Signal transduction
150 theses under this subject heading
APC mutant fare modelinde azaltılmış BDNF ekspresyonunun intestinal tümör gelişimi üzerine etkilerinin araştırılması
Wnt sinyalini negatif yönde düzenleyen adenomatöz polipozis koli (Apc) tümör baskılayıcı genindeki mutasyon, kolon kanserlerinde en çok rastlanan mutasyondur. Wnt sinyal yolağı nın düzenlediği genlerden biri olan beyin türevli nörotrofik faktör Bdnf ), kolorektal kanser ler gibi birçok tümör dokusunda yüksek seviyede ifade olur . Bu tez çalışmasında; Apc mutant farelerde Bdnf ekspresyonundaki azalmanın intestinal tümör gelişimine etkilerini araştırmak amaçlanmıştır. Bu kapsamda; 36 hafta boyunca Apc+/-, Bdnf+/-, Apc+/-Bdnf+/- ve yabanıl tip fare deney ve kontrol gruplarını takip ettik ve Bdnf mutasyonunun Apc mutant fareler üzerindeki etkilerini fenotipik ve moleküler düzeyde araştırdık. Deneyler sonucunda; Apc+/- ve yabanıl tip farelere kıyasla, Bdnf+/- dişi ve erkek fare gruplarında; grubun yarısı normal vücut ağırlığına sahipken diğer yarısında belirgin bir kilo artışı olduğu gözlemlendi. Benzer kilo alım ı eğilimi Apc Bdnf farelerde de gerçekleşti. Apc Bdnf fareler de , Apc farelere kıyasla, ilk 6 ay boyunca anemi, zayıflama, kürkte bozulma, postürde bozulma gibi hastalık fenotip leri gö rülmedi . Apc+/- Bdnf+/- farelerin sağkalım süreleri, Apc+/- farelere göre yaklaşık 2 ay kadar arttı. Apc farelerde Bdnf ifadesinin azaltılması ; ince bağırsaktaki poli p sayısını az miktarda azaltırken, kolondaki polip sayısını belirgin olarak artı rdı . Apc+/ Bdnf+/ farelerin tümörlerinde; Bdnf, Trk B , beta katenin ve Lgr5 gen ifadeleri ile matür ve immatür Bdnf ve beta katenin protein düzeyi, Apc farelere göre azaldı, böylelikle kök hücre dinamiklerinin de değişebileceği düşünüldü. Bu çalışma sonucunda; Apc mutasyonu ile başlayan intestinal tümörlerde tedavi için BDNF'in önemli bir aday molekül olabileceği ni düşünmekteyiz.
Investigating the effects of PKNOX2 and its interactors in P53 pathway regulation in bone marrow mesenchymal stem cells
Mesenchymal Stem Cells (MSC) are good platforms to study in-vitro molecular mechanisms. Like all cells, MSCs detect and respond to various stimuli with molecular signal mechanisms. p53 signal pathway is a well-known molecular mechanism for transduction of cellular stresses such as DNA damage. p53 signal pathway is heavily regulated in both transcription and post-translational modification of its elements. PKNOX2, a member of TALE homeodomain protein family, is a transcriptional activator of p53. In a previous study by Günel-Özcan lab group, protein interactors of PKNOX2 were determined by proteomics analysis following Co-immunoprecipitation. For this study, the interactors of PKNOX2 from proteomics was compared with the interactors of p53 obtained from BioGRID database and two proteins, DNAJA1 and RPS3 were selected as possible common interactors with possible signaling functions under stress conditions. In this study, three different sources of DNA damage stress, H2O2, DEB and γ-Irradiation were applied to human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells (BM-MSC) and protein expression levels of DNAJA1, RPS3, p53 and PKNOX2 were measured with western blotting. PKNOX2 expression was found to be decreasing in DEB and γ-Irradiation significantly, p53 expression was found to be increasing in H2O2 application significantly. Expression levels of RPS3 and DNAJA1 were found to be stable under stress. Co-Immunoprecipitation was performed with anti-PKNOX2 and anti-p53 antibodies but the results were inconclusive for any interactions. Co-immunoprecipitation protocol was improved. Further study with this improved protocol is needed to unveil these interactions.
İn vitro ortamda insülin reseptör substrat 1 (IRS1) bağımlı sinyal iletim ağının glioblastoma multiforme gelişimindeki rolünün belirlenmesi
Beynin temel enerji kaynağı glukozdur ve beyin, glukozu yoğun bir şekilde kullanmaktadır. Dolayısıyla beynin fizyolojik rolünü yerine getirmesi, glukoz metabolizmasının sıkı bir şekilde kontrolü ile sağlanmaktadır. İnsülin Reseptör Substrat (IRS) proteinleri, glukoz metabolizmasının regülasyonunda rol alan en önemli adaptör proteinlerdir. IRS1 bu protein ailesinin üzerinde en çok çalışılan elemanıdır. IRS1, kanserle ilgili birçok reseptörle etkileşime geçmektedir ve literatürde IRS1'in meme, akciğer, prostat, böbrek gibi birçok kanser türünde ekspresyon artışı gösterilmiştir. Yapılan çalışmalarda merkezi sinir sistemi tümörlerinden biri olan medulloblastomda da IRS1 ekspresyonunun arttığı gösterilmiştir. Bizde bu bilgiler ışığında, IRS1'in merkezi sinir sisteminin bir diğer önemli tümörü olan glioblastoma multiforme (GBM) gelişiminde de böyle bir ekspresyon artışı olabileceğini düşündük. Buradan yola çıkarak in vitro ortamda IRS1 bağımlı sinyal iletim ağının GBM gelişimindeki rölünü belirlemeyi amaçladık. Çalışmada, U-87 MG hücre hattı kullanıldı. IRS1 proteinin ekspresyonunu U-87 MG hücrelerinde arttırmak amacıyla pcDNA3.1-flag tagged-insan IRS1 ekspresyon vektörü lipofektamin aracılığı ile hücrelere transfekte edildi. Ektopik IRS1 ekspresyon artışının GBM hücrelerinin sağkalımı üzerindeki fonksiyonel etkisi MTT analizi, insülin sinyali üzerindeki moleküler etkisi western blot analizi ile belirlendi. Elde ettiğimiz sonuçlar, ektopik IRS1 ekspresyon artışının GBM hücre sağkalımını arttırdığını göstermektedir. Ayrıca, IRS1 ekspresyon artışının, insülin indüklü Grb2, ERK ve AKT proteinlerinin aktivasyonlarında artış gerçekleştirdiği saptanmıştır. Çalışmamız, GBM hücrelerinde IRS1 ekspresyon ve aktivasyon artışının, hücre sağkalımını AKT aktivasyonu aracılığıyla arttırdığını ortaya koymaktadır. Anahtar Kelimeler: Beyin Tümörleri, Glioblastoma Multiforme, IRS1, İnsülin Reseptör Substrat Proteinleri (IRS), İnsülin Sinyali.
Sodyum florür (NAF) uygulanmasının PI3K/AKT sinyal yolağı üzerine etkisinin in vitro olarak araştırılması
Korkmaz R, Sodyum Florür (NaF) uygulanmasının PI3K/AKT sinyal yolağı üzerine Etkisinin in vitro olarak araştırılması. Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Biyokimya (Veteriner) Anabilim Dalı, Yüksek Lisans Tezi, Van, 2020. Bu tez çalışması, yüksek elektronegativiteye sahip flor elementinin neden olduğu hücre içi moleküler mekanizmaların düzenlenmesinde önemli bir role sahip PI3K/AKT yolağına olan etkisini ortaya koymak amacıyla plandı.Bu amaçla, flordan ençok etkilenen dokuların başında böbrek dokusu geldiği için çalışma materyalı olarak NRK-52E rat böbrek epitel hücresi seçildi. Çalışmada flor kaynağı olarak NaF kullanıldı. Uygulanacak NaF konsantrasyonu MTT canlılık testi ile belirlendi. NaF konsantrasyonları 24 saat için proliferasyon artırıcı konsantrasyon olan (10 μM) ve sitotoksik konsatrasyonlar olan IC25 (2250 μM) ve IC50 (4250 μM) olarak belirlendi ve uygulandı. Çalışmada PI3K/AKT yolağında önemli role sahip olan genler ERBB2, PI3K, AKT ve mTOR genleri ile TP53 geni hedef genler olarak düşünüldü. Belirlenen NaF konsantrasyonu hücrelere uygulandı ve 24 saatin sonunda çalışma gruplarında total mRNA izole edildi. Elde edilen mRNA'lar cDNA'ya çevrildi. Elde edilen cDNA'lar kullanılarak hedef genlerin ekspresyon seviyeleri gerçek zamanlı-qPCR yöntemiyle tespit edildi. Çalışma sonunda elde edilen sonuçlara göre düşük konsantrasyonda verilen NaF konsantrasyonun ERBB2, PI3K, AKT genlerini ekspresyonunu artırdığı, yüksek konsantrasyonda ise değiştirmediği tespit edildi. mTOR ise verilen tüm konsantrasyonlarda ekspresyonunun azaldığı ortaya konuldu. TP53 geni ise düşük konsantrayonda değişmediği, yüksek konsantrasyonda ise artış gösterdiği belirlendi. Yapılan çalışmadan elde edilen sonuçlar ve literatürlere göre, florun PI3K/AKT yollağında yer alan kinaz enzimlerini inhibe edebileceği ve bunun sonucunda bazı genlerin ekspresyonunun azalmasına veya artışına neden olabileği sonucuna varılabilir. Özet olarak NRK-52E böbrek epitel hücre serisinde florun neden olduğu hücre hasarının patogenezinde PI3K/AKT/mTOR yolağı önemli bir sinyal yolağıdır
Transkateter kapatma yapılan atriyal septal defekt tanılı hastalarda kalbin ileti sisteminin değerlendirilmesi
Amaç: Bu çalışmada ASD tanılı hastalarda kalbin ileti sisteminin değerlendirilmesi ile kapatma öncesi ve sonrasında klinik, elektrokardiyografik ve laboratuvar bulgularının incelenmesi, prognoz ve sağkalıma etki edebilecek faktörlerin belirlenmesi amaçlanmıştır. Yöntem: Van Yüzüncü Yıl Üniversitesi (YYÜ) Tıp Fakültesi Çocuk Kardiyoloji Bilim Dalı'nda Şubat 2016 - Haziran 2020 tarihleri arasında izlenen ve transkateter kapatma yapılan ASD tanılı hastaların dosyaları retrospektif olarak incelenmiştir. ASD olgularının sonuçları kontrol grubu ile ve ASD olgularında kapatma işlemi öncesi ve sonrasında kardiyak parametreler karşılaştırılmıştır. Bulgular: ASD tanısı ile tedavi edilen olguların %42,5'i, kontrol grubunun %52,5'i erkekti. ASD olgularının yaş ortalaması 8,8 ± 4.5, kontrol grubunun 9,6 ± 3,9'du. ASD olguları ve kontrol grubu arasında cinsiyet ve yaş açısından anlamlı fark yoktu (p>0,05). Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, ASD olgularının sistolik kan basıncı istatistiksel olarak anlamlı düzeyde daha düşüktü (p=0,025). ASD olguları ile kontrol grubu arasında vücut ağırlığı, kalp tepe atımı ve diyastolik kan basıncı değerleri bakımından istatistiksel olarak anlamlı fark yoktu (p>0,05). Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında ASD olgularının kalsiyum düzeyi istatistiksel olarak anlamlı düzeyde daha fazlaydı (p<0,001). ASD olguları ile kontrol grubu arasında diğer laboratuvar değerler açısından istatistiksel olarak anlamlı fark yoktu (p>0,05). Kontrol grubunun EKG parametreleri ile karşılaştırıldığında, ASD olgularında transkateter kapatma öncesi Pmin, QTcmin süreleri istatistiksel olarak anlamlı düzeyde daha kısa, Pdis, QTdis, QTcdis süreleri istatistiksel olarak anlamlı düzeyde daha uzundu (p<0,05). Kontrol grubunun EKG parametreleri ile karşılaştırıldığında, ASD olgularında transkateter kapatma sonrası Pmax, Pmin, QTcmin süreleri istatistiksel olarak anlamlı düzeyde daha kısa; QTmax, QTdis, QTcdis süreleri istatistiksel olarak anlamlı düzeyde daha uzundu (p<0,05). ASD olgularında transkateter kapatma öncesi EKG parametreleri ile karşılaştırıldığında, transkateter kapatma sonrası Pmax, Pdis süreleri istatistiksel olarak anlamlı düzeyde daha kısa; QTmin süresi istatistiksel olarak anlamlı düzeyde daha uzundu (p<0,05). Sonuç: Çalışmamızda ASD olgularında transkateter kapatma öncesine kıyasla kapatma sonrası grupta Pmax ve Pdis süreleri kısalırken, QTmin süresinin uzadığı saptandı. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında ise ASD kapatma öncesi grupta Pmin ve QTc min süreleri daha kısa; Pdis, QTdis ve QTc dis süreleri ise daha uzun saptandı. ASD olgularında transkateter kapatma tedavisinin atriyal ve ventriküler aritmiler üzerine etkinliğini gösteren daha fazla sayıda hasta ile prospektif 24 saatlik EKG ve/veya daha uzun EKG kayıtlarını da içeren elektrofizyolojik çalışmalara ihtiyaç vardır.
APC mutant fare intestinal organoidlerinde WNT yolak modülasyonunun kök hücreler üzerine etkilerinin araştırılması
Kolorektal kanser (KRK) gelişiminin en önemli nedenlerinden bir tanesi WNT sinyal yolağında rol alan genlerin mutasyonlarıdır. Vakaların büyük çoğunluğunda WNT sinyal yolağı yıkım kompleksinde negatif düzenleyici olarak görev almakta olan APC tümör baskılayıcı gen mutasyonlarına rastlanmaktadır. Çok hızlı bir çoğalma ve yenilenme sürecine sahip olan intestinal epitel hücrelerde WNT sinyal yolağı yüksek aktivite göstererek intestinal kök hücrelerin ve doku homeostazının düzenlenmesinde aktif görev almaktadır. APC genine ait mutasyonların çoğunluğu yıkım kompleksinin bir diğer elemanı olan AXIN bağlanma bölgesinde gerçekleşmektedir. Yıkım kompleksi elemanlarında oluşan çeşitli mutasyonlar nedeniyle görevini tam olarak yerine getirememektedir. Β-catenin proteini yıkım kompleksi tarafından sitoplazmik bölgede proteozomal degradasyona uğrayamadığında çekirdeğe translokasyonu gerçekleşmekte ve böylece TCF/LEF transkripsiyon faktörünün düzenlenmesinde görev aldığı WNT hedef genlerinin transkripsiyonel aktivitesini arttırmaktadır. Bu tez çalışması kapsamında laboratuvarıma özgü mutant ApcΔ750 fare ince bağırsak dokularından üretilen olan intestinal organoidlerde WNT ilişkili genlerden Ctnnb1, Axin2 ve Lgr5 RNA düzeyinde incelenmiştir. Analizlerin sonucunda bu genlerin ifadelerinin ApcΔ750 intestinal organoidlerde yüksek olduğu ispatlanmıştır. Tez çalışmasının birincil amacı olarak, anti-kanser etkisi olduğu bilinen XAV939 ve Niklozamit ilaçlarının ApcΔ750 organoidlere uygulandığında Ctnnb1, Axin2 ve Lgr5 gen ifadelerinin RNA düzeyinde azaldığı gösterilmiştir. Ayrıca immünfloresan boyama tekniği uygulanarak kript ve villus domeynlerindeki Ctnnb1 protein seviyesi incelenmiştir. Böylece XAV939 ve Niklozamitin KRK oluşumu öncülü organoidlerdeki Wnt sinyal yolağını inhibe ettiği ve bununla ilişkili olarak İKH aktivasyonunu baskıladığı gözlenmiştir. Çalışmanın ikincil bir amacı ise laboratuvarımızda üretilen ApcΔ750 fare modelinin in vitro çalışmalarda da başarı sağladığını gösterebilmektir.
Bimodal koklear implant kullanıcılarında, sinyal işleme zaman senkronizasyonunun gürültüde konuşmayı ayırt etmeye etkisi
İşitme kaybının rehabilite edilmesinde kullanılan işitme cihazı amplifikasyonu ve koklear implant uygulaması geliştirilen yeni teknolojiler sayesinde, kullanıcının işitsel ve konuşmayı algılama performansını artırmaktadır. Bimodal kullanıcıların binaural işitmenin sunduğu avantajlardan yararlandığı yapılan çalışmalarda gösterilmiştir. Bu avantajlar her bireyde farklı olabilmektedir. Bunun nedenlerinden biri implante olmayan kulakta var olan rezidüel işitme miktarı ile açıklanmaktadır. Bimodal kullanımda ortaya çıkan sorunlardan bir tanesi bu iki farklı uygulamadan kaynaklı gecikme uyumsuzluğudur. Bu gecikme uyumsuzluğu süresi 3 ile 11ms arasında değişebilmektedir. MED-EL koklear implant teknolojisi yeni işlemci modellerinde kullandığı Tam Bimodal Senkronizasyon özelliği ile işitme cihazında sinyal işleme gecikme uyumsuzluğundan kaynaklanan probleme çözüm aramaktadır. Çalışmamızda Tam Bimodal Senkronizasyon modunun gürültüde konuşmayı ayırt etmeye etkisi değerlendirilmiştir. Çalışmamızda koklear implantlı, bimodal ve Tam Bimodal Senkronizasyon modunda Türkçe Matriks Testi ile değerlendirme yapıldı. Elde edilen kritik Sinyal Gürültü Oranı(SGO) değerleri karşılaştırıldığında; bimodal uyarım ile koklear implantlı kullanım arasında istatiksel olarak anlamlı fark çıktı (p<0,01). Bu sonuçlar literatür de yapılan çalışmaları desteklemektedir. Bimodal uyarım ile Tam Bimodal Senkronizasyon modunda elde edilen kritik SGO değerleri karşılaştırıldığında ise istatiksel olarak anlamlı fark çıkmadı(p=0,204; p>0,05). Ancak Tam Bimodal Senkronizasyon modundaki kritik SGO değerleri bimodal uyarıma göre düşük elde edildi (Koklear implantlı kritik SGO: 18,14±12,89, Bimodal kritik SGO: 9,49±12,25, Tam Bimodal Senkronizasyon modunda kritik SGO: 6,26±8,45). Tam Bimodal Senkronizasyon modunda serbest alanda sessizlikte yapılan Konuşmayı Ayırtetme(Speech Diskriminasyon=SD) testinden elde edilen skorlar, koklear implantlı ve bimodal uyarımda yapılan SD skorları ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı fark çıktı (p=0,001; p<0,01). Tam Bimodal Senkronizasyon modunda SD skorlarının yükseldiği gözlendi. Aynı şekilde koklear implantlı ve bimodal uyarımda yapılan SD skorları karşılaştırıldığında istatiksel olarak anlamlı fark çıktı(p=0,001; p<0,01). Çalışmanın sonuçları gürültüde ve sessizlikte Tam Bimodal Senkronizasyon modunun konuşmayı ayırt etme yeteneğini artırdığı yönündedir. Ancak çalışmadaki sınırlılıklar nedeniyle daha fazla araştırmanın yapılması gerekmektedir. Anahtar Kelimeler: Koklear implant, işitme cihazı, bimodal uyarım, Tam Bimodal Senkronizasyon, kritik SGO, Türkçe matriks testi
Fenilketonüride öğrenme bellek mekanizmasının dişi ve erkek sıçanlarda CAMP/PKA/CREB/BDNF Yolağı Üzerinden İncelenmesi
Fenilketonüri, fenilalanin hidroksilaz enzim eksikliği ile karakterize nadir görülen bir kalıtsal metabolik hastalıktır. Bu enzimin yokluğu kan fenilalanin seviyesini yükselterek, beyinde fenilalanin birikmesine ve geri dönüşümsüz nörolojik hasar oluşması ile öğrenme ve belleği olumsuz yönde etkilemektedir. Hipokampus, öğrenme ve bellek gibi beyin fonksiyonlarında önemli roller oynar. cAMP /PKA /CREB/BDNF yolağının yapılan çalışmalar ile uzun süreli öğrenme ve bellek ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Bu tez kapsamında fenilketonüride bozulan öğrenme bellek mekaniz- masının dişi ve erkek sıçanlarda cAMP/PKA/CREB/BDNF yolağı ile ilişkisi incelendi. Fenilketonüri modeli oluşturmak için feninalanin hidroksilaz enzim inhibitörü 4-Cl-fenilalanin ve fenilalanin subkutan enjeksiyon ile 6 günlük sıçan yavrularına uygulandı. Lokomotor aktivite, yeni nesne tanıma ve pasif sakınma testleri yapıldı. Hipokampal dokuda cAMP /PKA /CREB /pCREB/BDNF metabolit miktarları, protein ifadeleri ve RT-qPCR ile PKA, CREB, BNDF, AChE ve BChE'ın mRNA ifadeleri analiz edildi. Cinsiyete göre analizlerde erkek PKU sıçanların dişi PKU sıçanlara göre lokomotor aktivitesinin azaldığı bulundu. PKU grubu erkek sıçanlar AChE, BChE, CREB ve BNDF mRNA seviyeleri, dişi PKU sıçanlarda CREB ve BNDF seviyelerinin azaldığı belirlendi. PKU erkek sıçanların PKA aktivitesi azalırken, dişi PKU sıçanların arttığı bulundu. pCREB/CREB oranı ise PKU dişilerde azaldığı tespit edildi. Sonuç olarak PKU modelinde BNDF yolağı ve kolinerjik sistem elemanlarının seviyelerinin cinsiyete göre farklılık gösterebileceği saptandı.
BMPR1A'nın plazma hücrelerinin gelişimine etkisinin ve germinal merkez dinamiklerindeki öneminin araştırılması
Bone morfogenetik protein reseptör 1A (BMPR1A) sinyal yolağı erişkin ve embriyonik kök hücrelerde aynı zamanda erişkin lenfoid hücrelerde kendini yenileme, çoğalma ve farklılışmayı düzenler. Bu çalışmada, B hücrelerinde kondisyonel Bmpr1a kaybı olan transgenik fareleri ve yeni Bmpr1a.IRES.EGFP fareleri kullanarak BMPR1A'nın germinal merkez dinamiklerini ve kemik iliği plazma hücre kompartmanının oluşumunu düzenlediğini gösterdik. C57Bl/6J (B6) farelerde, Bmpr1a mRNA'sının germinal merkez B hücreleri (GMBH), hafıza B hücreleri (HBH) ve kemik iliği plazma hücreleri (KİPH) içinde yüksek düzeyde olduğunu saptadık. B hücre-spesifik Bmpr1a kaybı olan farelerde, GMBH kompartmanı boyutunun kontrol farelerin % 77'sine düştüğünü ve IgG1+ KİPH kompartmanının kontrol grubunun % 34'üne gerilediğini saptadık. Benzer şekilde, yüksek afiniteli IgG1 ve orta afiniteli IgM antikorları serumda azaldı. T-bağımlı cevapta BMPR1A'nın önemine rağmen, T-bağımsız cevapta BMPR1A sinyali gerekli değildi. Sınıf-değişim mekanizması da Bmpr1a yokluğunda etkilenmedi. İlginç şekilde, Bmpr1a ifadesi Xbp1, IRF-4 ve Blimp1 ifadesi yüksek olan germinal merkez B hücre alt grubuna özgüydü. Bmpr1a.eGFP fare çalışmaları Bmpr1a ifadesinin germinal merkez B hücrelerinde zaman içinde arttığını ve KİPH populasyonunun bir alt-grubunda Bmpr1a'nın yüksek düzeyde olduğunu gösterdi. Genel olarak, bu çalışma BMPR1A sinyalinin germinal merkez dinamiklerinin düzenlenmesinde ve T-bağımlı cevapta kemik iliği plazma hücresi oluşumunda rolü olduğunu gösterdi.
FF-MAS oksisterolünün folikülogenezdeki rolünün ve hedgehog sinyal yolağıyla ilişkisinin incelenmesi
Folikül sıvısında bulunan ve oosit maturasyonunda etkili bir steroid türevi olan FF-MAS oksisterolünün etki mekanizmasıyla ilgili bilgiler sınırlıdır. Hedgehog yolağı (Hh); folikülogenezde kritik öneme sahip granüloza hücre proliferasyonunda etkili bir sinyal yolağıdır ve oosit matürasyonuna katkı sağlar. Hh yolağının hücrede etkisi, transkripsiyon faktörü Gli1'in aktifleşmesini ve hedef genlerin aktivasyonuyla gerçekleşir. Granüloza hücre proliferasyonundaki yetersizlik sebebiyle foliküler gelişimin ilerleyemediği, sonuçta kistik foliküllerin gözlendiği polikistik over sendromu (PKOS) en yaygın endokrin hastalıktır. Çalışmamızda folikülogenezde etkili FF-MAS Hedgehog yolağı aracılığıyla granüloza hücre proliferasyonunu uyarabileceği varsayılmıştır. Bu araştırmanın amacı insan folikülogenezinde, FF-MAS'in granüloza hücre proliferasyonuna etkisini Hedgehog yolağı molekülleri SMO ve Gli1 üzerinden araştırmaktır. Bunun için; sağlıklı ve PKOS hastalarına ait granüloza hücre kültürlerinde, FF-MAS ve yolak inhibitörü siklopaminin SMO ve Gli1 ifadelerine etkisi değerlendirilmiştir. SMO ve Gli1 immünohistokimya ifadeleri ve kantitatif sitoELİZA değerlendirmeleri ile FF-MAS'in bu ifadeleri artırdığı, yolak inhibitörü olan siklopamin uygulanan koşullarda da ifadelerin istatistiksel olarak anlamlı azaldığı saptanmıştır. Sağlıklı kadınlara ait granüloza hücrelerinin SMO ifade değişimi, yolağın son ürünü olan Gli1 ekspresyon değişiminden daha düşük oranda bulunmuştur. Bu sonuçlar, FF-MAS oksisterolünün Hedgehog yolağını kontrole oranla daha fazla aktive ettiğini göstermektedir. Ayrıca PKOS hastalarının hücreleri FF-MAS'e daha iyi cevap vererek Gli1 ve SMO ifadelerini artırmıştır. Bu veriler daha sonraki çalışmalarda FF-MAS - Hedgehog ilişkisinin in vivo olarak ele alınıp, diğer hücre yolaklarıyla da ilişkisinin değerlendirilmesi gerekmektedir.
Prcell: sentetik biyoloji için sinyal yolağı programlamaya yönelik bir yazılım
Sentetik biyoloji, mühendisliğin temel ilkelerinin biyolojiye, özellikle de hücreye uygulanmasına yönelik yeni ve disiplinlerarası bir araştırma alanıdır. Yapay biyolojik sistemler tasarlamayı ve üretmeyi amaçlar. Sentetik biyoloji, hücresel işlevleri değiştirmek veya düzeltmek, hücrenin çevresel koşullara yanıt vermesini sağlamak veya hücresel gelişimi yönetmek için tasarlanıp uygulanabilen yeni sinyal yollarını tasarlamak veya ayarlamak için çok önemlidir. Araştırmacıları biyolojik devre tasarımının elektronikteki entegre devrelerin tasarımına benzeyeceği ve genetik mühendisliğinin yeteneklerini artıracağı bir gelecek bekliyor. Bir hücre programlama dili olarak geliştirilen uygulamaların amacı, canlı hücreler için genetik devreler tasarlamak ve hücrede tasarlanmış genetik devreyi gerçekleştirmektir. Bunlardan biri, elektronik devre tasarım programına dayanan, verilog olan ve elektronik devreleri tasarlamak için mantık kapılarını kullanan Cello'dur. Elektronik devre tasarım mantığının biyolojik devrelere uygulanmasının yeterli olamayacağını düşündüğümüzden, bu tezde prCell adını verdiğimiz biyolojik devrelerin tasarımı için yeni bir programlama dili geliştirdik. prCell'in ana özelliği, herhangi bir elektronik devre tasarımında biyolojik devreyi tasarlamak için kullanılan mantık geçitleri yerine, kullanıcının giriş-çıkış ve kontrol nesnelerini belirleyeceği dinamik yapılara dayanan bir mantığa sahip olmasıdır. Bu, çok büyük ve karmaşık bir biyolojik devre tasarlama esnekliği ve imkanı sağlar. İnternet üzerinden yayınlanacak olan prcell'de bir üyelik sistemi olacağından, kullanıcının bir veritabanı ve kullanıcının bir biyolojik devre tasarım ortamı olacaktır. En önemli hedefimiz sentetik biyoloji ile ilgilenen herkesin sinyal yolunu kolay ve etkili bir şekilde tasarlayıp canlı hücrede uygulayabilmesidir. Hücre içi olayları daha iyi modellemek için, prcell'in kullanıcı taleplerine göre geliştirileceğine ve canlıları yeniden programlamak için farklı bir bakış açısı sağlayacağına inanıyoruz. Anahtar kelimeler: Sentetik Biyoloji, Genetik Devreler, Hücre Programlama
IRE1-JNK yolağı protein-protein ve protein-ligand etkileşimlerinin moleküler dinamik simülasyon yöntemiyle araştırılması
IRE1-JNK yolağı Endoplazmik Retikulum (ER) stresine karşı hücrenin yanıt verdiği en güçlü sinyal yolağıdır. Hipoksi gibi koşullarda aşırı ER stresine bağlı olarak bu yolak üzerinden apoptotik mekanizma tetiklenerek hücre ölümü meydana gelmektedir. Kardiyovasküler hastalıklarda hücreler aşırı ER stresine maruz kalabilmekte ve apoptoza bağlı hücre ve doku kaybı meydana gelebilmektedir. Kardiyovasküler hastalıklarda etkili Statin, ACE İnhibitörleri, Anti-Aritmik İlaçlar ve Flavonoid'lerin IRE1-JNK yolağı üzerindeki IRE1, ASK1 ve JNK1 ile etkileşimi tam olarak bilinmemektedir. Ayrıca IRE1-JNK yolağının en önemli başlatıcı ya da durdurucu faktörü olan BİP-IRE1LD bağlanması bilinmesine karşın bağlanmanın moleküler mekanizması tam olarak aydınlatılamamıştır. Çalışmamızda kardiyovasküler hastalıklarda etkili etken maddeler ve Flavonoid'lerin kendi etkileri dışında IRE1-JNK yolağının inhibisyonunda rol oynayıp oynamadıklarını belirlemek amacıyla IRE1, ASK1 ve JNK1 ile etkileşimleri moleküler kenetleme, moleküler dinamik simülasyon ve serbest enerji hesaplamalarıyla araştırıldı. Ayrıca BİP'in konformasyonel dinamiği ve BİP-IRE1LD etkileşiminin moleküler mekanizmasını aydınlatmak hedefiyle moleküler dinamik simülasyon ve serbest enerji hesaplamaları yapıldı. Olası BİP-IRE1LD bağlanma paternlerini belirlemek amacıyla iri taneli model ve kübik oryantasyonda moleküler dinamik simülasyonlar gerçekleştirildi. Yaptığımız çalışmada BİP'in yüksek esneklikteki SBDα alt domaininin kısa süreli burkulması ve tekrar eski durumuna dönmesi sonucu serbest enerji yüzeyinde minima meydana geldiği gözlendi. Bağlanma konformasyonu bilinen farklı büyüklük ve esneklikte olan Ddi1 ubikuitin benzeri (UBL) domaini-ubikuitin kompleksi (2MWS), ubikuitin-USP2 kompleksi (2HD5), kimerik SDZ CHI621'in fab fragmenti (1MIM) ve Sil1-BİP komplekslerinin (3QML) bağlanma paternini iri taneli kübik oryantasyon yaklaşımı ile doğru tahmin etmek için istatistiksel olarak ROC eğrisi ile hesaplandığında F-değeri ve doğruluğu (ACC) 0,88 olarak ölçüldü. AUROC değeri ise 0,94 olarak belirlendi. BİP-IRELD etkileşiminin olası bağlanma paternleri taneli kübik oryantasyon yaklaşımı ile araştırıldığında, IRE1LD'in 4. bölgesi içinde yer alan düzensiz domainin BİP-NBDIIβ açık formunun kapalı forma göre daha yüksek afinite ile bağlandığı ayrıca BİP-SBDα alt domainin bağlanmada direkt rol oynadığı gözlendi. IRE1, ASK1 ve JNK1 ile kardiyovasküler hastalıklarda kullanılan etken maddeler ile Flavonoid'lerin etkileşimlerinin araştırıldığı bu çalışamada proteinlerin fosforilasyonunun inhibisyonunda Statinler'in en etkili moleküller olabileceği gözlendi. Ayrıca yaptığımız Umbrella Örnekleme Serbest Enerji Hesaplamlarında Statin'lerden Atorvastatin ve Pitavastatin ile Flavonoid'lerden Norizalpin, Chrysin ve Luteolin'in yüksek ortalama kuvvet potansiyelleri ile IRE1-JNK yolağının inhibisyonunda güçlü aday moleküller olabileceği gösterildi. Yaptığımız bu çalışmalar ile belirlenen BİP-IRE1LD bağlanma paterninin BİP ve IRE1LD hedefli ileri teröpatik çalışmalara ışık tutacağı, İri taneli kübik oryantasyon yaklaşımının hızlı ve kolay kullanımı için algoritmalar yazılarak yüksek esneklikteki protein-protein etkileşimlerinin belirlenmesinde kullanımının faydalı olabileceği ve IRE1-JNK yolağı etken madde etkileşimleri sonucu elde edilen veriler ışığında Statinler üzerinden geliştirilerek etken türev maddelerin ER stresi kaynaklı apoptozun önlenmesinde etkili olabileceğine inanmaktayız. Bu araştırmada yer alan kısmi nümerik hesaplamalar TÜBİTAK ULAKBİM, Yüksek Başarım ve Grid Hesaplama Merkezi'nde (TRUBA kaynaklarında) gerçekleştirilmiştir.
Fruktozun pankreas kanseri ve pankreatik inflamasyona etkisi: İn vitro karşılaştırmalı çalışma
AMAÇ: Çalışmamızın amacı fruktozun pankreas kanseri hücrelerindeki etkilerinin araştırılmasıdır. GEREÇ VE YÖNTEM: Çalışmamızda insan pankreas kanseri hücre hattı (PANC-1) kullanılmıştır. Gerçekleştirilen hücre kültürü çalışmasında, hücrelerin in vitro koşullar altında uygun besiyeri (kültür ortamı) kullanılarak flasklar içerisine ekilip bakımları yapılmıştır. Hücrelerin proliferasyonu, pasajları ve takip işlemleri Inverted Mikroskop kullanılarak düzenli olarak incelendi. PANC-1 hücrelerine low glikoz DMEM'de çözülmüş fruktoz ve glikoz ayrı ayrı eklenmiştir. Fruktoz ve glikoz uygulanmayan hücreler kontrol olarak kabul edilmiştir. Etken maddelerin maksimum proliferatif etki değerleri GraphPad Prism v5.0 Software yazılımında hesaplanmıştır. Aynı zamanda fruktoz ve glikozun birlikte etkisini görmek için kombinasyon deneyleri yapılmıştır. Fruktoz, glikoz ve fruktoz+glikoz kombinasyonunun verildiği hücrelerden ve fruktoz, glikoz uygulanmayan kontrol hücrelerini içeren her bir gruptan total RNA izolasyonu için RNeasy Plus Kiti (Qiagen) kullanılmıştır. İzole edilen uygun kalitedeki total RNA'lardan, cDNA sentezi "All-in-OneTM First-Strand cDNA Synthesis Kit" (Genecopoeia) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. cDNA örnekleri kullanılarak genlerin ekspresyon seviyelerini belirmek için "All-in-OneTM qPCR Mix" (Genecopoeia) ile qPCR Array çalışması gerçekleştirilmiştir. Hedef genlerimize (KRAS, NFKB, ERK2) özgül olarak dizayn edilmiş olan primerler kullanılmıştır. Real-time PCR verileri, LightCycler 480 software (Roche) Cycle Threshold (Ct) değerleri kullanılarak web bazlı RT2 Profiller PCR Array Data Analysis version 3.5 (http://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php) ile analiz edilmiştir. BULGULAR: 72. saatte fruktozun ve glikozun hücre hattında proliferasyonu en çok arttıran değeri her iki madde için de 20 mM olarak belirlenmiştir. Her iki maddenin birlikte etkisini değerlendirmek için yapılan izobologram analizine göre, fruktoz ve glikoz kombinasyonunun hücre proliferasyonunu maksimum arttırdığı doz 15 mM olarak bulunmuştur. HGK-DMEM uygulanan hücrelere oranlandığında fruktoz, glikoz ve fruktoz-glikoz kombinasyonu uygulanan hücrelerde sırasıyla 4,46, 3,29 ve 6,52 kat daha fazla NFKB1 ekspresyonu olduğu saptanmıştır. LGK-DMEM uygulanan hücrelere oranlandığında ise fruktoz, glikoz ve fruktoz-glikoz kombinasyonu uygulanan hücrelerde sırasıyla 4,65, 3,43 ve 7,87 kat daha fazla NFKB1 ekspresyonu olduğu saptanmıştır. HGK-DMEM uygulanan hücrelere oranlandığında fruktoz, glikoz ve fruktoz-glikoz kombinasyonu uygulanan hücrelerde sırasıyla 11,47, 7,51 ve 11,93 kat daha fazla NFKB1 ekspresyonu olduğu saptanmıştır. LGK-DMEM uygulanan hücrelere oranlandığında ise fruktoz, glikoz ve fruktoz-glikoz kombinasyonu uygulanan hücrelerde sırasıyla 7,56, 4,95 ve 7,87 kat daha fazla KRAS ekspresyonu olduğu saptanmıştır. HGK-DMEM uygulanan hücrelere oranla fruktoz, glikoz ve fruktoz-glikoz kombinasyonu uygulanan hücrelerde sırasıyla 5,69, 1,4 ve 4,45 kat daha fazla ERK2 geni eksprese edildiği saptanmıştır. LGK-DMEM uygulanan hücrelere oranlandığında ise fruktoz, glikoz ve fruktoz-glikoz kombinasyonu uygulanan hücrelerde sırasıyla 4,5, 1,1 ve 3,52 kat daha fazla ERK2 geni eksprese edildiği saptanmıştır. SONUÇ: Çalışmamız gösterdi ki fruktoz pankreas kanseri hücrelerinde KRAS, ERK2 ve NFKB1 gen ekspresyonunu glikozdan daha fazla arttırmaktadır, fruktoz glikoz ile kombine halde uygulandığında NFKB1 ve KRAS ekspresyonu üzerinde sinerjik etki göstermektedir. Bu genler pankreas kanseri patogenezindeki anahtar yolaklardaki proteinleri kodlamaktadır. Fruktozun kanser metabolizmasında glikozdan farklı metabolize edilmesiyle birlikte bu genlerin ekspresyonunu da arttırması daha sonra yapılacak çalışmalar ile daha iyi anlaşılacaktır. Patogenezdeki yerini aydınlatmak ve fruktoz metabolizmasındaki yolakların tedavi hedefi olarak kullanılıp kullanılamayacağını araştırmak amacıyla yeni çalışmalar yapılmalıdır.
6-hidroksi dopamin (6-OHDA) ile oluşturulan ın vitro parkinson hastalığı modelinde humanin'in nöroprotektif etkisinin araştırılması
24 amino asitli bir peptid olan Humanin (HN), keşfedildikten sonra Alzheimer hastalığı da dahil olmak üzere birçok nörodejeneratif hastalıkta incelenmiştir. HN çok biyoaktif bir peptittir. Böylece, birçok hücre içi ve hücre dışı sinyalleşme mekanizmasını etkiler. HN, PI3k / Akt, JAK / STAT, MAPK / ERK yolları ve IGFBP, Bax proteinleri üzerinden hücre büyümesini, çoğalmasını ve hayatta kalmasını düzenler. Bu çalışmanın amacı, HN'nin 6 hidroksidopamin (6-OHDA) ile indüklenen in vitro Parkinson hastalığı modelinde nöroprotektif bir etkisinin olup olmadığını araştırmaktır. Bu çalışmada Parkinson hastalığının deneysel olarak taklit edilmesi için 6-OHDA ile indüklenen insan nöroblastom hücre hattı (SH-SY5Y) kullanıldı. HN'nin 6-OHDA nörotoksisitesine karşı nöroprotektif etkisi ise mitokondriyal disfonksiyon, apoptoz ve sitotoksisite parametreleri ile değerlendi. Mitokondriyal disfonksiyonun belirlenmesinde MTT, apoptoz'un belirlenmesi için kaspaz-3 ve sitotoksisitenin belirlenmesi için LDH testleri kullanıldı. İstatistiksel analiz için GraphPad Prism 8.0 programı kullanıldı ve gruplar arasındaki farklar tek yönlü ANOVA istatistikleri ile değerlendirildi. Yapılan analiz sonucunda IC50 dozu 233.7 µM olarak belirlendi. MTT testinde elde edilen bulgulara göre, HN tek başına uygulandığında proliferatif bir etkiye sahip değildi (p>0,05). Bununla birlikte, 10 µM ve 20 µM HN içeren 24 saatlik ön işleme hücrelerinin 6-OHDA nörotoksisitesine karşı koruduğu görüldü (p<0,01). LDH testinde, herhangi bir HN doz grubunda laktat dehidrojenaz salınımı saptanmadı. Kaspaz-3 testinde, 20 μM HN ile ön muamelenin, 6-OHDA nörotoksisitesine karşı kaspaz-3 seviyesini düşürdüğü, ancak istatistiksel bir fark yaratmadığı görüldü (p> 0, 05). Anahtar Sözcükler: apoptoz, humanin, mitokondriyal disfonksiyon, nöroprotektif etki, Parkinson hastalığı, sitotoksisite,
Hepatoblastom tedavisinde ve prognozunda radyolojik ve histopatolojik ipuçları
Amaç: Wnt/Beta-katenin sinyal iletim yolu, karaciğer gelişimi ve rejenerasyonunda önemli görevlere sahip bir yolaktır. Bu yolakta meydana gelen anormal bir aktivasyonun hepatoblastom gelişimine neden olduğu bilinmektedir. Bu çalışmada hakkında sınırlı sayıda çalışma olan, beta-katenin proteininin hücre içi ekspresyon özelliklerine göre hepatoblastom hastalarının prognozunu belirlemedeki yerinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Gereç-Yöntem: Mayıs 2004-Kasım 2018 yılları arasında kliniğimizde hepatoblastom nedeni ile opere edilen olguların demografik özellikleri, PRETEXT evreleri, risk sınıflamaları, radyolojik özellikleri, histopatolojik özellikleri, adjuvan-neoadjuvan kemoterapi (KT) protokolleri, KT yanıtları, nüks ve sağ kalım oranları geriye dönük olarak değerlendirildi. Radyolojik görüntülerine ulaşılan olgular radyolog tarafından vasküler tümör tutulumu açısından tekrar değerlendirildi. Olgular beta-katenin proteininin sitoplazmik ya da nükleer ekspresyonuna göre iki gruba ayrıldı. Bulgular iki grup arasında karşılaştırmalı olarak Fisher-Exact testi ile istatistiksel olarak değerlendirildi. p değeri <0.05 anlamlı olarak kabul edildi. Bulgular: Çalışma süresi içerisinde kliniğimize yönlendirilen toplam 41 hasta mevcuttu. Olgulardan dördü dosya kayıtlarına ulaşılamadığı için çalışma dışı bırakıldı. Kalan 37 (E/K: 22/15) olgunun dördünde beta-katenin ekspresyonu negatif, üçünde beta-katenin özellikleri belirtilmemişti. 2 olgu KT toksisitesi nedeni ile tedavi sırasında kaybedildi. On altı hastada sitoplazmik, 12'sinde ise nükleer beta-katenin pozitifliği saptanan toplam 28 olgu değerlendirmeye dahil edildi. Grupların PRETEXT evreleri, risk grupları, KT yanıtları, cerrahi özellikleri, nüks ve sağkalım oranları aşağıdaki tabloda özetlenmiştir. Beta-katenin Sitoplazmik (n) Nükleer (n) p Ortanca yaş (ay) 18 ay (+/-) 16 ay (+/-) PRETEXT (n:28) 1 0 1 2 4 5 3 7 5 4 5 1 Hepatik Ven Tutulumu (n:26) 0.016 V+ 11/14 3/12 V- 3/14 9/12 Portal Ven Involvement (n:26) 0.45 P+ 6 4 P- 8 8 Risk sınıflaması (n:28) >0.05 Standart 1 4 Yüksek 15 8 Kemoterapi yanıtı (n:27) 0.0046 KT yok 2/15 4/12 ≥%50 4/15 8/12 <%50 9/15 0/12 Transplantasyon (n:8/28) 7/16 1/12 0.035 Sonuç: Çalışmamızda, sitoplazmik beta-katenin ekspresyon özelliklerine sahip olguların daha yüksek oranda hepatik ven tutulumu gösterdiği, daha düşük KT yanıtına sahip olduğu ve geniş cerrahi rezeksiyon ve nakil ihtiyacı olduğu görülmüştür. Bu sonuç literatürde sitoplazmik beta-katenin ekspresyonunun prognoza etkisinin gösterildiği ilk çalışmadır.
AML kasumi-3 ve KG-1 hücre hatlarında hücre polaritesindeki değişiklikler ve in vitro hedef tedavisinin etkileri
Giriş: AML moleküler patogenezinin tanımı son yıllarda çarpıcı bir ilerleme kaydetmiştir. Lösemik transformasyon için hayati önem taşıyan iki ana genetik olay türü tanımlanmıştır: hematopoietik farklılaşmayı yöneten miyeloid transkripsiyon faktörlerinde değişiklikler ve sinyal transdüksiyon ara ürünlerinin aktive edici mutasyonları. Hematopoietik progenitör hücrelerdeki transkripsiyonel kontrolü değiştiren moleküler olaylar, büyüme faktörü reseptörleri için mevcut olan sinyal iletim moleküllerinin kompozisyonunu değiştirirken, sinyal transdüksiyon moleküllerindeki aktive edici mutasyonlar, çeşitli transkripsiyon faktörlerinin aktivitesinde ve ekspresyonunda değişikliğe neden olurlar. Bu süreçler birbirine oldukça bağımlıdırlar ve normal miyeloid farklılaşması için çok önemlidir. AML, olgunlaşmamış progenitör hücrelerin klonal büyümesi ile karakterizedir. Artan çoğalma ve apoptoz direnci ve aynı zamanda farklılaşma inhibisyonu bu patojenik olayın merkezinde ve büyüme faktörü reseptör sinyal yolaklarının yapıcı ve/veya anormal aktivasyonuna katkıda bulunması muhtemel görünmektedir. Sinyal transdüksiyon moleküllerinin anormal ve yapısal olarak aktivasyonu primer AML kemik iliği örneklerinin yaklaşık %50'sinde bulunmuştur. Bu aktive edici olayların en yaygın olanı RTK FLT3, N-Ras ve K-Ras, KIT'te ve diğer RTK'lerde gözlenmiştir. Bu mutasyonlardan bazıları için, miyeloid hücrelerdeki aktive etme ve dönüştürme yetenekleri in vitro veya fare kemik iliğinde gösterilmiştir. Bu patogenezde hücre sitosteleti ve polaritesinde olan değişikliklerle bağlı literatürde çok az veri bulunmaktadır. Amaç: Bu çalışmada, AML KG-1 ve Kasumi -3 hücrelerinde Planar Hücre Kutuplaşması yolağı proteinlerinin ekspresyonunun hastalığa bağlı olarak değişikliğini öğrenmek ve bu değişikliğe FLT3 inhibitörleri olan Quizartinib (Faz II), Midostaurin (Faz II) ve Lestaurtinib (klinik deneylerde) moleküllerinin ve Mezenkimal Kök Hücre co-kültürünün in vitro hedef tedavisine ektisini öğrenmek amaçlanmıştır. Gereç ve yöntem: KG-1, Kasumi-3, Kemik İliği Kök Hücreleri ve Mezenkimal Kök Hücre hatları hücre protokolünde de gösterildiği gibi 75 sm2'lik flasklara ekilir. Hücreler 37oC ve %5 CO2 ortamında 1 hafta inkübe edilir. Bu süre zarfında hücrelerin besiyeri değiştirilir, gerektiğinde pasaj yapılır. Gereken sayıya ulaştıktan sonra hücreler 6 kuyucuklu yeni flasklara ekilir. Her flaskta 3 kuyucuğa Mezenkimal Kök hücreler ekilir. Üç flaska Quizartinib, üç flaska Lestaurtinib ve son üç flaska Midostaurin eklendi. Çalışma 3 tekrar olarak yapıldı. 24 saat inkübasyon sonrası flasklardan hücreler alındı ve mRNA ekspresyonu yapıldı. Alınan RNA örneklerinden Taqman Reverse Transciptase Reagents ile cDNA elde edildi. Alınan cDNA materyali jel elektroforezinde kontrol edildikten sonra her gen için önceden ısmarlanmış Tagman hazır primerler ile elde olunan karışımlar Taqman 2x RT-PCR kullanılarak ABI7000 RT PCR cihazına yüklendi. Reaksiyon eş zamanlı olarak ABI7000 makinesinin bilgisayarından gözlemlenmiştir. Cihazdan alınan Ct değerlerinden Ct değeri hesaplandı ve katlama formülü ile Fold Change değerleri hesaplandı. Bulgular: Alınan değerlere göre Planar Hücre Kutuplaşması yolağı proteinlerini kodlayan genlerin ekspresyonunda değişim gözlemlendi. Hedef tedavisinde kullanılan moleküllerin etkisi ile malum genlerin ekspresyonlarında azalma görüldü. Mezenkimal kök hücre ko-kültürü ve FLT3 inhibitörleri kullanılan modellerde Fold Change değerleri ortalama 3 defa azalmıştır. Tartışma ve sonuç: Deney bulgularımıza göre sağlıklı kemik iliği hücrelerine kıyasla, lösemi hücre hatlarında hücre polarite genlerinin ekspresyonu artmıştır. Bunun da lösemi prognozunu negatif etkilediği bilinmektedir. Diğer yandan, Quizartinib, Lestaurtinib, Midostaurin ve mezenkimal kök hücre ko-kültürü kullanılan modellerde genlerin ekspresyonu, dolaysıyla lösemi prognozu pozitif etkilendiği sonucuna varılmıştır. Bu sonuçlar, kullanılan FLT3 inhibitörü moleküllerinden Quizartinib, Lestaurtinib, Midostaurin için yeni bir etki mekanizmasını ortaya koymaktadır.
miRNA kullanılarak NOTCH1 ınhibisyonu ile kanser kök hücre ve tümör mikroçevresinin hedeflenmesi
Pankreas kanseri, 6 ay ortalama hasta sağkalımı ile son derece zayıf sağkalım oranlarına sahip en agresif kanserlerden biridir ve karşılanamayan bir terapötik zorluğu temsil etmektedir. Pankreas kanseri ilerleyişini ve mekanizmaları hala tam olarak anlaşılamamıştır. Yalnızca tümör hücrelerini hedef alan stratejilerin pankreas kanseri hücrelerini ortadan kaldırmada başarısız olduğu ve metastazı, ilaca direnci ve hasta ölümlerini önlediği kanıtlanmıştır. Kanser kök hücreleri hücre göçü / istilası, ilaç direnci ve metastaz özellikleri sebebiyle önemli klinik etkilere sahiptir. NOTCH ve ilişkili sinyal yolaklarının kanser kök hücrelerinde yüksek/artmış aktivite gösterdikleri; bu hücrelerin sürdürülmesi ve sağkalımı için önemli olduğu bilinmektedir. NOTCH1'in pankreas kanseri kök hücrelerinin regülasyonundaki fonksiyonel rolü açıklığa kavuşmamıştır. Planlanan çalışmayla klinikte kullanılan toksik olmayan nanolipozom teknolojisi ile NOTCH1'i hedefleyen miRNA temelli tedavi modeli uygulanmıştır. NOTCH1 hedef alınarak kanser kök hücre özelliklerinin baskılandığı, tümör büyümesi ve yayılmasının durduğu görülmüştür. Tedavi yaklaşımı olarak etkin bir şekilde kullanılabileceği öngörülmektedir .
Prostat kanser kök hücrelerinde zoledronik asitin Rab23 GTPaz ve sonic- hedgehog yolak aktivasyonu üzerinde etkisi
Prostat kanseri erkelerde akciğer kanserinden sonra ölümlü ilişkili ikinci kanser tipidir. Kanser Kök Hücresi (KKH) tümör yapısı içinde çok az sayıda hücreden oluşan, kök hücre gibi sonsuz sayıda bölünebilen ve sessiz kalabilen hücre gurubudur. KKH'i tümörün çoğalmasından, geleneksel tedavilere dirençten, invazyondan ve hatta metastazdan sorumlu tutulmaktadırlar. KKH'de SHH, Wnt, Notch ve BMP yolakları gibi çok yönlü sinyal yolaklarının düzenlenmesindeki bozukluklar kanser oluşumu ve yayılması ile ilişkili bulunmaktadır. SHH sinyali bazal/kök hücrelerin KKH'e transformasyonunda yer almakta ve KKH devamlılığı, sağ kalımını düzenlemektedir. Sağlıklı dokularda Rab23 GTPaz, SuFu-bağımlı şekilde SHH yolak aktivasyonunu negative şekilde düzenler. Çalışmamızın amacı zoledronik asit uygulanan insan prostat KKH'de Rab GTPaz ve SHH yolak bileşenleri genlerinin ekspresyon seviyesini araştırmaktır. Insan prostat kanser hücreleri FACSAria flow sitometri kullanılarak sort edilmiş, prostat kanser kök hücreleri CD 133high/ CD44high olacak şekilde ayrıştırılmıştır. Zoledronik asit uygulanarak deney gruplarında IC50 değerleri bulunmuştur. Zoledronik asit uygulanan deney gruplarında Rab23 GTP' az ve SHH yolak bileşenlerinin ekspresyon profilinin incelenmesi için RNeasy Plus Mini Kit ( Qiagen) kullanılarak total mRNA izole edilmiş, cDNA sentezi gerçekleştirilmiştir. Rab GTP'azların ekspresyonu LightCycler® 480 real-time PCR kullanılarak analiz edilmiştir. Saptanan sonuçlar zoledronik uygulanan insan prostat KKH ve control grupları arasında karşılaştırılmalı şekilde incelenmiştir. Bu çalışma, Zoledronik asit etkisinin Rab23 GTPaz ve SHH yolak bileşenleri ve dolayısı ile de KKH özellikleri üzerinde etkisinin saptanması yönünde ilk olabilme özelliğine sahip çalışmadır.
Meme kanserinde DZNep ve stauprimid kombinasyonunun MYC gen ekspresyonu üzerindeki etkilerinin araştırılması
Dünyada kadınlar arasında görülme sıklığı birinci olan meme kanseri, heterojen ve karmaşık bir hastalıktır ve bu heterojenite giderek artmaktadır. Meme kanserinin pek çok alt tipleri bulunmaktadır. Meme kanserinin erken tanısı ve tedavisi hastalığın prognozunda önemli bir yer almaktadır. Hücre büyümesi, farklılaşması, apoptoz ve proliferasyonunda anahtar düzenleyici olan MYC geni, meme kanserinin gelişimi ve progresyonuyla da ilişkilidir. Yapılan çalışmalarda MYC geni aşırı ekspresyonunun baskılanmasının meme kanseri hücreleri üzerinde antiproliferatif etki oluşturduğu gösterilmiştir. Terapötik hedef olarak stauprimid embriyonik kök hücrelerde NME /NM23 nükleosit difosfat kinaz 2 (NME2) nükleer lokalizasyonunu inhibe ederek MYC geninin aşırı ekspresyonunu baskılar. DZNep (3-Deazaneplanocin-A) ise EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) yolağında H3K27me3 metillenmesini inhibe etmektedir. Tez kapsamında yapılan çalışmalarda, DZNep ve Stauprimid'in ayrı ayrı ve kombinasyon şeklinde insan meme kanseri hücre hatlarına muamelesi ile sitotoksisitesi, yara iyileşme, klonojenik analiz ve gen ekspresyon deneyleri gerçekleştirilmiştir. Stauprimid'in 72. saatte MDA-MB-231 hücre hattı için IC50 dozu 2,74 μM, DZNep'in 182,75 μM, 1:1 oranındaki kombinasyonunun ED50 0,33 μM ve CI (kombinasyon indeksi) 0,134 güçlü sinerjizm, MCF-7 hücre hattı için 72. saatte Stauprimid IC50 2,07 μM, DZNep IC50 115,0 μM, 1:1 oranındaki kombinasyonunun ED50 1,37 μM ve CI 0,671 sinerjizm, MCF-10A hücre hattı için 72. saatte Stauprimid IC50 19,90 μM, DZNep 108,6 μM, 1:1 oranındaki kombinasyonunun ED50 7,90 μM ve CI 0,47 sinerjizm göstermiştir. Yara iyileşme deneyinde, maddelerin kombinasyon uygulamasında ayrı ayrı ajan muamelesi ve kontrol grubuna göre daha az kapanma eğilimi göstermiştir. DZNep ve Stauprimid ajanlarının kombine tedavi şeklinde kullanılmasının meme kanseri hücreleri üzerinde tek bir anti-tümör özellikte kullanılmasına göre daha anti-prolifaretif etkisinin olduğu gösterilmiş ve bu bağlamda MYC geninin regülasyonu sağlanmıştır. Sonuç olarak, her iki etken maddenin MYC geni üzerine etkisinin olması ve apoptozu indüklemesi bu iki ajan arasındaki sinerjistik etki olduğunu göstermektedir. In vivo ve faz çalışmalarının ardından kullanılacak olan kombine terapötik tedavilerde fayda sağlanacağı ön görülmektedir. Anahtar Kelimeler; Meme Kanseri, EZH2 yolağı, NME2 yolağı, DZNep, Staurpimde, Polikomb Grubu (PcG) Proteinleri
Klinik olarak glomerülonefrit şüphesi ile böbrek biyopsi yapılan hastalarda "geçici reseptör potansiyel iyon kanal (TRPC) gen ailesinin" farklı ifade profillerinin incelenmesi
Glomerüler böbrek hastalıkları dünyada çok sayıda insanı etkilemeye devam etmekte olup son dönem böbrek hastalığına yol açan etyolojiler içerisinde yer almaktadır. Bu hastalıkların en erken bulgusu idrarda protein kaybıdır. Proteinüri mekanizmaları üzerine yapılan çalışmalarda glomerüler filtrasyon bariyeri komponenti olan podositler önemli rol oynamaktadırlar. Podositler, konjenital nefrotik sendromlar (slit diyagram proteinlerinden nefrin, podosin, CD-2 ilişkili protein, TRPC6 mutasyonları sonucu), minimal lezyon hastalığı (MLH), fokal segmental glomerüloskleroz (FSGS), membranöz glomerülonefrit (MGN), diyabet ve lupus nefriti gibi pekçok insan ve deneysel glomerüler hastalıklarında hasara uğramıştır. Hasarın şiddeti ve süresine bağlı olarak podositler farklı yanıt verebilmektedirler. Erken evrede podositlerde görülen otofaji ve hipertrofi (Evre I) adaptif ve koruyucudur. Fakat sonraki evrelerde hasarın şiddeti ve uzunluğu arttıkça (evre II ve III) maladaptif süreçe girilmekte olup klinik olarak proteinüri gözlenmekte olup patolojik olarak da epitelyal'den mezenkimal hücrelere transizyon sonrasında apoptitoz ve sonuçta glomerüloskleroza kadar olay ilerlemektedir. TRPC kanalları selektif olmayan Ca+2 geçirgen katyon kanalları olup omurgalıların dokularında geniş olarak ifade edilmektedirler. Fosfolipaz C uyarısı ile ilişkili sinyal iletim yollarına yanıtta aktif hale gelirler. Geçici reseptör potansiyel iyon kanalı C6 (TRPC6) podositlerde exprese edilmekte ve slit diyaframın bir komponentidir. TRPC6 podositlerdeki slit diyafram proteinleri (nefrin, podosin, α-aktinin-4 gibi) ve mekanosensitif Ca+2 ile aktive K+ kanalları ile ilişki içindedir. Genetik ve kazanılmış hastalıklarda TRPC6 overaktivasyonu patolojik Ca+2 girişi ile podosit hasarına neden olmaktadır. Dual etkilidir. Akut aktivasyonu podositleri kompleman aracılı hasardan korurken, kronik aktivasyonunda fokal segmental skleroza yol açmaktadır. Kültüre podositlerde TRPC6'nın kalsinörin aktivasyonu yaptığı gözlenmiştir. Kalsinörin aktivasyonu podositlerde defosforilasyon ve aktin ilişkili protein sinaptopodin proteolizi ile proteinüriye yol açar. TRPC1, TRPC2, TRPC4 ve TRPC5 stromal-interacting molekül 1 (STIM 1) adlı protein ile etkileşim içinde olup bu protein hücre içi kalsiyum depo içeriğine duyarlıdır. Bu protein ile bağlanma sonucunda TRPC kanalları endozomlardaki kalsiyum salıcı zona bağlanırlar. STIM1 TRPC3 veya TRPC6'ya bağlanmaz fakat indirekt olarak farklı hücre tiplerinde TRPC kanallarının kapı davranışlarını değiştirirler. STIM1'in podositlerde exprese olup olmadığı bilinmemektedir. TRPC6 gen mutasyonunun herediter fokal segmental skleroz (FSGS) nedeni olması dışında patofizyolojik olarak artmış TRPC6 expresyon düzeyleri kazanılmış glomerüler hastalıklarda da artmıştır. Yapılan bir çalışmada TRPC6 mRNA ekspresyonunun genetik kökenli olmayan minimal lezyon hastalığı (MLH) ve membranöz glomerülonefrit (MGN) hastalarının böbrek biyopsi örneklerinde kontrol grubu hasta örnekleri (tümör nefrektomili hastaların sağlıklı böbrek parçası) ile karşılaştırıldığında belirgin artmış bulunmuştur. Buna dayanarak da TRPC6'nın genetik olmayan glomerüler hastalıklarda önemli rol oynadığı ve TRPC6'ya yönelik olarak yapılabilecek blokajların etkili bir tedavi yöntemi olabileceği söylenmektedir. Çalışmanın amacı; Mikroskobik ve/veya makroskobik hematüri olsun ya da olmasın proteinüriye sahip olup klinik olarak glomerülonefrit düşünülen ve böbrek biyopsisi yapılan hastalarda TRPC ailesi üyelerinin farklı ifade profillerinin incelenmesiyle hastaların tanı ve prognozuna katkıda bulunmaktır. Materyal Metod: Bu çalışma Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Nefroloji polikliniğine başvuran, glomerülonefrit ön tanısı ile böbrek biyopsisi yapılan 108 hasta ve kontrol olgusu olarak primer böbrek tümörü tanısı ile üroloji kliniğinde nefrektomi yapılan 37 hasta ile yapılmıştır. Alınan biyopsi örneklerinde PKD2, TRPC1, TRPC6, STIM-1 ve Orai-1 mRNA düzeyleri hasta ve kontrol grubu olarak çalışıldı.. Sonuçlar: Hasta ve kontrol grubunu karşılaştırdığımız zaman her iki grubun cinsiyet dağılımı benzerdi. Diyabet ve hipertansiyon sıklıkları da benzerdi. Hasta ve kontrol grubunun TRPC ekspresyon profillerini karşılaştırdığımızda nedenli böbrek biyopsisi yapılan grubun TRPC ekspresyon düzeyleri kontrol grubuna göre istatiksel açıdan anlamlı şekilde yüksek idi. Alt grup analizi yaptığımızda; nedenli böbrek biyopsisi yapılan hasta grubu diyabeti olan ve olmayan şeklinde karşılaştırıldığında diyabetik grubun TRPC1, TRPC6 ve STİM1 düzeyleri diyabeti olmayanlara göre istatiksel açıdan anlamlı yüksek bulundu. Hasta grubunun TRPC ekpresyon profillerinin demografik ve böbrek biyopsi patoloji sonuçları ile yapılan korelasyon analizinde TRPC1, TRPC6 ve STİM1 ile diyabet varlığı arasında pozitif bir korelasyon vardı. Biyopsideki arteriolar hyalinozis ile NPHS2 ve ORAI arasında pozitif korelasyon vardı. İlginç şekilde böbrek biyopsisinde glomerüllerin C4d boyanmasının pozitif olması ile TRPC6, NPHS2 ve PKD2 ve IG M pozitifliği ile TRPC6 ve STİM1 arasında negatif korelasyon var idi. ORAI ile glomerüler skleroz oranı arasında pozitif korelasyon bulundu. Sonuç olarak; proteinürik böbrek hastalarında TRPC gen ekspresyon profillerinin sağlıklı böbrek dokusuna göre istatiksel açıdan anlamlı artmış olduğunu bulduk ki bu da literatürdeki artmış TRPC6 ekspresyonu ve proteinüri arasındaki ilişkiyi desteklemekteydi. Biz proteinüri şiddeti ile TRPC ekspresyon profilleri arasında pozitif bir ilişki bulamadık. Yine sonuçlarımıza baktığımızda literatüre benzer şekilde diyabetik hastalarda TRPC6 ve STİM1 ekspresyon profillerinin artmış olduğunu gördük ki bu hastalarda gelişen podosit hasarında hücre içi kalsiyum yolaklarının aktive olmuş olduğu bilgisini desteklemektedir.
Glioblastoma multiforme ve glioblastoma multiforme kanser kök hücreleri ile astrosit ko-kültürlerinde, siklopamin inhibisyonu ile sonıc hedgehog sinyal yolağı ve ilişkili mekanizmalarda karşılıklı bağlantıların moleküler yöntemlerle araştırılması
Kanser, bir grup hücrenin kontrolsüz bölünme, invazyon ve metastaz gibi özellikler sergileyerek oluşturduğu bir hastalıktır. Embriyogenez sırasında da kontrollü hücre bölünmesi, hücre farklılaşması, hücre göçü ve programlanmış hücre ölümü görülür. Embriyo gelişimi ve tümör oluşumu, hücre göçü, invazyon, hücre farklılaşması ve immün cevaptan kaçabilme gibi benzer hücre davranışları sergileyebildikleri gibi bu iki tip hücrenin gen ekspresyonu, protein profilleri, sinyal yolakları da benzerdir. Hedgehog gen ailesi üyelerinden Sonic Hedgehog (Shh) sinyal yolağı, hem embriyogenez hem de karsinogenezde aktif olabilen önemli sinyal yolaklarından biridir. Bu yolaktaki aktivasyon artışları ile medulloblastoma, rabdomyosarkoma, kolorektal karsinoma gibi birçok kanser tipi ortaya çıkabilir. Glioblastoma multiforme (GBM), erişkin insanlarda en sık görülen primer kötü huylu beyin tümörü olup uzak organ yayılımı olmasa da oldukça hızlı büyüyen infiltratif bir tümördür. Tümörler heterojen hücrelerden oluşmakta olup; tümör kitlesi içinde kök hücreler gibi kendini yenileme ve farklılaşma özellikleri bulunan, radyoterapi, kemoterapiye dirençli olan, uzak organ yayılımları yapabilen ve kanser rekürrensinde etkisi olduğu düşünülen kanser kök hücreleri (KaKH) de bulunmaktadır. GBM'li olguların tümör kitleleri içinde de kanser kök hücreleri tanımlanmıştır ve bu hücreler prognozun kötüleşmesine neden olabilirler. Son yıllarda GBM tedavisi için Hedgehog sinyal yolağı önemli bir hedef haline gelmeye başlamıştır. Siklopamin, Smoothened (Smo) reseptörüne bağlanarak Shh sinyal yolağının inhibe edilmesinde kullanılan ve hayvan deneyi çalışmalarında gliomalar, pankreatik ve kolon karsinomlarında tümör büyümesini de inhibe ettiği gösterilen önemli bir ajandır. GBM ile ilgili çeşitli ko-kültür ve mikro-çevre araştırmaları ise henüz yeterli değildir. Literatür bilgilerine dayanarak, Sonic Hedgehog sinyal yolağının embriyonik dönemde önemli bir rol oynadığı bilinmekte, kanser ve kanser kök hücrelerinde de aktif olduğu ve tedavi direncinde de etkili olabileceği düşünülmektedir. Literatür bilgileri ışığında, çalışmamız ile GBM ve GBM kanser kök hücrelerinin astrositler ile ko-kültüre edilmesi ve bu ortamda Shh sinyal yolağının etkisi ve bu yolağın inhibe edilerek sonuçların değerlendirilmesi planlanmıştır. Ko-kültür ortamında hücre-hücre etkileşimleri değerlendirilip GBM ve GBM kanser kök hücrelerinde aktive olan Shh sinyal yolağını astrosit varlığında siklopaminin inhibisyon etkisinde bir değişim olup olmadığı aynı zamanda hücrelerin parakrin olarah Shh protein salgılayabilme özellikleri araştırılarak hücre-hücre etkileşimlerinin de Shh sinyal yolağının siklopamin ile inhibisyonu üzerine olumlu ya da olumsuz etkisi olup olmadığı sorusuna cevap aranmıştır. Sonuç olarak GBM ve GBM kanser kök hücrelerinde Shh sinyal yolağı inhibe edildiğinde beraberinde etkilenebilecek apoptoz ve hücre siklusu gibi hücre içi mekanizmalarındaki değişimler PCR, immünofloresan, ELISA, TUNEL, hücre siklusu analizi gibi yöntemlerle araştırılmıştır. Siklopamin, Shh yolağını baskılamada etkili bir ajandır; tek başına yeterli derecede hücre ölümüne neden olamasa da; GBM ve GBM KaKH'lerinde Shh yolağı aktivasyonunun görülmesi, kombine kanser terapilerinde Shh yolağının baskılanması gerekliliği ortaya koymuştur. GBM ve GBM KaKH kontrol gruplarının sonuçları ve siklopaminden etkilenmeleri RNA ve protein düzeyinde birbirlerinden farklıdır. Bu hücreler ile ko-kültür uygulandığında çoğu zaman farklı sonuçlar elde edilmiştir. Yapılan çalışma sonucunda özellikle tekli hücre kültürü ve ko-kültür sonuçlarının farklılığı ele alındığında, hastalıklarda ve tedavilerinde mikro-çevre etkisinin önemi ortaya koyulmuştur.
Meme kanserinde PKİ-402'nin PI3K/AKT/mtor yolağı ve radyo duyarlılık üzerindeki etkilerinin araştırılması
Meme kanseri kompleks kanser türü olup, dünya üzerinde kadınlarda görülme sıklığına göre birinci, kansere bağlı ölümler arasında ikinci sıradadır. Meme kanseri klinik özelliklerine, eksprese edilen tümör markerlarına ve histolojik tipine göre alt tiplere ayrılan heterojen bir hastalıktır. Duktal ve lobular karsinomalar en yaygın histolojik tiplerini oluşturmaktadır. Her alt tipin farklı prognozu ve tedaviye yanıtı vardır. Meme kanserinin oluşumunda birçok risk faktörü tanımlanmıştır. Mutasyonlar meme kanseri oluşumunda önemli rol oynamaktadır. PI3K/Akt/mTOR yolağının mutasyonlara bağlı anormal aktivasyonu meme kanserinde sık gözlenmektedir. Bu yolağın inhibisyonunun meme kanseri gelişimini önlemeye yardımcı olduğu yapılan çalışmalarda bildirilmiştir. Meme kanserlerinin tedavisinde cerrahi müdahale, kemoterapi ve radyoterapi uygulamaları sonucu başarı elde edilmekle birlikte genellikle tedavilere karşı direnç gelişimi ya da nüks görülmektedir. Kök hücreler terapi direnci ve nüksten sorumlu olan, kanser kitlesini yeniden oluşturma potansiyeline sahip hücrelerdir. Bu nedenle güncel araştırmalar tümör kitlesini oluşturan hücrelerin yanısıra kanser kök hücrelerinin de elimine edilmesini sağlayacak mekanizmaların aydınlatılmasına odaklanmıştır. Bu doğrultuda tez kapsamında, PI3K/Akt/mTOR inhibitörü PKI-402'nin farklı meme kanseri alt tiplerindeki ve meme kanseri kök hücrelerindeki sitotoksik, apoptotik etkinliği normal hücrelerle kıyaslanarak araştırılmıştır. Bu amaçla Sitoksisite, Apoptoz, -H2AX deneyi, Klonojenik sağkalım deneyi ve Fosforilasyon deneyi gerçekleştirilmiştir. Çalışmalar sonucunda, 48.saatte MCF-7 hücre hattında 109 nM, MDA-MB-231 hücre hattında 2.44 µM, BCSC hücre hattı için 5.941 µM ve MCF-10A hücre hattı için 142 nM IC50 dozuyla bu hücreler için PKI-402 sitotoksik bulunmuştur. İleri deneylere bu dozlarla devam edilmiş ve bu IC50 dozunun radyasyonla kombine edildiğinde MCF-7, BCSC ve MCF-10A hücre hatlarında apoptozu indüklediği, MDA-MB-231 hücre hattında apoptotik etki göstermediği bulunmuştur. -H2AX deneyi sonucunda ise MCF-7, MDA-MB -231 hücre hatlarında kontrole kıyasta ve gruplar arasında (İyonize radyasyon (IR) ve PKI-402+ İyonize radyasyon (IR)) anlamlı çift kırık yüzdesi gözlemlenmiştir. MCF-10A ve BCSC hücre hatlarındaki çift kırık yüzdesi ise anlamlı olarak değerlendirilmemiştir. Uygulamalardan sonraki sağ kalım kapasitesi klonojenik analizle değerlendirilmiştir. MCF-7 ve BCSC hücre hatlarında sağkalım yüzdesinde IR ve PKI-402+IR grupları arasında ve kontrole kıyasta anlamlı bir değişim gözlemlenmiştir. Fosforilasyon deneyi sonucunda, MCF-7, MDA-MB-231 ve BCSC hücre hatlarında PI3K/Akt/mTOR yolağının baskılanmasının göstergesi olan önemli 16 proteinden bazılarının baskılandığı gözlemlenirken, normal meme epiteli hücre hattı MCF-10A'da sadece 4E-BP1 (Thr37/46) fosforillenmesinin baskılandığı gözlemlenmiştir. Tüm bu sonuçlara dayanarak, PKI-402'nin Radyasyona duyarlılığı arttırdığını düşünmekle birlikte, ileri deneylerde bunun teyit edilmesi gerektiğini düşünmekteyiz. Anahtar kelimeler: Meme Kanseri, PI3K/Akt/mTOR yolağı, PKI-402, Radyo Duyarlılık
Hepatosellüler karsinoma hücre kültürlerinde ganoderma lucidum'un NRF2/are sistemi ve hemoksijenaz-1 (HO-1) üzerine etkileri ve sitotoksisite çalışmaları
Günümüzde dünyadaki altıncı en yaygın kanser türü hepatosellular karsinomadır. Bununla birlikte, hepatosellülar karsinoma(HCC) 'nın moleküler etiyolojisine odaklanan çalışmalar sınırlıdır. Nrf2 sinyal yolağı, bir dizi sitoprotektif genin ekspresyonunu arttırarak hücreleri çeşitli toksik maddelerden ve kanserojen maddelerden koruyabilir. G. lucidum, kanser de dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların önlenmesi ve tedavisinde geleneksel tıpta kullanılmaktadır. Çalışmamızın amacı, G. lucidum'un HCC'deki potansiyel sitotoksik rolünü değerlendirmektir. Bu amaçla, hücre canlılığı testi ve Nrf2 sinyal yolağı ile ilgili proteinlerin analizi yapıldı. HCC hücreleri için G. lucidum'un en etkili konsantrasyonu 100 µg/ml olarak bulundu. 24, 48 veya 72 saat boyunca G. lucidum ekstraktları (100 veya 50 µg/ml) uygulandıktan sonra sitoplazmik / nükleer Nrf2 ve HO-1, NQO1 veya Keap1 protein seviyelerindeki süreye bağlı olarak değişiklikler gözlemlendi. 100 µg/ml ekstraktı içeren G.lucidum özütü çözeltisinin 24 saatlik ve 48 saatlik uygulamaları sonunda hücre canlılığının, sırasıyla, % 53 ve % 59 oranlarında engellediği gösterilmiştir. Sonuç olarak, bulgularımız G. lucidum'un HCC hücrelerinde anti-kanserojen etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Ek olarak, fitokimyasal maddelerin kullanımı ile Nrf2 sinyal yolağının aktivasyonu da bu çalışma ile gösterilmiştir. Elde ettiğimiz veriler, kanser tedavisinde fitokimyasal maddelerin kullanımı ile sağlanan Nrf2 aktivasyonunun moleküler etki mekanizmalarının aydınlatılmasının önemini de vurgulamaktadır. ANAHTAR SÖZCÜKLER: Ganoderma lucidum, Nrf2/ARE yolağı, sitotoksisite, hepatoselüler karsinoma hücre hattı (HCC)
3t3-l1 preadipositlerinin diferansiyasyon, proliferasyon, viabilite ve migrasyonu üzerinde apigenin'in etkisi: WNT yolağının olası katkısı
Obezitenin oluşumunda adiposit hipertrofisi ve preadipositlerin adipositlere diferansiye olması rol almaktadır. Maydanoz, kereviz, turunçgiller gibi meyve, sebze ve bitkilerde bulunan apigeninin, adiposit diferansiyasyonunu baskılayarak obeziteyi önleyebileceği bildirilmiştir. Ancak altında yatan mekanizmalar tam olarak aydınlatılamamıştır. Ayrıca, apigeninin preadipositlerin proliferasyonu ve migrasyonu üzerinde etkisini gösteren çalışma bulunmamaktadır. Çalışmamızda apigeninin 3T3-L1 preadipositlerinde hücre proliferasyonu, diferansiyasyonu ve migrasyonu üzerine etkilerini incelemeyi ve oluşacak etkiye Wnt sinyal yolağının aracılık edip etmediğini araştırmayı amaçladık. Wnt inhibitörü olarak niklozamid kullanıldı. Hücre viabilite ve proliferasyonu MTT analizi ile, diferansiyasyon Oil Red O boyama ile değerlendirildi. Apigenin (2,5, 5 ve 10 μM) ve niklozamidin (0,25 μM) hücre canlılığı üzerinde anlamlı bir etkisi olmadı. Proliferasyon, diferansiyasyon ve migrasyon deneylerinde belirli zaman aralıklarında (diferansiyasyon deneylerinde diferansiyasyon protokolünün 0-4, 4-8 ve 0-8'nci; proliferasyon deneylerinde ise 0-2, 2-4 ve 0-4'ncü günleri boyunca; viabilite ve migrasyon deneylerinde 24, 48 ve 72 saat boyunca) niklozamid varlığında veya yokluğunda apigenin uygulandı. Apigenin 10 μM konsantrasyonda diferansiyasyonun tüm zaman noktalarında diferansiyasyonu anlamlı olarak baskıladı. Niklozamid ön uygulaması bu etkiyi ortadan kaldırdı. Proliferasyon sürecinin 0-2. ve 0-4'ncü günlerinde 10 μM apigenin uygulanması hücre proliferasyonunu anlamlı olarak azalttı. Niklozamid ön uygulaması bu etkiyi ortadan kaldırdı. Migrasyon deney serilerinde 24 saat boyunca apigenin ve/veya niklozamid uygulandığında migrasyonda anlamlı bir fark gözlenmedi. Apigenin 48 saat boyunca uygulandığında 2,5 ve 5 μM konsantrasyonda migrasyonda anlamlı bir artış gözlendi, ancak 10 μM apigenin uygulanması anlamlı bir etki göstermedi. Niklozamid ön uygulaması apigeninin 2,5 ve 5 μM konsantrasyonda oluşturduğu hücre migrasyonunu artırıcı etkisini ortadan kaldırdı. Apigenin 72 saat boyunca uygulandığında yalnızca 5 μM konsantrasyonda migrasyonda anlamlı bir artışa neden oldu. Bu etki niklozamid tarafından ortadan kaldırıldı. Bu bulgulara göre, apigeninin, 3T3-L1 preadiposit hücrelerinin canlılığını etkilemeden diferansiyasyonu ve proliferasyonunu baskıladığı; hücre migrasyonunu arttırdığı ve bu etkilere Wnt sinyal yolağı aktivasyonunun aracılık ediyor olabileceği düşünüldü. Bununla birlikte, bu varsayımların doğrulanması için daha detaylı çalışmalar gerekmektedir.