıldıktan sonra SIRT1 ekspresyon düzeyleri RT-PCR ve Western Blot yöntemleriyle analiz edilmiştir. miRNA hedef tahmin algoritmaları kullanılarak, SIRT1'i hedefleyen muhtemel miRNA'lar belirlenmiştir. Detaylı bir şekilde in silico analizler kullanıldıktan sonra SIRT1 genini hedefleyen 86 miRNA belirlenmiştir. miR-181d, miR-135a, miR-135b, miR-181b-1-3p, miR-369-3p, miR-487b, miR-361, miR-204, miR-30d, miR-23a, miR-9 ve miR-323'in ekspresyon düzeyleri anlamlı bir şekilde artmıştır. Çalışmamızda SIRT1 protein düzeylerinin normal doz glukoza göre 1,9 kat arttığı belirlenmiştir. Diyabetik kardiyomiyopati gelişiminde ve önlenmesinde SIRT1'i hedefleyen miRNA'ların etkili olabileceğini ve çalışmamızın daha kapsamlı çalışmalara ışık tutacağını düşünmekteyiz.
Aβ (1-42) ile oluşturulan nörodejenerasyonda nikotinamid uygulamasının nad+ metabolizmasında rol oynayan bazı enzimlerin mRNA ekspresyonları üzerine etkisi
Bu çalışmanın amacı, amiloid β-peptid (1-42) ile oluşturulan deneysel Alzheimer modelinde, endojen bir PARP-1 inhibitörü ve NAD+ öncülü olan nikotinamid uygulamasının NAD+'e bağımlı aktivite gösteren bazı enzimlerin (sirtuinler, CD38, ve PARP-2) mRNA ekspresyonu üzerine olan etkilerinin araştırılmasıdır. Alzheimer hastalığının gelişiminde enerji metabolizmasının bozulması merkezi bir rol oynamaktadır. Glikoz metabolizmasında görevli sitoplazmik ve mitokondriyal enzimlerin aktivitelerindeki değişimler hastalığın seyrini ve şiddetini belirler. Hücredeki metabolik olayların koenzimi olan NAD+ aynı zamanda hücrenin sağ kalımı ve sağlıklı yaşlanmasında rol oynayan sirtuinlerin aktivite göstermesi için gereklidir. Hücre ölüm yolakları ve DNA tamir mekanizmalarında görevli PARP-2 ile hücre içi Ca+2 düzeylerinin regülasyonunda rol oynayan CD38, aktivite için NAD+'e gereklilik gösteren enzimlerdir. NAD+ sentezinde rol oynayan ve NAD+'e bağımlı olarak aktivite gösteren enzimler; obezite, diyabet, kanser ve nörodejeneratif hastalıklarda önemli birer terapötik hedeflerdir. Çalışmamızda Sprague-Dawley sıçanlar kullanılmıştır. Deney gruplarındaki hayvanlar yapılan uygulamaların yedinci gününde dekapite edilip beyinleri çıkarılmış ve kan örnekleri toplanmıştır. Total beyin ağırlıkları alındıktan sonra beyin bölgeleri buz üstünde disekte edilmiştir. Beyin dokusu örnekleri deney gününe kadar -80C'de saklanmıştır. Çalışmamızda kontrol (n=4), Aβ(1-42) (n=4) ve Aβ(1-42) + 100 mg/kg NA (n=4) olmak üzere 3 deney grubu oluşturulmuş ve deney gruplarındaki hayvanların hipokampüsleri kullanılmıştır. Hedef enzimlerin ekspresyon düzeyleri gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (Real-Time PCR) öntemi ile saptanmıştır. Sonuçlar kontrol grubu ile kıyaslandığında Aβ(1-42) uygulaması, SIRT1 kspresyonunu anlamlı bir biçimde azaltırken, hipokampüste SIRT2, PARP-2, CD38 ekspresyonlarında herhangi bir değişime neden olmamıştır. Aβ'ya karşı nikotinamid uygulaması ise Aβ'nın neden olduğu SIRT1 ekspresyonundaki azalmayı anlamlı bir şekilde artırmıştır. SIRT1 ekspresyonundaki bu yükseliş artan NAD+ miktarı ile ilişkili olabilir ve hücrenin gen ekspresyonunun, bilişsel ve hücresel fonksiyonlarının düzenlenmesinde, Alzheimer hastalığı modelinde oluşabilecek plak miktarının azalmasında nöroprotektif etki gösterebilir. Aβ'ya karşı NA uygulaması, aynı zamanda CD38 ekspresyonunda kontrol grubuna göre anlamlı bir artışa neden olmuştur. İkincil haberci reaksiyonlarında aktif rol alan CD38 enzim miktarının artması kalsiyum (Ca+2) iyon salınımı ile hücrenin yaşamsal fonksiyonlarının düzenlenmesini sağlayabilir. Hipokampüsteki PARP-2 ve SIRT2 ekspresyonundan elde ettiğimiz sonuçlara göre gruplar arasında anlamlı bir farklılık bulunmamıştır. Yapılan çalışma sonucunda Aβ(1-42) ile oluşturulan nörodejenerasyonda nikotinamid uygulamasının NAD+ metabolizmasında rol oynayan SIRT1 ve CD38 enzimlerinin ekspresyonuna olan etkisinin nikotinamidin nöroprotektif rolüne katkısı olabileceği vurgulanmıştır. Alzheimer hastalığı ve diğer nörodejeneratif hastalıklarda SIRT1 ve CD38 üzerindeki düzenleyici etkisi ile nikotinamid umut vaat eden nöroterapötik bir ajan olabilir.
Aktif tüberküloz hastalarında depresyonla ilişkilendirilmiş miRNA'ların ekspresyonlarının araştırılması
Tüberküloz (TB) kronik, bulaşıcı ve ölümcül bir hastalıktır. Mevcut tahminler dünya nüfusunun 1/4'ünün Mycobacterium tuberculosis (Mtb) ile enfekte olduğunu göstermektedir. Hem fiziksel hem de zihinsel olarak zayıflatıcı bir hastalık olan Depresyon (DP) eş zamanlı olarak TB'ye yüksek oranlarda eşlik etmektedir ve aralarında sinerjik bir etkileşim görülmektedir. Küçük kodlayıcı olmayan bir RNA türü olan mikroRNA'lar (miRNA) ise işlevlerini yerine getirmek için hedef mRNA'larının ifadesini kontrol etmektedir. Bu çalışmada, TB ve DP arasındaki sinerjik etkiyi değerlendirmek amacıyla DP ile ilişkilendirilmiş miR-128-3p, miR-34a-5p, miR-223-3p, miR-221-3p, miR-24-3p, miR-107, miR-134-5p, miR-135a ve miR-1202'nin aktif TB hastalarında ekspresyon düzeyleri araştırılmıştır. TB Hasta grubuna, aktif TB tanısı almış ve tedavisi başlamamış bireyler (n=35), Kontrol grubuna ise sağlıklı bireyler (n=35) dahil edilmiştir. miRNA'ların ekspresyon düzeyleri Real-Time PCR yöntemi ile tespit edilmiştir. TB Hasta grubu, Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında miR-128-3p, miR-34a-5p, miR-223-3p, miR-221-3p, miR-24-3p, miR-107, miR-134-5p ve miR-135a ekspresyon düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı artış olduğu belirlenmiştir. miR-1202 düzeyleri değerlendirildiğinde ise gruplar arasında farklılık gözlenmemiştir. DP hastalarında artış gözlenen miR 34a-5p, miR-128-3p, miR-223-3p, miR-221-3p ve miR-24-3p'nin, bu çalışmadaki TB hastalarında da anlamlı artışı saptanmıştır. Bu sonuç TB ve DP'nin patogenezinde bu miRNA'ların ortak olarak yer aldığını ve bu iki hastalık arasındaki sinerjide etkili olabileceğini destekler niteliktedir. TB hastalarında miR-135a, miR-107, miR-24-3p ve miR-134-5p ekspresyon düzeylerinde anlamlı artış gözlenmiştir. DP'de düşük ekspresyona sahip miR-134-5p, miR-135a ve miR-107'nin ise TB'de anlamlı artış gösterdiği saptanmıştır. Sonuç olarak TB hastalarında artış gösteren miR-135a, miR-107, miR-24-3p ve miR-134-5p yeni biyobelirteç olarak değerlendirilebilir. Ayrıca TB ve DP hastalarında artış gösteren miR-34a-5p, miR-128-3p, miR-223-3p, miR-221-3p ve miR-24-3p'nin her iki hastalığın ortak yolizlerindeki mediyatörler ile ileri çalışmalarının yapılması TB ve DP arasındaki sinerjinin tanımlanmasına katkı sağlayacaktır.
Endometrial kanserde PI3K/AKT/mTOR sinyal yolağını etkileyen miRNA'ların araştırılması
Endometrial kanser dünya genelinde kadınlar arasında oldukça yaygınlık gösteren bir kanser tipidir. PI3K/AKT/mTOR sinyal yolağının düzensizliği birçok kanser tipinin patogenezinde rol oynamaktadır. Bu çalışmada PI3K/AKT/mTOR yolağını etkileyen miR-7-5p, miR-17-5p, miR-21-5p, miR-145-5p, miR-155-5p, miR-206, miR-221-3p ve miR-222-3p' nin endometrial kanserde in siliko analizleri ve ekpresyon düzeyleri araştırılmıştır. Bu çalışmaya endometrioid adenokarsinom tanısı almış Grade 1 (n=16), Grade 2 (n=16) ve Grade 3 (n=16) arşiv dokuları ile endometrial kanser tanısı almamış Kontrol 1 (n=16) sekretuar faz ve Kontrol 2 (n=16) proliferatif faz sağlıklı endometrium arşiv dokuları dahil edilmiştir. İn siliko analizlerle miRNA'lar ile hedef genleri arasındaki moleküler etkileşimler incelendi. İn siliko analizlerle miR-7-5p'nin hedefleri PIK3CD, PIK3R3, PIK3CB ve AKT3, miR-17-5p'nin hedefleri PIK3R1 ve AKT3, miR-21-5p'nin hedefi PIK3R1, miR-125b-5p'nin hedefi PIK3C2B, miR-145-5p'nin hedefi AKT3, miR-155-5p'nin hedefleri PIK3CA ve PIK3R1, miR-206'nın hedefi PIK3C2A, miR-221-3p ve miR-222-3p'nin hedefi PIK3R1 ve miR-223-3p'nin hedefi PIK3C2A olarak belirlendi. miRNA ekspresyon analizleri RT-PCR yöntemi kullanılarak yapıldı. miR-7-5p ve miR-206'nın ekspresyonları Kontrol 1 ve Kontrol 2'ye göre Grade 1, Grade 2 ve Grade 3 'de (p<0,05). miR-145-5p ekspresyonu Grade-1'de Kontrol-1 ve Kontrol-2'ye göre Grade-2 ve Grade-3'te Kontrol-2'ye (p<0,05) göre azaldığı gözlendi. miR-17-5p ve miR-222-3p'nin ekspresyonlarının Kontrol-1 ve Kontrol-2'ye göre Grade 1, Grade 2 ve Grade 3 'de arttığı saptandı (p<0,05). miR-221-3p ekspresyonun Grade-1 ve Grade-3'te Kontrol-1 ve Kontrol-2'ye göre, Grade-2'de ise Kontrol-1'e göre arttığı tespit edildi (p<0,05). miR-21-5p ve miR-155-5p ekspresyon düzeylerinde gruplar arasında istatiksel olarak anlamlı farklılık gözlenmedi. Sonuç olarak; Endometrial Kanserde PI3K/AKT/mTOR sinyal yolağında etkinliği tespit edilen miRNA'lar moleküler hedefe yönelik tedavi ve tanı stratejilerinin geliştirilmesine katkı sağlayacaktır.
Pandemik SARS-COV-2 enfeksiyonu geçiren hastalarda miRNA araştırılması
Amaç: SARS-CoV-2'nin konak bağışık yanıtını tetiklediği ve buna bağlı olarak semptomlara neden olduğu bilinmektedir. Özellikle gen ekspresyonunu ve protein fonksiyonunu düzenlemede etkili miRNA'lar, viral hastalıklarda rol almaktadır. MiRNA (miR) ekpresyonundaki değişiklikler hedef proteinlerin yapısında ve işlevlerinde değişikliklere neden olarak hastalıkların patogenezine katkıda bulunabilmektedir. Çalışmamızın amacı, SARS-COV-2 ile enfekte hastaları sağlıklı kontrol grubuyla karşılaştırarak miR-19a-3p, miR19b-3p, miR-21, miR-26a-5p, miR-146a, miR-let-7b-3p, miR-155, miR-16, miR-590, miR-1307-3p serum düzeylerini ölçerek klinik tabloyla ilişkisini belirlemektir. Yöntem: Çalışmaya PZR yöntemi ile COVID-19 tanısı konan 70 hasta ve herhangi bir hastalığı olmayan 30 kontrol grubunun kan örnekleri dahil edildi. Hastalar hafif, orta, ağır olmak üzere üç gruba ayrıldı. MiRNA izolasyonu amacıyla SanPrep Column MicroRNA Mini-Prep kiti (Bio Basic Inc., Toronto, Kanada) kullanıldı. Daha sonra miRNA'dan cDNA elde edilmesi miRNA All-In-One cDNA Synthesis kit (Applied Biological Materials (ABM) Inc., Richmond, Kanada) ticari kiti ile gerçekleştirildi. MiRNA seviye ölçümleri ise real time PZR kiti (ABM Inc., Richmond, Kanada) ile yapıldı. Relatif ekspresyonların hesaplanmasında Livak'ın ΔΔCT metodu kullanılarak 2(–ΔΔCT) değerleri hesaplandı. Bulgular: MiR-1307-3p, miR-146, miR-26a-5p, miR-21, miR-19a-3p, miR19b-3p, miR-let-7b-3p'nin serum ekspresyon düzeyleri COVID-19 hastalarında daha yüksek tespit edildi. COVID-19 hastalarında miR-1307-3p, miR-146, miR-26a-5p, miR-21, miR19b-3p, miR-let-7b-3p istatistiksel olarak anlamlıydı (p<0.05). MiR-16'da aşağı regülasyon gözlendi. Hasta grupları arasında miR ekspresyon düzeyleri farklılık gösterdi. Sonuç: Konak-virüs etkileşimleri göz önüne alındığında, miRNA'ların COVID-19'da hem terapötik hedef olabileceğini hem de hastalığın patogenezini anlamaya yardımcı olacağını düşünüyoruz. Hastalığın patogenezinin anlaşılmasında in vivo ve in vitro deneyler ile birlikte klinik çalışmalarının yapılması önem arz etmektedir.