84
Archived Theses
0
DOIs Assigned
0%
DOI Rate
Discipline
Türkiye'de işitme kaybı segregasyonu gösteren ailelerde moleküler genetik çalışmalar
ÖZETKalıtsal nonsendromik işitme kaybı bulunan olguların %69'undakonneksin26 proteinini kodlayan GJB2 geninde 100'den fazlamutasyon tanımlandığı için, öncelikle 23 ailenin her birinden 2etkilenmiş birey olmak üzere toplam 50 bireyde GJB2 geninde DNA dizianalizi ile mutasyon taraması yapıldı. 8 ailenin bireylerinde GJB2geninde 35delG ve delE120 olmak üzere 2 değişik mutasyon saptandı.GJB2 geninde mutasyon taşımadıkları saptanan 7 aile, bağlantıanalizine uygunluklarını saptamak ve bir kontrol olması amacı ilebilgisayar simülasyon programı olan SLINK analizine alındı. SLINKanalizi sonuçlarına göre tahmini lod değerleri, 1.97 ile 4 arasındahesaplanan 6 ailenin etkilenmiş ve etkilenmemiş bireylerinde tahminimaksimum lod değeri 1'in altında olan 1 ailenin ise sadece etkilenmişbireylerinde, genom taraması yapıldı. Yaklaşık olarak 10 cM aralıklarlagenoma dağılmış, polimorfik markırlarla genom taramasıgerçekleştirilmiş 7 aileden, SLINK analizi sonuçlarına göre, tahminimaksimum lod değerleri istatistiksel olarak anlamlı bulunan 4 ailebağlantı analiz programına alındı. 4 aileden 1'inde DFNB3 bölgesindelokalize olan D17S1294 markırı için maksimum lod değeri 3.23 olarakhesaplandı. Bazı markırlar için pozitif lod değerleri hesaplanan 3ailede, ek markırlarla yapılan tarama sonucunda, 1 ailede daha DFNB3bölgesinde lokalize olan D17S2196 ve bu bölgedeki MYO15A genininintronik dizisinde lokalize olan D17S2207 markırı için maksimum loddeğeri sırası ile 3.48 ve 3.21 olarak bulundu. Bu 2 ailede MYO15A geniiçin DNA dizi analizi ile mutasyon taraması yapıldığında ailelerden1'inde genin 33 no'lu ekzonunda yanlış anlamlı yeni bir mutasyon(V2266M) bulundu. Ek markırlarla tarama sonucunda ise diğer 2ailede gerçek bir bağlantı saptanmadı. Sadece genom taramasınaalınan 2 ailede, genomun herhangi bir bölgesinde anlamlı birhomozigosite saptanamadı. Bu çalışmada, Türk populasyonundakalıtsal nonsendromik otozomal resesif işitme kaybının MYO15A geniile bağlantılı olduğu ilk defa gösterildi.Anahtar kelimeler: Kalıtsal nonsendromik işitme kaybı, GJB2mutasyon analizi.3
Glial tümörlerde ARHI tümör süpresör geninde loh ve metilasyon profillerinin araştırılması
1p31 bölgesinde lokalize olan ARHI geni, Ras protoonkogenine % 60 homoloji göstermesine karşın Ras ailesine ait tanımlanmış ilk tümör süpresör gendir. Maternal olarak susturulmuş ve sadece paternal allelden eksprese olan ARHI geninin, başta meme ve over olmak üzere kalp, karaciğer, pankreas ve beyin normal dokularında sürekli sentezlendiği bilinmektedir. Yapılan çalışmalarla meme ve over kanserlerinin % 70- 80'inde ARHI geninin ekspresyonunda azalma olduğu gösterilmiştir. ARHI geninin glial beyin tümörlerinin gelişimde etkili olup olmadığı ise bilinmemektedir. Bu çalışmada normal beyin dokusunda ekspresyon gösteren ARHI geninin, glial beyin tümörü gelişiminde rolünün belirlenmesi hedeflenmiştir. Çalışmamızda, 21 glial tümörlü olgunun tümör ve periferik kan örnekleri ile 7 otopsiden elde edilen normal beyin doku örnekleri incelenmiştir. ARHI gen ekspresyon düzeyleri gerçek zamanlı RT-PCR tekniği ile değerlendirildiğinde, 21 glial tümör örneğinin 7'sinde (% 33.3) ARHI gen ekspresyonunda azalma gözlenmiştir. Ekspresyon azalmasına neden olabilecek mekanizmalardan biri olan heterozigosite kaybı, 1p31 bölgesinde yer alan D1S207, D1S226, D1S430, D1S488 ve D1S2638 olmak üzere 5 işaretli polimorfik markır kullanılarak fragment analizi uygulanarak gerçekleştirilmiştir. 21 olgunun 2'sinde (% 9.5) LOH tespit edilmiş olup bu olgular gerçek zamanlı RT-PCR tekniği ile ARHI gen ekspresyonunda azalma gösteren 7 olgunun içerisinde yer almaktadır. Kalan 5 olgunun tümör DNA örneklerinde, ekspresyon azalmasına neden olabilecek bir başka mekanizma olan metilasyon araştırılmıştır. Yapılan çalışmalarla ARHI geninin promotor bölgesinde 3 farklı CpG adacığı tanımlanmış olup, gen ekspresyon kaybı ile en çok CpG II bölgesi arasında ilişki bulunmuştur. Buradan yola çıkarak CpG II bölgesinin metilasyon profili, 5 olguda COBRA tekniği ve restriksiyon enzim kesimi teknikleri uygulanarak çalışılmıştır. Değerlendirme sonucunda 5 olgunun hiçbirinde ARHI geninin promotorundaki CpG adacığı II bölgesinde metilasyon belirlenmemiştir. Bulgularımız, ARHI tümör süpresör geninin ekspresyonundaki azalmanın glial beyin tümörü gelişiminde rol oynayabileceğini ve heterozigosite kaybının bu ekspresyon azalmasından sorumlu mekanizmalardan birisi olabileceğini göstermiştir. Anahtar kelimeler: Glial beyin tümörleri, ARHI, LOH, metilasyon
Ankilozan spondilit ön tanılı hastalarda HLA b27 gen pozitifliği ve negatifliğinin sıklığı ile hastaların biyokimyasal laboratuvar bulgularının karşılaştırılması
Araştırmamız ile Ankilozan Spondilit (AS) hastalarında HLA B27 gen pozitif ve negatifliğinin biyokimyasal kan sayımı parametreleri üzerindeki olası etkilerini tespit etmeyi amaçladık ve sonuçları istatistiksel bir değerlendirmeye tabi tutmak suretiyle, bahse konu kan sayımı parametrelerinin Ankilozan Spondilit hastalığında ön bir belirteç olup olamayacağı konusunu değerlendirmeyi hedefledik. Çalışmamızın örneklem grubu AS ön tanısı almış olan hastalardan oluşmaktadır. Çalışmaya; genetik analiz sonucunda, HLA B27 pozitif doku tipine sahip 136 AS ön tanılı hasta ile HLA B27 negatif doku tipine sahip 136 AS ön tanılı hasta dâhil edilmiştir. Hastaların poliklinik takip dosyaları taranarak, demografik özellikleri, genetik soyağacı bilgileri, biyokimyasal laboratuvar bulguları ve HLA B27 test sonuçları kaydedilip çalışma tasarlanmıştır. İlgili biyokimyasal parametreler ve HLA B27 gen analizi sonuçları retrospektif olarak kayıt altına alınarak analiz edilmiştir. Çalışma hastalarının, CRP, RDW, MPV, WBC, Nötrofil, Lenfosit, NLR, ESH, PLT ve PCT gibi biyokimyasal ölçüm değerleri retrospektif olarak Tıbbi Genetik ABD polikliniği hasta dosyalarından elde edilmiştir. Hastaların mevcut olan HLA B27 genetik analizleri, Real Time PCR aracılığıyla çalışılmıştır. İstatiksel analizler SPSS ver. 20.0.0 kullanılarak yapılmıştır. Demografik verilerin ve biyokimyasal parametrelerin gruplar arası farklılıkları dağılıma göre Student's t testi ya da Mann-Whitney U analizi ile değerlendirilmiştir. Anlamlılık düzeyi p≤0,05 olarak alınmıştır. Sonuç olarak, HLA B27 pozitif hastaların biyokimyasal parametrelerinin tamamının medyan değerleri negatif gruptaki hastalardan istatistiksel olarak anlamlı ölçüde daha fazla bulunmuştur (p<0,05).
Ankilozan spondilit ön tanılı hastalarda HLA B27 gen pozitifliği ve negatifliğinin sıklığı ile bazı kan parametrelerinin karşılaştırılması
Ankilozan Spondilit (AS), spondiloartrit ailesi içerisinde en sık görülen kronik inflamatuar romatizmal eklem hastalığıdır. Bu çalışmada AS erken tanılanması için kan parametreleri kullanılabilirlikleri retrospektif yolla araştırılmıştır. Çalışma 2017 ile 2021 yılları arasında BAİBÜ Tıp Fakültesi Hastanesine başvuran, ASAS/EULAR'a göre AS tanısı konulan 226 hastayı kapsamaktadır. Hastaların HLA B27 analizleri Real Time PCR ile gerçekleştirilmiştir. İncelemeye alınan kan parametreleri HGB, HTC, MCV, PDW, AST, ALT, üre ve kreatinin'dir. SPSS versiyon.20.0.0 paket programı kullanılarak istatiksel analizler yapılmış ve normal dağılıma uygunluk Shapiro-Wilk testi ile hesaplanmıştır. Tüm parametreler non-parametrik olarak değerlendirilmiştir. Kan parametrelerinin farklılıkları Mann-Whitney U testi ve Student's t testi kullanılarak karşılaştırılmıştır (p≤ 0.05). Çalışılan kan parametrelerinin normal dağılıma uygunluğu, HLA B27 pozitif–negatif ve erkek-kadın ayrımına göre karşılaştırılmalar yapılmıştır. En son AS'li hastalar içinde HLA B27 pozitif ve negatif gruplarda ÇAA değerleri irdelenmiştir. Sonuç olarak, AS'li hastalarda hem HLA B27 pozitif hem de HLA B27 negatif olanlarda HGB oranlarında artış; HCT, PDW ve kreatinin (minimum değerlerinde) oranlarında azalma; ALT ve AST oranlarında median değerler düşük, maksimum değerlerinde aşırı yükselme; MCV ve üre'nin uygun parametre olmadıkları belirlenmiştir.
Glioblastoma (Gbm) hücre hatları üzerinde multifloral bal ve temozolomid-bal kombine tedavisinin sitotoksik, antimetastatik ve apoptotik potansiyelinin araştırılması
Malign glioma (glioblastoma veya GBM) en yaygın ve agresif primer beyin tümörüdür. Temozolomid (TMZ), glioblastoma tedavisinde birinci basamak olarak kullanılmaktadır. Çoğu glioblastoma hastası, cerrahi, radyoterapi ve kemoterapi müdahalelerine rağmen, tanıdan sonraki 1-2 yıl içinde ölmektedir. Bal, eski çağlardan beri yiyecek ve geleneksel bir ilaç olarak kullanılmıştır. Balın tümör hücre proliferasyonu, apoptozis ve metastaz gibi kanser progresyonu ile ilişkili birçok hücresel mekanizmaları regüle ettiği rapor edilmiştir. Çalışmada; balın, TMZ ile kombine kullanımının GBM hücre hatlarındaki sitotoksik etkisi ve mekanizmalarının araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda insan GBM (U-118 MG, T98G, U-87 MG) hücre hatlarında, balın ve bal + TMZ'nin kombine kullanımının sitotoksik etkileri MTT analizi kullanılarak değerlendirildi. Bal, TMZ ve bal + TMZ gruplarının GBM hücrelerinin sitotoksisitesinde rol alan sinyal yollarına ait gen ifadeleri seviyeleri kantitatif ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ve protein ekspresyonundaki değişiklikler Western Blot yöntemiyle araştırıldı. Çalışmamızda, balın çeşitli mekanizmalarla hücre canlılığını azalttığını gösterdik. U-118 MG, U-87 MG ve T98G hücre hatlarının üçünde de bal+ TMZ uygulanan gruplarda doza bağımlı sitotoksik etki gözlemlendi. T98G ve U-87 MG hücre hatlarında %5 bal-TMZ dozu, %5 baldan daha sitotoksik bir etki göstererek bal ve TMZ arasında sinerjik bir etki olabileceğinin göstergesi oldu. U-118 MG hücrelerinde Bal+TMZ uygulaması sonucunda pro-apoptotik Bax mRNA seviyesi ve protein ekspresyonunda istatistiksel olarak anlamlı olmayan bir artış gözlendi. Ayrıca hayatta kalım ilişkili ve GBM de ilaç direncinde önemli rol oynayan ERK sinyal yolağı baskılandı. T98G MG hücre hattında, bal uygulanması sonucunda pro-apoptotik Bax'ın mRNA ve protein ekspresyonunda artış gözlenirken, anti-apoptotik Bcl-2 proteininin mRNA ve protein ekspresyonunun azalma olduğu tespit edildi. Aynı zamanda Bal+TMZ ve TMZ uygulanan gruplarda ise ERK sinyal yolağını baskılandı. U-87 MG hücrelerinde Bal+TMZ uygulanan kombinasyon dozu sinerjistik etki göstererek pro-apoptotik Bax'ın hem mRNA hem de protein ekspresyonunda anlamlı derecede artış sağlarken, anti-apoptotik Bcl-2' nin mRNA ve protein ifadesini sinerjistik olarak azalttı. Migrasyon deneylerinde U-118 MG, T98G ve U-87 MG hücrelerinin hepsinde IC50 Bal+TMZ dozu uygulamaları hücre göçünü anlamlı derecede inhibe etmiştir. GBM' de tümör oluşması ve progresyonu ile ilişkili moleküler ve biyokimyasal mekanizmaları anlamak yeni potansiyel terapötiklerin gelişmesine olanak sağlaması öngörülmektedir. Sonuç olarak doğal arı balını, beyin tümörleri için umut verici bir doğal bileşik kaynağı ve diyet ürünü olarak öneriyoruz.
Erkek infertilitesi ve STPG2 geni ekspresyonu arasındaki bağlantının araştırılması
Amaç: İnfertil erkeklerin büyük bir kısmı sebebi bilinmeyen (idiyopatik) infertilite kategorisinde bulunmaktadır. Son yıllarda gelişen moleküler yöntemlerle gen düzeyinde çalışmalar hız kazanmıştır. Bu çalışmada, STPG2, GTSF1 ve RNF8 genlerinin ekspresyonu ile erkek infertilitesi arasındaki bağlantıların araştırılması amaçlanmıştır. Yöntem: 31'i idiyopatik, 9'u sebebi belli infertil olmak üzere toplamda 40 infertil erkek bireyden testis dokusu ve kan, 32 fertil erkek bireyden ise kan örnekleri alınmıştır. Örneklerin total RNA izolasyonu yapılıp cDNA elde edilmiştir. STPG2 geninde yapılan qRT-PCR çalışmalarından sonuç elde edilememesi üzerine 8'i sebebi belirlenmiş ve 8'i idiyopatik infertil olmak üzere 16 doku örneğinden transkriptom (RNAseq) çalışması yapılmıştır. Gruplar arasında farklılık göstermiş olan GTSF1 ve RNF8 genleri seçilmiş ve qRT-PCR yöntemi ile ekspresyon seviyeleri belirlenmiştir. Elde edilen bulguların ∆Cq değerleri kullanılarak istatistiksel analizleri yapılmıştır. Bulgular: RNAseq analizleri sonucunda STPG2 geninin gruplar arasında ekspresyon farklılığı göstermediği bulunmuştur. qRT-PCR ile yapılan çalışmalarda fertil ve infertil bireylerin kan örneklerinde GTSF1 geninde ekspresyon değişimi gözlemlenmezken, RNF8 geninin expresyonunda istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmuştur. İki gende de idiyopatik ve sebebi bilinen infertil dokular arasında fark gözlenmezken, patolojik tanılarına göre karşılaştırıldığında, her iki gende de dokularda ekspresyon farkı belirlenmiştir. Sonuç: İdiyopatik infertil bireylerle kontrol bireyler arasında STPG2 geninde ekspresyon farklılığı saptanmamıştır. GTSF1 gen ekspresyonu sadece patolojik tanısı "Sertoli Cell Only" (SCO) olan hasta grubunda düşüş gösterirken, RNF8 gen ekspresyonunun sadece SCO tanılı olguların doku örneklerinde değil, infertil ve fertil bireylerin kan örneklerinde de farklılığının belirlenmesi, RNF8 geninin aday bir biyobelirteç olabileceğini göstermiştir.
Dört major ALS geni dışlanmış "ailesel amiyotrofik lateral skleroz olgularında" tüm ekzom dizileme yöntemi ile patojenik varyasyonların araştırılması
Amaç: Konvansiyonel dizileme analiziyle, Amiyotrofik Lateral Skleroz (ALS) hastalığı ile en sık ilişkilendirilen C9ORF72, SOD1, TARDBP ve FUS genlerinde genomik değişim saptanmayan sekiz ailesel ALS olgusunun tüm ekzom dizileme (WES) yöntemiyle genetik profillerinin çözülmesi amaçlanmıştır. Yöntem: ALS-ilişkili olup olgudaki klinik fenotip ile uyumlu görülen nadir varyantlar WES analizi ile tanımlandı. Biyoinformatik algoritmalar aracılığıyla varyantların protein üzerindeki patojenik etkileri belirlendi. Bu varyantlar olguda ve aile bireylerinde PCR-temelli Sanger dizileme yöntemiyle analiz edildi. Bulgular: Olguların ikisinde otozomal resesif geçişli OPTN c.1400A>C: p.Gln467Pro ve SPG11 c.6759C>G: p.Asp2253Glu gen varyantları homozigot olarak saptandı. Kalan diğer altı olguda ise ALS-ilişkili genlerde dominant kalıtım gösteren genomik değişimler heterozigot olarak tanımlandı. Bir olguda KIF5A c.2738delG: p.Gly913AlafsTer135 ve CAPN3 c.1469G>A: p.Arg490Gln olmak üzere iki ayrı gende aday varyantlar gözlendi. Birbirinden bağımsız iki ailede ANXA11 c.1156C>T: p.Arg386Trp ve c.1211G>A: p.Arg404Gln değişimleri görüldü. Üç olguda ise FIG4 c.318T>G: p.Tyr106Ter, CYLD c.1189C>T: p.Arg397Cys ve HSPB1 c.139G>A: p.Gly47Ser genlerinde varyantlar saptandı. Sonuç: Anne-baba akrabalığı olan iki hastada OPTN ve SPG11 genlerindeki homozigot varyantların olgulardaki fenotipi açıkladığı görüldü. İki farklı varyantın belirlendiği olgudaki KIF5A gen varyantının ALS'den sorumlu gen olduğu anlaşılırken, CAPN3 varyantının hastalığın seyrine etkisinin ileri araştırma konusu olduğu sonucuna varıldı. ANXA11 ve HSPB1 genlerinde tanımlanan varyantların günümüzdeki bilgiler ışığında hastalık nedeni olarak değerlendirilemeyeceği öngörülmekle birlikte, presemptomatik testlerle varyantı taşıdığı belirlenen asemptomatik aile bireylerinin klinik takibinin faydalı olabileceği düşünülmektedir.
İnsan adenoviral vektör aracılı SARS-COV-2 spike gen naklinin pandemik koronavirüs hastalığına karşı (COVID-19) gelişen hücresel ve hümoral bağışıklık yanıtının belirlenmesi
Amaç: SARS-CoV-2 virüsünün neden olduğu COVID-19'a karşı güvenli ve etkili bir aşı geliştirme aciliyeti, çeşitli aşı platformlarının geliştirilmesine vesile olmuştur. Bu platformlar arasında, özellikle adenovirüsleri kullanan viral vektör bazlı aşılar önemli avantajlar sunmaktadır. Adenovirüs bazlı vektörler, geniş doku tropizmi, iyi karakterize edilmiş vektör genomları, yüksek transgen kapasitesi, doğal adjuvan etkisi ve transgene özgü güçlü T hücresi ve B hücresi yanıtları oluşturma yetenekleri ile dikkat çekmektedir. Bu çalışma, insan adenoviral vektörlerini kullanarak SARS-CoV-2 Spike proteinini kodlayan aşı vektörlerini (Ad5Spike) geliştirmeyi amaçlamaktadır. Yöntem: Gateway® Klonlama Teknolojisi kullanılarak SARS-CoV-2 Spike proteinini kodlayan bir insan adenoviral ekspresyon plazmidi (pAd5Spike) oluşturuldu. Ad5Spike, 293A hücrelerine pAd5Spike'ın CaCO4 aracılı geçici transfeksiyonu ile üretildi. Ardından CsCl yoğunluk gradientli ultrasantrifügasyon ile saflaştırıldı ve yoğunlaştırıldı. Bağışıklama için ilgili aşı vektörü, 10 mM Tris-Cl tamponunda farklı konsantrasyonlarda (108, 1010 ve 1012 viral partikül) 6-8 haftalık dişi BALB/c farelerine intraperitoneal olarak enjekte edildi. Hem hücresel hem de hümoral bağışıklık yanıtları, bağışıklamadan sonraki 30 ve 90 günlerde ELISA, ELISpot ve nötralizasyon testleri kullanılarak değerlendirildi. Bulgular: Aşılanan farelerin serumunda anti-spike IgG seviyelerinin yükseldiği gözlemlendi. Aşılanan farelerin T hücrelerinden TNF-α, IFN-γ ve IL-2 sitokinlerinin salınımının bariz bir şekilde arttığı görüldü. 3. nesil lentiviral bazlı bir psödovirüs kullanılarak yapılan nötralizasyon testleri, özellikle yüksek doz grubunda SARS-CoV-2'ye karşı nötralize edici antikorların varlığını gösterdi. Sonuç: Bu çalışma geliştirilen Ad5Spike vektörlerinin hem hümoral hem de hücresel bağışıklık mekanizmalarını aktive etme yeteneğinin olduğunu göstermektedir. Dolayısıyla bu aşının COVID-19'a karşı etkili bir koruyucu bağışıklık sağlayabilme potansiyelinin olduğunu söyleyebiliriz.
Küçük hücreli dışı akciğer karsinomlarında makrofaj aktivasyonunda etkili follistatin-like protein 1, high mobility group box1, osteopontin proteinleri arasındaki ilişkinin değerlendirilmesi
Amaç: Küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK) tümör mikroçevresinde (TME) makrofaj polarizasyonunda rol oynayan endojen proteinlerin etkilerini incelemek amacıyla Follistatin-like Protein 1(FSTL1), High Mobility Group Box1(HMGB1) ve Osteopontin (OPN) proteinlerinin ekspresyonu ve ilişkili makrofaj polarizasyonu belirteçleri araştırılmıştır. Bu çalışmada bu proteinlerin tümör mikroçevresindeki rollerinin ve makrofaj polarizasyonuna olan etkilerinin değerlendirilmesi hedeflenmiştir. Yöntem: KHDAK (n=15) hastalarından cerrahi olarak çıkarılmış tümör dokularında FSTL1, HMGB1 ve OPN mRNA seviyeleri kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) ile ölçülmüştür. Tümör ve tümöre komşu normal dokularda hedef proteinlerin ve makrofaj polarizasyon belirteçlerinin immünohistokimya (IHC) ile ekspresyonları incelenmiştir. Serum örneklerinde ise hedef proteinlerin konsantrasyonları ELISA yöntemi ile ölçülmüştür. Bulgular: Tümör dokusundaki FSTL1 ve HMGB1 protein ekspresyonları arasında anlamlı bir pozitif korelasyon bulunmuştur (p=0.017). Ayrıca, tümör dokusunda M2 makrofaj belirteci olarak bilinen CD206 protein ekspresyonu ile tümör büyüklüğü arasında pozitif ilişki saptanmıştır (p=0.033). Tümör dokusunda FSTL1 ve OPN genlerinin mRNA ekspresyonu arasında negatif korelasyon gözlenmiştir (p=0.035). Tümör dokuda HMGB1 geninin mRNA ekspresyonu ile tümör büyüklüğü arasında anlamlı bir korelasyon tespit edilmiştir (p=0.002). Sonuç: Elde edilen bulgular, FSTL1, HMGB1 ve OPN proteinlerinin KHDAK'da TME makrofaj polarizasyonu ve tümör büyüklüğü gibi önemli roller oynadığını göstermektedir. HMGB1 ve CD206'nın tümör büyüklüğünün değerlendirilmesinde ve tedavide hedefi olarak incelenmesini desteklemektedir. Gelecek çalışmalar, bu proteinlerin TME'deki sinerjik etkilerini ve mekanizmalarını daha ayrıntılı olarak araştırarak klinik uygulamalar için yeni stratejiler geliştirebilir.
Nakil bekleyen kronik böbrek hastalarında T lenfosit hücre aktivasyonu ile HIF-1α gen ekspresyonu ve protein seviyesinin araştırılması
Amaç: Bu çalışmada nakil bekleyen PRA pozitif KBH'larında antikor gelişimiyle ilişkili aktif T lenfosit (%) hücre düzeylerinin ve bu hücrelerde metabolik düzenleyici olarak görev alan HIF-1α gen ekspresyon seviyesinin belirlenmesi amaçlandı. Ayrıca bu hastalarda HIF-1α'nın T hücre aktivasyonu, immünolojik riskler ve klinik sonuçlar ile ilişkisi araştırıldı. Yöntem: Çalışma örneklemi; PRA pozitif KBH'ları (n=20), PRA negatif KBH'ları (n=16) ve kontrol bireylerinden (n=20) oluşmaktadır. Olguların periferik kan örneklerinden, Gerçek Zamanlı Kantitatif PZR ile HIF-1α gen ifade seviyesi ile Akım Sitometri ile aktif T lenfositlerin ekspresyon (%) düzeyleri değerlendirildi. Verilerin analizi IBM SPSS 25.0 programı kullanılarak istatistiki sonuçlar elde edildi Bulgular: Akım Sitometri sonuçlarına göre PRA pozitif KBH'ları ile kontrol grupları arasında CD3+CD25+CD69+HIF-1α+ hücre yüzdelerinin istatistiki bir farklılık gösterdiği (χ² (2) = 7.592, p = .022) belirlendi. PRA Pozitif KBH grubu kendi içerisinde kıyaslandığında PRA Sınıf I & PRA Sınıf II grubuna göre PRA Sınıf I grubunda hücre yüzdeleri anlamlı olarak daha daha yüksek tesbit edildi (p=0.038). Ancak HIF-1α gen ekspresyon seviyelerinde çalışma grupları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık görülmedi (χ²(2) = 4.513, p=0.105). Sonuç: Elde edilen veriler, KBH'larında HIF-1α'nın T hücre aktivasyonu ve alloantijenlere karşı gelişen bağışıklık yanıtı ile ilişkili olabileceğini göstermektedir. CD3+CD25+CD69+ aktive T hücrelerinde gözlemlenen HIF-1α artışı, T hücrelerinin fonksiyonunu etkileyerek alloantijenlere karşı daha etkili bir bağışıklık yanıtı oluşturmasına yol açabilir. HIF-1α'nın antikor oluşumu üzerindeki etkisi ve rejeksiyon riskini kontrol etmek için seçici inhibisyonunu hedefleyen terapötik yaklaşımlar, ileriye dönük araştırmaların konusu olabilir.
Fibrilin-1 proteininin ve ilişkili olduğu miR144-3p'nin insanda akut servikal arter diseksiyonuna bağlı inme patofizyolojisindeki rolü
Amaç: Bu çalışmanın amacı, fibrillin-1 proteini ve ilişkili olduğu miR-144-3p'nin akut servikal arter diseksiyonuna (SAD) bağlı inme patofizyolojisindeki rolünü araştırmaktır. Servikal arter diseksiyonu, genç yaş grubunda iskemik inmelerin önemli bir nedenidir ve patofizyolojisi tam olarak aydınlatılamamıştır. Fibrillin-1, ekstraselüler matriksin önemli bir bileşeni olup, bağ dokusu bütünlüğünün korunmasında kritik bir rol oynar. Ayrıca, miR-144-3p'nin vasküler biyolojide ve inflamatuar süreçlerde etkili olduğu bilinmektedir. Bu bağlamda, fibrillin-1 ve miR-144-3p'nin SAD'ye bağlı inme gelişimindeki potansiyel rollerinin incelenmesi, bu hastalığın moleküler mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasına katkı sağlayabilir. Yöntem: Çalışmada, SAD'ye bağlı inme geçiren 28 hasta, SAD dışı inme geçiren 28 hasta ve 28 sağlıklı kontrol grubu karşılaştırılmıştır. İnme sonrası ilk 24 saat içinde alınan periferik kan örneklerinde fibrillin-1 düzeyleri ELISA yöntemiyle, miR-144-3p ekspresyonu ise RT-PCR yöntemiyle analiz edilmiştir. Bu yöntemler, biyobelirteçlerin hassas ve güvenilir bir şekilde ölçülmesini sağlamıştır. Bulgular: SAD grubunun yaş ortalaması, diseksiyon dışı inme grubuna göre anlamlı derecede daha düşük bulunmuştur (p = 0.01). Risk faktörleri açısından gruplar arasında anlamlı bir fark saptanmamıştır. Fibrillin-1 konsantrasyonu açısından gruplar arasında genel olarak anlamlı bir fark bulunmamakla birlikte, diseksiyon ve inme grupları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark tespit edilmiştir (p = 0.042). DeltaCt, DeltaDeltaCt ve RelativeExpression değerleri açısından gruplar arasında anlamlı bir fark gözlenmemiştir. Sonuç: Bu sonuçlar, fibrillin-1 ve miR-144-3p'nin SAD'ye bağlı inme patofizyolojisinde belirgin bir rol oynamadığını düşündürmektedir. Ancak, daha geniş örneklem grupları ve farklı zaman dilimlerinde yapılacak ileri çalışmalar, bu biyobelirteçlerin potansiyel rollerini daha iyi anlamamıza katkı sağlayabilir. Anahtar Kelimeler: inme, servikal arter diseksiyonu, fibrillin-1, miR-144-3p
K562 hücre hattının traıl dirençliliğinde TRAIL-R2 tirozin fosforilasyonunun rolünün incelenmesi
Amaç: Ölüm reseptörleri, immün sistemin malignant hücreleri elimine etmede kullandığı en önemli silahlardan biridir. TRAIL, reseptörleri aracılığıyla çeşitli insan kanser hücre hatlarında etkin olarak apoptozu tetiklemektedir. Ancak bazı tümör hücrelerinin TRAIL dirençli olması, bazılarınınsa uzun süreli maruz kalım sonucunda TRAIL'e dirençlilik geliştirebilmesi hücrelerin apoptozdan kaçmasına sebep olmaktadır. İnsan KML hücre hattı olan K562 hücreleri, normalde TRAIL dirençli iken, uzun süreli imatinib muamelesi sonucunda TRAIL'e duyarlılık kazanmaktadır. Dolayısıyla TRAIL-R2 dirençliliğinde TRAIL-R2'nin, henüz bilinmeyen bir kinaz tarafından tirozin fosforilasyonu, proliferatif yolakların aktivasyonunda rol oynuyor olabilir. Biz, K562 hücre hattında TRAIL-R2 tirozin fosforilasyonunu, bu fosforilasyonu sağlayan tirozin kinazı ve TRAIL-R2 fosforilasyonunun TRAIL duyarlılığındaki etkilerini açığa çıkarmayı amaçladık. Yöntem: K562 ve HeLa hücre hattındaki TRAIL-R2 tirozin fosforilasyonu ile bu fosforilasyonda rol oynayabilecek kinazların inhibitörleriyle muamele sonrasındaki lizatlarda TRAIL-R2 ve Py20 immünopresipitasyonu sonrasında western blot yöntemi ile, bu inhibitörlerin, sodyum ortavanadatın ve tirozin fosforilasyonunu taklit eden ve önleyen mutantların TRAIL duyarlılığına etkileri ise Resazurin testi ile belirlendi. Bulgular: K562 hücre hatlarında TRAIL-R2 tirozin fosforilasyonu TRAIL muamelesi ile sabit kalmaktadır. TRAIL-R2, c-Src, JAK2 ve Abl ile aynı protein kompleksinde bulunmakta; TRAIL-R2 tirozin fosforilasyonunun Abl kinazına doğrudan bağımlı olmayıp, bu modifikasyonun ağırlıklı olarak JAK2 ve c-Src ailesi tarafından düzenlenmektedir. Imatinib, Dasatinib, Jak inhibitörleri ve PP1 fosforilasyonda belirgin bir azalma sağlarken, Imatinib dirençli hücrelerde Abl aktivitesi oldukça az olup tirozin fosforilasyonu korunmuştur. Ayrıca, Na₃VO₄'ün TRAIL ve Imatinib ile birlikte kullanımı, yabanıl tip hücrelerde hücre ölümünü anlamlı düzeyde artırırken; TRAIL-R2 nakavt hücrelerde bu etki gözlenmemiştir. Sonuç: K562 hücre hattında TRAIL-R2 tirozin fosforilasyonu sürekli olup, Abl'dan ziyade Src ve JAK2 kinazlar tarafından regüle edilmektedir. NA3VO4' ün K562 hücrelerinde toksik etki göstermesinde, TRAIL-R2 ve Abl tirozin kinazı içeren bir mekanizmanın rol oynadığını göstermektedir. Anahtar Kelimeler: TRAIL-R2, tirozin fosforilasyonu, K562 TRAIL dirençliliği
Çocukluk çağı B öncül hücreli akut lenfoblastik lösemi'de relaps ilişkili genlerin ekspresyon düzeylerinin tanı anında belirlenmesi
Amaç: Çocukluk çağı öncül B-ALL (pre-B ALL) tanısı alan olguların yaklaşık %85'i tedaviye iyi yanıt vererek remisyona girerken, %15'inde relaps gözlenmekte ve bu nedenle de hastalar kaybedilmektedir. B-ALL'de bazı genlerin ekspresyon düzeylerindeki değişikliklerin tedaviye direnç ve hastaların sağ kalım süreleri ile ilişkili olduğu bulunmuştur. Bu çalışmada, çocukluk çağı pre-B ALL olgularında konvansiyonel sitogenetik ve moleküler sitogenetik yöntemlerle belirlenemeyen relaps ilişkili AURKA, CASP1, GPM6B, NUDT15, S100A8 ve Survivin genlerinin tanı anında ekspresyon düzeylerinde değişiklik olup olmadığının belirlenerek, ekspresyonu değişen gen/genlerin relaps riskinin önceden saptanabilmesi için aday bir biyobelirteç olarak ortaya konabilmesi amaçlanmıştır. Yöntem: Pre-B ALL tanılı 15 çocukluk çağı olgusundan ilk tanı anında alınan kemik iliği ve 5 sağlıklı kemik iliği donörüne ait alınan kemik iliği aspirasyon materyallerinden RNA izolasyonunu takiben cDNA sentezi yapılmıştır. Daha sonra Kantitatif Real Time-PCR (qRT-PCR) yöntemi kullanılarak, AURKA, CASP1, GPM6B, NUDT15, S100A8 ve Survivin genlerinin; "housekeeping" gen olarak ise β-Aktin geninin mRNA ekspresyon seviyeleri araştırılmıştır. qRT-PCR elde edilen bulgular Shapiro-Wilk ve Kolmogorov Smirnov Z testi kullanılarak istatistiksel analiz yapılmıştır. Bulgular: Çalışma sonucunda kontrol grubuna kıyasla AURKA (p<0,05), CASP1 (p<0,05) ve Survivin (p<0,05) genlerinin mRNA ekspresyon düzeylerinde yaygın olarak tercih edilen yöntem olan 2-ΔΔCT analizi ile istatistiksel olarak anlamlı bir artış bulunurken, ΔCT değerleri bakımından sadece Survivin geninde istatistiksel olarak anlamlı bir fark belirlenmiştir. GPM6B, NUDT15 ve S100A8 genlerinde ise mRNA ekspresyon düzeylerinde hem ΔCT değerleri bakımından hem de 2-ΔΔCT analizi ile istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmamıştır. Sonuç: Çocukluk çağı pre-B ALL olgularında 2-ΔΔCT analizi ile AURKA, CASP1 ve Survivin genlerinin ekspresyon düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı farklılıkların tespit edilmesi relaps riskinin belirlenmesi için bu üç genin tanı anında biyobelirteç olarak kullanılabileceğini düşündürmektedir.
T-hücreli akut lenfoblastik lösemi'de PHF6 proteininin fizyolojik rolünün araştırılması
Amaç: T-hücreli Akut Lenfoblastik Lösemi, erkeklerde kadınlara göre daha sık görülen, agresif seyirli hematolojik malignensi tipidir. Olgunlaşmamış T hücreleri üzerinde, T-ALL'de tümör baskılayıcı rol oynayarak son yıllarda aday genlerden biri olan PHF6'nın hastalığın oluşumundaki biyolojik aktivitesinin rolü ve sinyal yolağının moleküler mekanizmasının aydınlatılması amaçlanmıştır. T-ALL'de PHF6 proteininin S199 noktasının protein fonksiyonuna olan etkisi ve T-ALL hücrelerinin proliferasyonu, farklılaşması ve migrasyonu üzerindeki etkisini belirlemeyi amaçladık. Yöntem: İnsan cDNA kütüphanesinden PHF6 cDNA'sı pcDNA3.1A vektörüne PCR klonlama ile klonlanması yapılan plazmide SDM yöntemi uygulanarak S199 bölgesinin A199 ve D199 dizilerine değiştirilmesi deneyi uygulandı. DND-41 hücrelerine transfekte edilen PHF6 protein ifade vektörlerinin; western blotlamayla işaretlemesi yapıldı, hücre proliferasyonuna etkileri MTT ile değerlendirilirken yabanıl tip vektörün T-hücre farklılaşması üzerine etkileri akım sitometriyle, ve hücre migrasyonuna etkisi Transwell hücre migrasyon yöntemiyle değerlendirildi. Bulgular: Transfekte edilen yabanıl tip PHF6 ifade vektörünün, DND-41 hücrelerinde ektopik ifadesinin; hücrelerin CD4+ yönünde artışı gösterilirken migrasyonu üzerinde etkisi görülmemiştir. S199A+ hücrelerde Notch1 ifadesinin azaldığı gösterildi. S199A+/D+ mutant vektörlerinin yabanıl tip ve kontrol grubuna göre hücrelerde proliferasyonu indüklediği gösterildi. Sonuç: Çalışmamız PHF6'nın T-ALL hücrelerinde hücre migrasyonunun çalışıldığı literatüre göre ilk çalışma niteliğindedir. Bu çalışmada PHF6'nın ektopik ifadesinin T-ALL hücrelerinde migrasyona etkisinin olmadığı, hücreleri CD4+ yönüne indükleme potansiyeli olduğu ve S199 bölgesinin Notch1 sinyalizasyonu ve hücre proliferasyonu için anlamlı olabileceği gösterilmiştir.
Böbrek transplantasyonundan sonra donöre özgü antikorlar gelişen alıcıların dolaşımındaki CXCR5+PD-1+CD8+ foliküler sitotoksik T hücrelerin düzeyinin ve PD-1, PDL-1 mRNA ifadesinin araştırılması
Amaç: Donore özgü antikor gelişmesi böbrek nakli başarısının önündeki en büyük engellerden biri olup, DSA'ların ortaya çıkışı ile ilişkili biyolojik olaylar bilinememektedir. Son yıllarda tanımlanan Foliküler Sitotoksik T hücre alt grubunun B hücrelerinin antikor üretimine yardım ettiği bildirilmiş ve bu hücre grubu ile DSA gelişimi arasındaki ilişki henüz aydınlatılmamıştır. Böbrek nakli olduktan 12 ay sonra DSA gelişen, DSA gelişmeyen alıcıların ve sağlıklı bireylerin periferal kan lenfositlerindeki CD8+CXCR5+PD-1+ foliküler sitotoksik T hücre düzeyleri ile PD1/PD-L1 genlerinin ifade seviyelerini incelemek, gözlenen mRNA ekspresyon ve protein seviyeleriyle korelasyonunu değerlendirmek bu tezde amaçlanmıştır. Yöntem: Bu araştırmada, 20 kişilik DSA gelişmiş hasta grubuyla aynı yaş ve cinsiyette olan 22 kişilik DSA gelişmemiş transplant ve 21 kişilik sağlıklı kontrol gruplarına ait periferik kan örneklerinden Gerçek Zamanlı Kantitatif PZR yöntemi kullanılarak PD-1, PD-L1 genlerinin ifade seviyeleri belirlendi. Akım Sitometri yöntemiyle hedef hücrelerin ekspresyon (%) düzeyleri değerlendirildi. Verilerin değerlendirilmesinde IBM SPSS Statistics for Windows Version 22 ve R.3.3.2 yazılımlarından yararlanıldı. Bulgular: Hastalarda PD-1 ve PD-L1 ekspresyon seviyesi, transplant kontrol grubuna göre daha yüksek bulunmuştur. Akım Sitometri sonuçlarına göre hastalarda, transplant kontrol grubuna kıyasla CD8+CXCR5+PD-1+ hücre ekspresyon (%) düzeyleri anlamlı olarak daha yüksek seviyededir. Sonuç: Böbrek transplantasyonu sonrasında nakil hastalarında DSA ile PD-1/PD-L1 mRNA seviyesi ve CXCR5+PD1+CD8+ foliküler sitotoksik T hücre arasında doğru orantılı bir ilişki olabileceğini göstermektedir. Anahtar Kelimeler: Böbrek Nakli, DSA, PD-1, PD-L1, CD8+CXCR5+PD-1+ foliküler sitotoksik T hücre
Transtiretin ilişkili ailevi amiloid polinöropati (TTR-FAP) tanısı almış olgularda TTR genindeki mutasyonların retrospektif olarak araştırılması
Amaç: Transtiretin ilişkili ailevi amiloid polinöropatisi (TTR-FAP), toplumda nadir görülen bir hastalık olup, otozomal dominant kalıtılan ve toksik fonksiyon kazanımına bağlı sistemik bir hastalıktır. TTR-FAP, mutant TTR proteininin başta periferik sinir hücreleri olmak üzere çeşitli doku ve organlarda amiloid fibrillerinin birikmesiyle gelişir. TTR proteini, 18. Kromozom (18q12.1) tarafından kodlanır ve 127 aminoasit içermektedir. Şu ana kadar TTR geninde 150'den fazla mutasyon tanımlanmıştır. Bu çalışmada, TTR-FAP tanılı olguların DNA dizi analizi yöntemi ile TTR genindeki varyantlarının araştırılması amaçlanmıştır. Bu olgularda incelenen mutasyonların sıklığı ile hastalığın başlangıç yaşı, klinik bulguları ve klinik seyri ile ilişkilendirilecektir. Yöntem: Bu proje, retrospektif incelemeye dayalı bir çalışmadır. 2017- Temmuz 2021 yılları arasında Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi Nöroloji ve Kardiyoloji Anabilim Dalları'ndan Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi Genetik Hastalıkları Tanı Merkezi'ne TTR-FAP ön tanısı ile gönderilen ve Tanı Merkezi'nde TTR geni için DNA dizi analizi yapılan hastaların genetik test sonuçları taranmıştır ve mutasyon tespit edilen hastaların klinik bulguları ile karşılaştırılarak değerlendirilmiştir. Bulgular: 423 olgunun 50 tanesinde mutasyon tespit edilmiştir. 21 olgu TTR geni için ekzon 3'te heterozigot c.325 G>C (p.E109Q) varyantına sahiptir. 25 olguda TTR geninde ekzon 2'de c.76G>A (p.Gly26Ser) varyantı tespit edilmiştir. Bu 25 olgunun 1 tanesi hem ekzon 3'te heterozigot c.325 G>C hem de ekzon 2'de c.76G>A genotipine sahiptir. İlave olarak 1 olguda ekzon 2'nin 9 nükleotid önünde intronik bölgede c.70-9 T>C değişimi saptanmıştır. 3 olgu ise TTR geni için ekzon 4'te saptanan c.417G>A (p.Thr139=) varyanta sahiptir. Sonuç: TTR geninde ekzon 3'te heterozigot c.325 G>C varyantına sahip 21 olgunun tek bir sülaleden gelen ve 7 aileden oluşan bireyler olduğu tespit edilmiştir. Anahtar Kelimeler: TTR-FAP, TTR geni, Retrospektif Çalışma
Pompe hastalığı tanılı olgularda glukozidaz alfa asit gen mutasyonlarının incelenmesi
Amaç: Bu çalışmada, Pompe hastalığı ön tanılı proksimal kas güçsüzlüğü, egzersiz intoleransı ve solunum güçlüğü bulunan dokuz olguda, Sanger dizileme yöntemi kullanılarak 17. kromozom üzerinde bulunan GAA genindeki, daha önceden bildirilmiş veya yeni (novel) mutasyonların saptanması amaçlanmıştır. Mutasyon bölgelerinin ve çeşitliliğinin saptanmasının, hastalığın tanısı, tedavisi ve ilerideki çalışmalar için faydalı olacağı düşünülmektedir. Yöntem: Akdeniz Üniversitesi Nöroloji polikliniğine başvuran ve çalışmayı kabul eden Pompe hastalığı ön tanılı dokuz hastadan imzalanmış onam formu ve K3-EDTA'lı tüplere10ml periferal kan örneği alınmıştır. Alınan kan örneklerinden DNA izolasyonu sonrasında primer tasarımı ve Sanger sekanslama ile mutasyon analizi yapılmıştır. Bulgular: Hastaların biyokimyasal analiz sonuçlarına göre AST, ALT, LDH ve total CK seviyeleri değerlendirilmiştir. Bu sonuçlara göre karaciğer ile ilişki enzimlerden AST, ALT ile total CK seviyelerinde anlamlı bir artış gözlenmiştir. Hastalarda toplamda beş farklı heterozigot patojenik mutasyon saptanmıştır. Hastalardan altısında heterozigot c.-32-13T>G varyantı saptanmıştır. Ayrıca altı hastada da c.2662G>T varyantı saptanmıştır. Hastalarda birinde heterozigot c.1064T>C (p.Leu355Pro) ve bir diğerinde heterozigot c.670C>T (p.Arg224Trp varyantları saptanmıştır. Bir hastada ise yeni (novel) bir patojenik heterozigot c.2417_2418insG (p.Leu807AlafsTer77) varyantı saptanmıştır. Hastalardan birinde herhangi bir patojenik varyant saptanmamıştır. Sonuç: GAA için dünya genelinde en yüksek prevalansa sahip c.-32-13T>G varyantı dokuz hastadan altısında saptanmıştır. Bu durum, c.-32-13T>G varyantının ülkemizde de yüksek prevalansa sahip olabileceğini düşündürmektedir. Analiz sonucunda klinik önemi bilinmeyen ve oldukça nadir görülen iki varyant saptanmıştır. Bu varyantlardan c.1438G>A (p.Val480Ile)'nin splicing ile ilişkilendirilmesi, patojenik bir varyant olabileceği düşüncesini güçlendirmektedir. Anahtar Kelimeler: Asit alfa glukozidaz, otozomal resesif, Pompe hastalığı, Sanger sekanslama
TNF-ilişkili apoptoz-indükleyici ligand'ın (TRAIL) obezite ve tip 2 diyabet sürecindeki etkilerinin C57Bl6 hayvan modellerinde araştırılması
Amaç: Çalışmamızda, TNF-ilişkili apoptoz-indükleyici ligand'ın (TRAIL) diyabette olası koruyucu rolünün mekanizmasının araştırılmasına yönelik olarak lentiviral vektörlerle kalıcı ekspresyonu sağlanan TRAIL'ın ve çözülebilir TRAIL molekülünün fare obezite ve tip 2 diyabet (T2D) modellerinde antidiyabetik, antiinflamatuar, proliferatif ve rejeneratif etkilerinin çalışılması hedeflenmiştir. Yöntem: Yüksek yağlı diyetle obezite geliştirilen ve ek olarak Streptozotosin (STZ) uygulaması ile kısmı beta hücre hasarı ve T2D oluşturulan C57BL6 hayvan modellerinde TRAIL ligand ve reseptörlerinin ekspresyon profilleri, immunohistokimyasal analizlerle değerlendirildi. Lentiviral vektör (LV-TRAIL) aracılı olarak ve/veya çözülebilir formda TRAIL uygulamasının antidiyabetik ve antiinflamatuar etkileri, periyodik kan şekeri ve kilo ölçümleri, intraperitonel glukoz tolerans testi (IPGTT), intraperitonel insülin tolerans testi (IPITT) ve IL-6 ELISA testi ile değerlendirildi. NIT-1 fare beta hücre hattında TRAIL'ın glukoz indüklü insülin salınımına etkisi test edildi. TRAIL uygulamasının karaciğer ve böbrek fonksiyonları üzerindeki etkisi, fonksiyon testleri ile araştırıldı. TRAIL'ın pankreasta proliferatif etkisi Ki67 ve MCM7 immunohistokimyasal boyamaları ile, rejeneratif etkisi ise PDX-1 ve CK20 immunohistokimyasal boyamaları ile araştırıldı. Bulgular: Obezite ve T2D gelişim sürecinde pankreatik dokularda TRAIL ligandı ve DR5 ve DcR2 reseptörlerinin ekspresyonlarının baskılandığı görüldü. TRAIL uygulaması, yüksek yağlı diyetle beslenen hayvanlarda tokluk kan şekerlerini düşürdü, glukoz toleransını artırarak insülin direncini azaltıcı etki gösterdi, sistemik inflamasyonu baskıladı, serum alkalin fosfataz, glukoz ve total kolesterol seviyelerini düşürdü. TRAIL, NIT-1 hücrelerinde glukoz indüklü insülin salınımını artırıcı etki gösterdi. Bunun yanında, TRAIL uygulaması sonrası pankreasta insülin ekspresyonunda ve proliferatif Ki67 ve MCM7 ve rejeneratif PDX1 ekspresyonunda artış görüldü. Sonuç: Bulgularımızın, TRAIL'ın obezite ve T2D'de henüz tam olarak karakterize edilememiş rolünün açığa çıkarılmasına ve olası bir terapötik molekül olarak değerlendirilmesine katkı sağlayacağına inanıyoruz. Anahtar Kelimeler: TRAIL, Obezite, Tip 2 Diyabet, Beta hücre replikasyonu, Beta hücre rejenerasyonu, Lentiviral vektörler, Gen tedavisi
Solid tümörlerdeki farklı hücre populasyon kinetiklerinin in vitro tümör heterojenite modelinde incelenmesi
Amaç ve Hipotez: Bu çalışmada, aynı tümörden türemiş, farklı genetik profillere sahip altklonların fluoresan ile işaretlenerek bir arada üretildiği ve değişik koşullara maruziyet sonrasında bu klonların kinetik davranışlarının araştırıldığı tümör heterojenitesinin in vitro bir modelinin oluşturulması hedeflenmektedir. Tez çalışmasının hipotezi, intratümöral anöploidi farklanmalarının kanser progresyonunu farklı düzeylerde etkilemekte olduğudur. Yöntem: İlk olarak DLD-1 kolon kanseri hücre hattından izogenik near-diploid ve near-tetraploid altklonlar, akım sitometrisi yöntemiyle ayrıştırılmıştır. Bu altklonlar önce farklı renkteki fluoresan proteinlerle işaretli vektörlerle enfekte edilerek işaretlenmiş; sonra eşit oranlarda bir arada üretilerek bir in vitro tümör heterojenite modeli oluşturulmuştur. Genetik profilleri tanımlanan bu klonların, yaratılan farklı mikroçevre koşulları karşısında (kemoterapötikler, radyasyon ve hipoksi), aralarındaki davranış farklılıkları karşılaştırılarak, hangi koşulda hangi varyasyonun avantaj sağladığı ve farklı koşullardaki dirençten sorumlu olabilecek genetik varyasyonlar belirlenmiştir. Bulgular: DLD-1 altklonlarının karakterizasyonu ve stabil fluoresan işaretlemeleri başarıyla gerçekleştirilmiştir. Oluşturulan in vitro intratümöral heterojenite modelleri zamana bağlı olarak ve çeşitli terapi etkileri altında izlenmiştir. Altklonlar üzerinde gerçekleştirilen populasyon davranışlarının belirlenmesine yönelik olarak gerçekleştirilen deney sonuçları, NIH Ried Lab'da gerçekleştirilen genomik analizlerle karşılaştırılarak kanserde ilaç direncine neden olabilecek moleküler düzeydeki mekanizmalar işaret edilmiştir. Sonuç: Kanser terapi direncinin altında yatan temel nedenlerden biri de tümör içi hücresel heterojenitedir. Özellikle uygulanan tedavi yöntemlerinin yarattığı değişik mikroortam koşullarına uyumda avantaja yol açabilecek mutasyon ve epigenetik desenleri barındıran klonal kanser hücre populasyonlarının, tedaviye dirençten sorumlu olduğu bilinmektedir. Bu nedenle bu altklonların tanımlanması ve bu kanser hücrelerine karşı etkili tedavi yöntemlerini geliştirmesi elzemdir. Bu çalışma ile, kanserde ilaç direncine neden olabilecek mekanizmaların aydınlatılmasına yönelik büyük adımlar atılması sağlanmıştır.
Adherent tip hücre kültürleri için nanofiber temelli 3D hücre taşıyıcı ve kriyoprezervasyon sistemleri
Son zamanlarda hücre-temelli (cell-based) ve elektrokimyasal biyosensörleri kullanan ileri çip-üstü-laboratuvar (lab-on-a-chip) cihazları geliştirmek için önemli çabalar sarf edilmektedir. Buna rağmen, mevcut sistemler, "yerinde kullanıma-hazır" (ready-to-use on-site) formatlar için hala uygun değildir, çünkü cihazın içindeki hücrelerin, son kullanıcıya alışılagelmiş nakliyatı sırasında hayatta kalmayı sağlayacak inkübatör koşullarına (CO2, besinler, vb.) ihtiyaçları vardır. Bu çalışmada, adherent hücrelerin bir sensör yüzeyinde, örn. ışıkla-adreslenebilen potansiyometrik sensör (LAPS), dondurularak (-80°C) korunmasını sağlayan sensör-üstü kriyoprezervasyon (OSC) adını verdiğimiz bir strateji ortaya koyuldu. LAPS yüzeyindeki adherent hücrelerin kriyo-hasarına eğilimli olduğu anlaşıldı. Bu yüzden, yüzey OSC sonrası hücre geri kazanımını arttırmak üzere modifiye edildi. Bu modifikasyon: i) yüksek termal genleşme katsayısına ve düşük camsı geçiş sıcaklığına sahip polietilen vinil asetattan (PEVA) oluşan elastik elektro-eğirilmiş liflerinin entegrasyonuna ve ii) O2 plazma ile muamele edilmesine dayanmaktadır. Modifiye edilmiş sensör, yalnız hızlı çözme için kritik olan termal kütleyi azaltmak için değil, aynı zamanda hassas bir şekilde kontrol edilebilen bir mikro-ortam sağlamak için bir mikroakışkan çip sistemine entegre edildi. Bu yeni kriyo-çip sisteminin, OSC sırasında hücreleri canlı tutmak için etkili olduğu bulundu. Konseptin ispatı deneyleri kapsamında, kanser hücrelerinin (CHO-K1) hücre dışı asitleştirilmesi, diferansiyel LAPS ölçümleri ile değerlendirildi. Sonuçlar, literatürde ilk kez, kriyo-çip kullanan OSC'ye dayalı stratejimizin, çözmeden hemen sonra etiketsiz ve kantitatif ölçümlere izin verdiğini ve bunun da çözme sonrası ek kültürleme adımlarını ortadan kaldırdığını gösterdi. Üretim aşamasındayken hücreleri içeren çiplerin OSC'ye dayalı dondurulması ve bir soğuk-zincir nakli yoluyla son kullanıcıya gönderilmeleri, "yerinde kullanıma-hazır" formatı mümkün hale getirebilir. Dahası, bu strateji, gelecekte diğer hücre-temelli çip-üstü-laboratuvar cihazlarına da potansiyel olarak uyarlanabilir.
Hepatosellüler karsinomada glukoz metabolizması ve c-met yolağının etkileşiminin irdelenmesi
Amaç: Bu tez çalışması kapsamında hepatosellüler karsinoma (HCC) hücrelerinde yüksek glukoz ve insülin uyarımı sonucu c-Met ve insülin reseptörü karşılıklı etkileşiminin HCC hücrelerinin biyolojik yanıtlarına etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Yöntem: Bu araştırmada immünblotlama ve immünfloresans, birlikte-immünçökeltme, kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu, gerçek zamanlı hücre adezyon ve proliferasyon testi, motilite ve invazyon analizi, Seahorse hücre metabolizması analizi ve zebrabalığı zenograft modelinde metastaz testi yöntemleri kullanılmıştır. Bulgular: Yüksek glukoz ve yüksek insülin ile uyarılan HCC hücrelerinde c-Met'in ekspresyonunda ve aktivasyonunda artış olduğu belirlenmiştir. Bu uyarımlar ile c-Met altında yer alan proteinlerin aktive olduğu gösterilmiştir. HCC hücre metabolizmasının c-Met inhibisyonundan etkilendiği görülmüştür. c-Met'in insülin reseptörü ile karşılıklı etkileşimi incelenmiş, yüksek glukoz ve insülin uyarımı sonucu iki reseptörün daha yüksek oranda etkileştiği saptanmıştır. HCC hücrelerinin proliferasyon, adezyon, migrasyon ve invazyon yeteneklerinin yüksek glukoz ve insülin varlığında arttığı, c-Met inhibisyonu ile baskılandığı görülürken, ilaveten insülin reseptörü inhibisyonu ile bu özelliklerin daha da baskılandığı belirlenmiştir. Sonuç: Bu çalışma ile ilk kez yüksek glukoz ve insülin varlığında insülin reseptörü ve c-Met'in etkileştiği, bu etkileşimin daha metastatik HCC hücrelerinin oluşumunu sağladığı belirlenmiştir. İki reseptörün inhibisyonu ise HCC hücrelerinin bu kabiliyetlerini sınırlamaktadır ve özellikle obezite temelinde gelişen HCC'de iyi birer tedavi adayı olarak önerilmektedir.
Nörogelişimsel bozukluklar ile ilişkili mutasyonların genetik ve fonksiyonel karakterizasyonu
Nörogelişimsel bozukluklar, merkezi sinir sisteminin büyüme ve gelişme hasarları ile ilişkili, bilişsel, nörolojik ve psikiyatrik bozukluklardan oluşan geniş bir yelpazeyi kapsamaktadır. Son yıllarda genetik alanındaki gelişmeler sayesinde bu bozukluklarla ilişkili yeni birçok gen ve lokus tanımlanmasına rağmen; çoğu hastada hâlâ spesifik tanı konulamamakta, tedavi planlanamamaktadır. Bu durumda genetik ve fenotipik heterojenitenin rolü büyüktür. Çalışmanın amacı ebeveynleri akraba olan, nörogelişimsel bozukluğa sahip çocukların hastalık fenotipleriyle ilişkili olabilecek aday gen/gen bölgelerini belirlemek ve ELP6 geninde saptanan mutasyonun etkisini fonksiyonel çalışmalarla ortaya koymaktır. Çalışmanın genetik analiz aşamasında beş hasta çocuğun yer aldığı üç ailede tüm ekzom dizileme analizi yapılmış, biyoinformatik analizlerle aday genler önceliklendirilmiş, mutasyonlar Sanger dizilemeyle doğrulanmıştır. Aile-1'de iki kardeşte OCLN geninde saptanan frameshift mutasyonun (p.Trp58Phefs*10) Türkiye popülasyonunda "founder" etkisi olabileceği düşünülmektedir. Aile-2'de saptanan OCLN genindeki novel homozigot missense mutasyon (p.Ile67Phe) BLC-PMG fenotipi için ek genetik bulgular sunmaktadır. Aile-3'te iki kardeşte ELP6 geninde homozigot missense mutasyon (p.Leu118Trp) saptanmıştır. Çalışmanın fonksiyonel analiz aşaması Elongatör kompleksinin subuniti olan ELP6 genine yöneliktir. Aile-3'teki iki kardeş, anneleri ve kontrol bireyden punch deri biyopsi örnekleri alınmış, primer hücre kültürleri oluşturulmuştur. RNA dizileme, tRNA modifikasyon analizi, migrasyon analizi yapılmış ve dört bireyin verileri kıyaslanmıştır. RNA dizileme analiziyle ekspresyonu anlamlı düzeyde değişen genler belirlenmiş ve elde edilen sonuçlar Elongatör kompleksinin işlevleriyle uyumlu bulunmuştur. tRNA modifikasyon analizi sonucunda hastalarda Elongatör ilişkili modifikasyonlarda azalma tespit edilmiştir. Hastalara ait hücrelerin migrasyon hızlarının kontrolden yüksek olduğu gözlenmiştir. Sonuç olarak elde edilen verilerle OCLN gen varyantları genişletilmiştir. Literatürde ilk defa insanda ELP6 gen mutasyonu bildirilmiştir. Fonksiyonel analiz sonuçlarının, ELP6'nın işlevini anlamaya katkı sağlayacağı düşünülmektedir.
Parafine gömülü pankreas kanseri doku örneklerinde sirkadiyen ritim genlerinin ekspresyonlarının araştırılması
Amaç: Sirkadiyen ritim genleri hücrelerde önemli yolakların kontrolünü sağlar. Pankreas kanseri, tedavisi en zor kanserlerden birisi olup, 5 yıllık sağkalım ortalama %7 kadardır. Bu çalışmada pankreas kanseri dokularındaki sirkadiyen ritim genlerinin ekspresyon seviyelerindeki farklılıkların araştırılması amaçlanmıştır. Yöntem: Parafine gömülü pankreas tümörü ve tümör dokusuna bitişik normal dokulardan total RNA izolasyonu yapılarak cDNA'ya çevrilmiştir. Daha sonra revers transkriptaz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ve kuantitatif (quantitative) gerçek zamanlı (real-time) PZR (qRT-PCR) yapılarak, seçilen sirkadiyen ritim genlerinin BMAL1, CLOCK, PER1, PER2, CRY1, CRY2 ekspresyon seviyeleri değerlendirilmiştir. Ekspresyon seviyeleri istatistiksel olarak analiz edilmiştir. Bulgular: Çalışmaya dahil edilen pankreas kanseri tanılı 22 hastanın 11'i kadın, 11'i erkek olup 43 ile 85 yaş aralığında dağılım göstermiştir. Üç tekrarlı olarak yapılan qPCR çalışması sonucunda elde edilen 2-ΔΔCT değerleri doğrultusunda Wilcoxon testi uygulanmıştır. Tümör ve tümör dokusuna bitişik normal dokularda seçilen genlerin ekspresyon seviyeleri karşılaştırılmıştır. Bu doğrultuda BMAL1 için p=0,529 (p>0,05), CLOCK için p=0,538 (p>0,05), PER1 için p=0,947 (p>0,05), PER2 için p=0,827 (p>0,05), CRY1 için p=0,886 (p>0,05), CRY2 için p=0,938 (p>0,05) değerlerine ulaşılmıştır. Sonuç: Pankreatik Duktal Adenokarsinom tanısı almış 22 hastanın tümör dokusu ve tümör dokusuna bitişik normal dokusunun sirkadiyen ritim genlerinin ekspresyon farklılıkları incelenmiştir. Ekspresyon düzeyleri 22 hastada toplu olarak karşılaştırıldığında istatistiksel olarak bir değişim bulunmadığı sonucuna varılmıştır. Ancak, her hasta tek tek incelendiğinde, ekspresyonlarında bir takım değişimler saptanmıştır.
Dejeneratif retinal gen tedavi çalışmaları için yeni deney hayvan modelinin oluşturulması
Amaç: Kalıtsal retinopatiler, fotoreseptörlerin yapı ve fonksiyonunu bozan mutasyonların neden olduğu, retinal dejenerasyonla karakterize bir hastalıktır. Hastalığa sebebiyet veren mutasyonların çoğu rod hücrelerinde görülse de rod hücrelerinin kaybı zaman içerisinde koni hücrelerinin de dejenerasyonuna ve sonuçta körlüğe neden olur. Farklı hücre gruplarında görülebilen hastalıkla ilişkilendirilmiş mutasyonların tipi dejenerasyon sürecini etkilese de kalıtsal retinal distrofilerde görülen patoloji birbirine benzerdir. Bu bağlamda, kalıtsal retinal distrofilerin ortak hastalık patolojisini taklit eden yeni bir deney hayvan modelinin oluşturulması amaçlandı. Yöntem ve Bulgular: Retinal dejenerasyonun indüklenmesi için hücrelerde hipoksi oluşturma etkileri ile bilinen kobalt klorür (CoCl2) kullanıldı. Hastalık modelinin in vitro koşullarda oluşturulması amacıyla RPE ve mikroglia hücrelerine farklı dozlarda CoCl2 uygulamasından sonra kimyasalın hücre canlılığı üzerindeki etkileri MTT testleri ile analiz edildi. Hücrelerin hipoksik durumları ise HIF-1α proteinine karşı yapılan western blot ve immünofloresan boyama yöntemleri ile belirlendi. Hastalık modelinin in vivo olarak da oluşturulması için Wistar sıçanlara dozları 5 – 500 nmol arasında değişen CoCl2 çözeltisinin intravitreal enjeksiyonları yapıldı. Takip süresi sonunda sakrifiye edilen sıçanlardaki retinal dejenerasyon, parafine gömülen göz dokularının hematoksilen ve eozin boyaması ile gösterildi. Fotoreseptörlerin dış segmentinde başlayıp, artan doz ve takip süresine bağlı olarak tüm retinal tabakalara yayılan progresif retinal dejenerasyon tespit edildi. Erken dönemlerde alınan göz dokularındaki TUNEL boyamada ise uygulamanın ilk 48 saatinde dış nükleer tabakada yoğun apoptotik hücrelere rastlandı. Sonuç: CoCl2 uygulamalarıyla kimyasal ajan indüklü, progresif retinal dejenerasyon in vivo deney modeli başarıyla oluşturuldu. Anahtar Kelimeler: kobalt klorür, hipoksi, progresif retinal dejenerasyon
Böbrek nakli hastalarında akut ve kronik rejeksiyon ile HLA-G geni 3' utr 14 baz çiftlik polimorfizminin ve SHLA-g seviyesinin ilişkisi
Amaç: Alıcı immün sisteminin grefte verdiği immünolojik yanıtı olan rejeksiyon, böbrek naklinin en önemli sorunudur. Bu çalışmada, AÜHONM'de böbrek nakli olan ve akut veya kronik rejeksiyon tanısı alan hastalarda sHLA-G seviyesinin saptanması, alıcı ve vericide HLA-G 3'UTR 14bç polimorfizminin belirlenmesi, sHLA-G ve 3'UTR 14bç polimorfizmi ile rejeksiyon arasındaki ilişkinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Yöntem: Hasta ve vericisinin periferik kan örneğinden gDNA izolasyonu, PZR, agaroz jel elektroforezi ve DNA dizileme yöntemi kullanılarak HLA-G 3'UTR 14bç polimorfizmi saptandı. Serum örneklerinden ELISA yöntemi ile sHLA-G seviyesi saptandı. Verilerin analizi için 'SPSS for Windows 18' programı ve Epi İnfo programı versiyon 7 Statcalc kullanıldı. Olgu ve kontrol gruplarının karşılaştırılmasında, sürekli değişkenler için student's t-testi, kategorik değişkenler için ki-kare kullanıldı. Bulgular: Çalışmaya alınan olgu grubunda akut rejeksiyon tanısı alanlar %41,6 iken, bunların %76,9'u akut antikor aracılı rejeksiyon, %23,1'i T hücre aracılı rejeksiyondur. Kronik rejeksiyon tanısı alanlar %58,4 iken, bunların %94,5'i kronik aktif humoral rejeksiyon, %5,5'i kronik T hücre aracılı rejeksiyondur. Lojistik regresyon analizinde böbrek nakli hastalarında akut rejeksiyon olma olasılığının, hastanın nakil öncesine göre nakil sonrası sHLA-G seviyesindeki bir U/ml'lik düşmede 1,06 kat, hasta ile verici arasında akrabalık olmaması durumunda 5,44 kat arttığı saptanmıştır. Kronik rejeksiyon olmasını etkileyebilecek faktörleri belirlemek amacıyla kullanılan regresyon analizinde ise, böbrek nakli hastalarında rejeksiyon olma olasılığının, hastanın nakil öncesine göre nakil sonrası sHLA-G seviyesindeki bir U/ml'lik düşmede 1,14 kat arttığı saptanmıştır. Sonuç: Hastaların nakil öncesi HLA-G 3'UTR 14bç polimorfizminin ve buna bağlı sHLA-G seviyesinin belirlenmesinin rejeksiyon olasılığının öngörülmesini, ayrıca bu polimorfizmi ve sHLA-G seviyesinin izlenmesi, rejeksiyon riski daha yüksek hasta popülasyonunun belirlenmesine yardımcı olacaktır. Anahtar Kelimeler: HLA-G 3' UTR 14 bç polimorfizm, sHLA-G seviyesi, böbrek nakli, akut ve kronik rejeksiyon
Hepatosellüler karsinomda epitelial-mezenkimal transizyon sürecinde C-met sinyalizasyonu ve lncRNA hotair'ın ilişkisinin araştırılması
Amaç: Bu çalışmada hepatosellüler karsiomda (HCC) epitelial-mezenkimal transizyon (EMT) sürecinde c-Met tirozin kinaz reseptörü ile lncRNA HOTAIR'in olası ilişkisinin araştırılması hedeflenmiştir. Yöntem: Araştırmada kantitatif PCR, immünblotlama, floresan işaretleme, konfokal/floresan görüntüleme, gerçek zamanlı hücre proliferasyon, motilite ve invazyon analiz sistemi, akış sitometrik hücre döngüsü analiz yöntemleri kullanılmıştır. Bulgular: İnsan HCC hücre hatlarında c-Met ekspresyon/aktivasyon ve HOTAIR ekspresyon seviyeleri belirlenmiş, HOTAIR ekspresyonu ile c-Met aktivasyonu arasında ters korelasyon olduğu belirlenmiştir. Çalışmamızda; (I)HCC hücrelerinde ligand bağımlı ve bağımsız c-Met aktivasyonunun HOTAIR ekspresyonunu baskıladığı ve c- Met aktivitesinin engellenmesinin HOTAIR ekspresyonunu geri çevirdiği; (II)HOTAIR knock-down edildiğinde c-Met ile karşılıklı haberleşerek ligand-bağımsız c-Met aktivasyonunda rol alan Caveolin-1 ekspresyonunun arttığı; (III)HCC'de HOTAIR aşırıekspresyonunun c-Met ve Caveolin-1 ekspresyonunu/aktivasyonunu baskıladığı; (IV)HOTAIR'ın c-Met transdüksiyonunda rol alan Src-kinaz ve Erk1/2'nin aktivasyonunu baskılayarak c-Met sinyalizasyonu ile regule edilen motilite ve invazyon kapasitesinin kaybedilmesine ve proliferasyonun baskılanmasına neden olduğu; (VI)HOTAIR aşırı ekspresyonunun hücre adhezyon moleküllerinin ekspresyonunun regule ederek HCC hücrelerinin adhezyon-bağımsız sağkalıma katkı sağladığı saptanmıştır. Sonuç: Sonuç olarak tez çalışması literatürde ilk kez kanserde c-MET/Caveolin- 1/HOTAIR moleküler ilişkisini ve HCC'deki fonksiyonunu tanımlamıştır. Anahtar kelimeler: HCC, lncRNA, Caveolin-1, c-Met
Beta-talasemi majör hastalarında TAL1 geni ekspresyon düzeyinin belirlenmesi ve HbF ile ilişkisinin araştırılması
Amaç: Hemoglobinopatiler dünyada görülen en yaygın tek gen hastalıklarıdır. Hemoglobinopatilerden biri olan beta-talasemi için postnatal dönemde fetal γ-globin ekspresyonunun HbF düzeyini yükseltmesi, modifiye edici faktörlerden biri olup, hastalık semptomlarını azaltmaktadır. Bu çerçevede projemizin amacı, HbF düzeyi yüksek olan beta-talasemi majör hastalarında gamma globin promotor bölgesini regüle eden transkripsiyon faktörü TAL1'in ekspresyonu ve HbF yüksekliği arasındaki ilişkiyi araştırmaktır. Yöntem: Çalışmamızda 30 beta-talasemi majörlü ve 30 normal kontrol bireyinde, RNA izolasyonunu takiben, cDNA elde edilerek, TAL1 ekspresyon profili tayini için qRT-PCR yöntemi kullanıldı. Çalışmada referans olarak bir housekeeping gen olan GAPDH kullanıldı. Normalizasyonu takiben, TAL1 ile GAPDH ve normal kontrollerin ekspresyon düzeyleri kıyaslandı. HbF yüksekliği ile TAL1 ekspresyon seviyeleri karşılaştırıldı ve tüm sonuçlar yüzde olarak hesaplandı. Bulgular: Çalışmamıza alınan HbF'i yüksek beta talasemi majörlü 30 hastanın ortalama hemoglobin değeri 8,63 iken, ortalama HbF değerinin %10,23 olduğu görüldü. En sık görülen allelin %55 sıklıkla IVS.I.110 (G>A) alleli olduğu bulundu. qRT-PCR sonuçlarında 30 hastanın %76,6'sında (23 hastada) 1,1 ila 5,2 kat arasında artış gözlenirken, 7 hastada normal seviyede tespit edildi. İki katın altında TAL1 ekspresyonu 13 hastada gözlenirken, 2 katın üzerinde görülen 10 hastadan 8'inin en yüksek HbF düzeyine sahip olduğu bulundu. Sonuç: Çalışmamızda hasta sayısının az olmasına rağmen, HbF'i yüksek olan beta-talasemi majör hastalarımızın %76'sında yüksek HbF oranı ile artmış TAL1 geni ekspresyon seviyesi arasında pozitif yönde bir ilişki bulunmuştur. Bu sonuç bize, TAL1 ve onun bağlandığı bölgelerin, HbF indüksiyonu ile tedavi seçeneği için yeni araştırma hedefleri olabileceğini göstermektedir. Anahtar Kelimeler: Hemoglobinopatiler, Beta-Talasemi Majör, HbF, TAL1, qRT-PCR.
Akciğer karsinomu hücre hatlarında epidermal büyüme faktörü reseptörü ekspresyonunda P38, jun-n-terminal kinaz, protein kinaz a ve glikojen sentaz kinaz-3β'nın rolü
Amaç: Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) özellikle küçük hücreli dışı akciğer karsinomu (KHDAK) hastalarının çoğunda aşırı eksprese edilebilmekte veya aktive edici mutasyonlarla tümör patogenezinde rol almaktadır. Çalışmamızın amacı, KHDAK hücre hattında P38, Jun-N-terminal Kinaz (JNK), Protein Kinaz A (PKA) ve Glikojen Sentaz Kinaz-3β (GSK-3β) inhibitörlerini kullanarak EGFR ekspresyon seviyesi üzerine etkilerini araştırmaktır. Yöntem: A549, H1299 ve H1650 olarak bilinen akciğer kanseri hücre hatları içinde en yüksek EGFR ekspresyonuna sahip olan hücre hattı belirlenmiş ve bu hücre hattında, ayrı ayrı P38, JNK, PKA ve GSK-3β'nın spesifik inhibitörleri ile muamele sonrası Epidermal Büyüme Faktörü (EGF) indüksiyonu yapılarak ve yapılmadan EGFR ekspresyon seviyelerine bakılmıştır. Elde edilen ekspresyon seviyeleri kontrol grupları ile karşılaştırılmıştır. Bulgular: H1299 hücre hattında, P38, JNK, PKA ve GSK-3β'nın spesifik inhibitörleri ile muamele sonrasında EGF indüksiyonu yapılan ve yapılmayan gruplarda, EGFR ekspresyon seviyelerinde istatistiksel olarak anlamlı düşüş saptanmıştır. EGF ile muamele edilen gruplarda, EGF muamelesi yapılmayanlara göre daha yüksek EGFR ekspresyon seviyesi tespit edilmiştir. Sonuç: Çalışmamız P38, JNK, PKA ve GSK-3β'nın EGFR'nin hücre içi protein miktarı üzerine etkileri olabileceğini düşündürmektedir. Ancak sadece ekspresyon seviyesine bakarak bu sonuca ulaşılmamalı, hücre içi EGFR seviyesine etkili mekanizmalar kompleks olarak değerlendirilmelidir. EGFR hedefli tedaviler yanı sıra ilişkili sinyal yolaklarının belirlenerek hedeflenmesi, kanser tedavisinde daha etkili sonuçlar almamıza katkı sağlayacaktır.
İnsan embriyonik böbrek hücrelerinden kodon optimize mini intronik plazmid aracılı uyarılmış pluripotent kök hücre oluşturulması ve karakterizasyonu
Amaç: Uyarılmış pluripotent kök hücreler (uPKHler), rejeneratif tıp ve in vitro hastalık modellemeleri gibi birçok alanda önemli potansiyele sahiptir. uPKH oluşturma metodojilerinin verimliliklerinin ve güvenliliklerinin geliştirilmesi amacıyla yeniden programlama faktörlerinin yüksek ekspresyonu, verim arttırıcı küçük moleküllerin kullanılması, farklı vektör sistemlerinin kullanımı gibi yaklaşımlardan yararlanılmaktadır. uPKH eldesinde kullanılan entegre olmayan vektörlerden kodon-optimize mini intronik (CoMiP) plazmidler, etkin, uygun maliyetli ve güvenli vektörler olarak kullanım alanı bulmaktadır. Çalışmamızda, CoMiP plazmidleri ve sodyum butirat molekülünü birarada kullanarak HEK293T insan embriyonik böbrek hücrelerinden uPKH eldesini ve karakterizasyonunu amaçladık. Yöntem: Çalışmamızda, HEK293T hücrelerinin yeniden programlanması amacıyla OSKM faktörlerini (Oct-4, Sox2, Klf4 ve c-Myc) ve p53'e karşı kısa hairpin RNA'yı birarada kodlayan "MIP 247 CoMiP 4in1 with shRNA p53" plazmidleri ile, Lin28 ve Nanog moleküllerini birarada kodlayan "MIP 339 CoMiP coLin28 2A Nanog IRES eGFP" plazmidleri kullanıldı. Elektroporasyon ve lipofektamin aracılı ko-transfeksiyonların etkinlikleri, vektörlerin taşıdığı floresan belirteçlerin ışımalarıyla takip edildi. uPKH kolonilerinin karakterizasyonları, morfolojik kriterler, pluripotensi belirteçlerine yönelik immunositokimyasal/immunofloresan analizler, ve embryoid cisimcik (EC) oluşturma etkinliğinin test edilmesiyle gerçekleştirildi. Bulgular: CoMiP mini intronik plazmid ve sodyum butiratın birarada kullanıldığı etkin bir yaklaşımla HEK293T hücrelerinden uPKH eldesi gerçekleştirildi. Elde edilen koloniler, pluripotensi belirteçleri olan alkalin fosfataz, Tra-1-81, Tra-1-60, Oct4, Klf4, c-Myc ve Nanog açısından pozitifti ve ECler oluşturabildi. Sonuç: Çalışmamızda kullanılan geriye programlama yaklaşımı, etkin, uygun maliyetli ve güvenli bir strateji olarak farklı hücrelerin geriye programlamasında kullanılabilir. uPKHlerin, farklılaştırıldıktan sonra çeşitli hastalıklarda in vitro model oluşturma ve terapötik amaçlı olarak kullanılma potansiyelleri önemlidir. Anahtar Kelimeler: uyarılmış pluripotent kök hücreler, CoMiP plazmidler, elektroporasyon, lipofeksiyon, sodyum butirat
Diffüz büyük B hücreli lenfoma hastalarında PD-1 ve CTLA-4 gen varyasyonları ile ekspresyon seviyelerinin ilişkisi
Amaç: Diffüz Büyük B Hücreli Lenfoma (DBBHL) klinik, morfolojik ve sitogenetik özellikler bakımından heterojendir. Non-Hodgkin lenfomaların en sık karşılaşılan agresif seyirli tipidir. Lenfomanın tedavi stratejilerinden biri olan immünoterapi, immün kontrol noktası inhibitörlerini hedef alır. Birçok hastalıklara ilişkin PD-1, PD-L1, CTLA-4 ve CD80 genlerinin araştırılması fenomen haline gelmiştir. Bu tezin amaçları DBBHL'de i) çeşitli kanser türleriyle önemli ilişkileri olan bu dört genin polimorfizmleri incelemek, ii) gözlenen genetik varyantların mRNA ekspreyon ve protein seviyeleriyle korelasyonunu değerlendirmek, iii) bulgular doğrultusunda hastalığın patogenezine katkıda bulunmaktır. Yöntem: Bu araştırmada, 20 kişilik hasta grubuyla aynı yaş ve cinsiyette olan 20 kişilik kontrol gruplarına ait periferik kan örneklerinden DNA dizileme yöntemi kullanılarak PD-1, PD-L1, CTLA-4 ve CD80 genlerindeki ilgilenilen polimorfizmler saptandı. Gerçek Zamanlı Kantitatif PZR yöntemi kullanılarak hedef genlerin ifade seviyeleri belirlendi. Akış Sitometri yöntemiyle hedef hücrelerin ekspresyon (%) düzeyleri değerlendirildi. Verilerin değerlendirilmesinde IBM SPSS Statistics for Windows Version 22 ve R.3.3.2 yazılımlarından yararlanıldı. Bulgular: Hastalarda PD-1, PD-L1 ve CTLA-4 ekspresyon seviyesi, kontrol grubuna göre daha yüksekti. PD-1 (rs2227981), PD-L1 (rs4143815) ve CTLA-4 (rs231775) polimorfizmleri, bu genlerin ekspresyon seviyeleriyle ilişkili olabilir. Akış Sitometri sonuçlarına göre hastalarda kontrol grubuna kıyasla sadece CD4+PD-1+ ve CD4+PD-L1+ hücre ekspresyon (%) düzeyleri anlamlı bulundu. Sonuç: DBBHL'de PD-1, PD-L1 ve CTLA-4 gen polimorfizmleri ve buna bağlı PD-1, PD-L1 ve CTLA-4 ifadelerinin tespiti önemlidir. Elde ettiğimiz bulgular ışığında, bu genlerin DBBHL patogenezinin ve prognozunun anlaşılmasına katkı sağlayabileceğine inanmaktayız.
Lentivirus aracılı glp-1 gen naklinin pankreasın beta hücreleri üzerindeki potansiyel proliferatif ve farklılaştırıcı etkisi
Amaç: Glukagon-benzeri-peptid-1(GLP-1), glukoz indüklü insülin sekresyonunu arttırıcı özellikleri ve beta hücre kitlesini arttırabilme potansiyeliyle Tip 2 Diyabet (T2DM) tedavisinde potansiyel bir terapötik ajan olarak değerlendirilmektedir. GLP-1 etkisiyle gastrik boşaltımın yavaşlaması ve gıda alımının azalması uzun vadede kilo kaybına sebep olur. Pankreatik alfa hücrelerinden glukagon salınımının baskılanması GLP-1'in diyabet tedavisine ilişkin yararlı etkilerinden bir diğeridir. T2DM hastalarında ise glukoza verilen inkretin yanıtı azalmış olup, hastalık düşük GLP-1 sekresyonuyla birlikte seyreder. Yöntem: Stabil GLP-1 sentez ve sekresyonu sağlamak amacıyla GLP-1 kodlayan 3. jenerasyon HIV tabanlı lenviral vektörler (LentiGLP-1) üretildi. Bu vektörlerin terapötik etkinliği, yüksek yağlı diyet/düşük doz STZ uygulamalı deneysel T2DM sıçan modelinde test edildi. Beta hücre gelişim mekanizmasını açığa çıkarmak amacıyla sıçanların pankreatik doku kesitlerinde immünohistokimyasal analizler gerçekleştirildi. Bulgular: Elde edilen bulgular, diyabetik SD sıçanlara intraperitoneal (ip) LentiGLP-1 vektör uygulamasının, insülin direncini kırdığını, glukoz toleransını geliştirdiğini ve kan şeker seviyesini düşürdüğünü gösterdi. LentiGLP-1 enjekte diyabetik deneklerde kolesterol düzeyi değişmeksizin serum trigliserid seviyesinde bir azalma gözlemlendi. Artan pankreatik beta hücre kitlesi, azalan kan şeker seviyeleriyle korelasyon gösterdi. Pankreatik kesitlerde gözlenen insülin pozitif hücre kümeleriyle birlikte, pankreatik dokunun asiner bölgelerinde Ki67 pozitif hücreler gözlendi. Sonuç: Bu çalışmayla, LentiGLP-1 vektörünün T2DM hastalarında yeni bir gen tedavi metodu olarak değerlendirilebileceği ve GLP-1 gen naklinin pankreatik hücrelerde proliferasyonu indükleyerek beta hücre geri kazanımına etki ettiği belirlendi. Anahtar Kelimeler: gen tedavi, glukagon benzer peptid-1, tip 2 diyabet, beta hücreleri
Sendromik olmayan kraniyosinostozlu pediatrik olgularda olası aday genlerin tüm ekzom dizileme yöntemi ile incelenerek genotip – fenotip ilişkisinin değerlendirilmesi
Amaç: Sendromik olmayan kraniyosinostoz, prematür sütür füzyonunun yol açtığı konjenital bir malformasyondur. Projemizde, hedefli ekzom dizileme analizi kullanarak, sendromik olmayan kraniyosinostozun olası genotip-fenotip ilişkisinin aydınlatılması amaçlanmıştır. Yöntem: Sendromik olmayan kraniyosinostoz tanılı olgulardan, FGFR2 geni ekzon IIIa ve IIIc bölgelerinde mutasyon tespit edilememiş ve herhangi bir kromozomal abnormaliteye sahip olmayan 30 olgu çalışmaya dâhil edilmiştir. 21 olgu, 519 gen içeren araştırma paneli kullanılarak hedefli yeni nesil dizileme analizine alınmış ve hastalıkla ilişkili olabilecek mutasyonlar saptanmaya çalışılmıştır. Diğer 9 olguya ise, 21 olguda tespit edilen olası patojenik mutasyonların bulunduğu ekzonlar için Sanger dizileme analizi yapılmıştır. Elde edilen moleküler genetik veri, olguların klinik verisi ile karşılaştırılarak genotip-fenotip ilişkisi değerlendirilmiştir. Bulgular: Yapılan klinik değerlendirmeler sonucunda, olguların %37'sinde sagittal sinostoz, %33'ünde koronal sinostoz, %20'sinde metopik sinostoz ve %10'unda ise multisütür sinostozu tespit edilmiştir. Ayrıca, olguların %47'sinde en az bir oküler abnormalite tespit edilmiştir. DNA dizileme analizi sonucunda, olguların yaklaşık %20'sinde AXIN2, TCF12 ve ERF genlerine ait patolojik mutasyonlar tespit edilmiştir. TCF12 geninde p.M260fs*5 ve p.P369fs*26 mutasyonu taşıyan olguların bilateral koronal sinostoza, AXIN2 geninde p.L349fs*24 mutasyonu taşıyan olgunun sagittal sinostoza ve ERF geninde p.G299fs*9 mutasyonu taşıyan olgunun ise sağ koronal sinostoza ve kapalı fontanellere sahip olduğu görülmüştür. Ayrıca, Sanger dizileme sonucunda brakisefalik olan bir olgunun TCF12 geninde c.825+5G>T splays bölge mutasyonu tespit edilmiştir. Sonuç: Sendromik olmayan kraniyosinostoz, hem genetik hem de fenotipik olarak oldukça heterojen bir anomalidir. Bulgularımız, sendromik olmayan kraniyosinostozlu olgularda genetik tanının, kapanan sütürün çeşidine göre yapılmasının daha hızlı tanıya götüreceği sonucunu ortaya koymaktadır. Anahtar Kelimeler: kraniyosinostoz, yeni nesil dizileme, moleküler genetik, sendromik olmayan kraniyosinostoz, genetik
Tümör nekrozis faktör reseptör 1'in SRC-homoloji 3 bağlanma bölgesinin sinyal iletimi üzerine etkisi
Tümör Nekrozis Faktör-alfa (Wang, Mayo ve ark.), pleiotropik bir sitokin olup, biyolojik işlevini TNFR1 ve TNFR2 ile bağlanarak gösterir. TNFR1 içerdiği "ölüm bölgesi" aracılığıyla kaspaz-8 aktivasyonuyla apoptozisi indüklerken, TAK1 aktivasyonuyla IKKα/β, MKK3/6, MKK4/7 gibi enzimleri aktive eder. IKKα/β aktivasyonu NF-kB indüksiyonu sağlarken, MKK3/6 ve MKK4/7 aktivasyonları sırasıyla p38 ve JNK kinazlarının aktivasyonlarını sağlar. TNFR1 sinyal yolağının aktivasyonu büyük oranda bilinmesine rağmen ERK1/2 ve AKT aktivasyonlarının nasıl sağlandığı bilinmemektedir. Bu iki enzimin aktivasyonunu Grb2-Ras veya SRC-Ras yolakları üzerinden yapabileceğini varsayarak bu adaptörlerin bağlanma bölgelerinin TNFR1 üzerinde yer alabileceğini düşündük ve TNFR1 amino asit dizisini incelediğimizde, C-terminalinde SH3 bölgesi tarafından tanınan "P448PAP451" bölgesini keşfettik. Bu bilgiler doğrultusunda, bu bölgenin TNFR1 sinyal iletim mekanizmasında rolü olup olmadığını tespit etmek ve TNF-α varlığında TNFR1 reseptörünün SH3 bölgesi üzerinden sinyal iletimi başlatıp başlatmadığını gün ışığına çıkarmak istedik.
Ailesel meme kanseri olgularında BRCA1 ve BRCA2 dışı yatkınlık genlerinin yeni nesil dizileme ile analizi
Amaç: Meme kanseri kadınlar arasında görülen en yaygın kanserlerden biridir. Ailesel kalıtım gösteren olgularda BRCA1 ve BRCA2 patojenik mutasyonları öne çıkmaktadır. Güçlü aile öyküsü olmasına rağmen bazı hastalarda bu genlerde patojenik mutasyon tespit edilememektedir. Bu çalışmada ailesel kanser sendromlarında rol oynadığı düşünülen BRCA1 ve BRCA2 dışı genlerdeki patojenik mutasyonların tespit edilmesi amaçlanmıştır. Yöntem: BRCA1/BRCA2 genlerinde patojenik mutasyon saptanmamış ve güçlü aile öyküsü olan 15 olgu çalışmaya dahil edilmiş olup, ailesel kanser sendromları ile ilişkilendirilen 14 genin (ATM, BARD1, BRIP1, CDH1, CHEK2, MRE11A, MSH6, NBN, PALB2, PTEN, RAD51, RAD51C, STK11, TP53) tüm kodlayıcı bölgelerinin yeni nesil dizileme ile analizi yapılmıştır. Saptanan patojenik mutasyonlar Sanger dizileme ile doğrulanmıştır. Elde edilen veriler mevcut veri tabanları ve literatürle karşılaştırılarak değerlendirilmiştir. Bulgular: Yapılan çoklu gen paneli dizilemesi sonucunda olguların toplam %26'sında CHEK2 ve MSH6 genlerinden birinde patojenik mutasyon tespit edilmiştir. Çalışmada her biri farklı hastada olmak üzere; CHEK2 geninde c.1312G>T ve c.470T>C yanlış anlamlı mutasyonları ve c.715G>T anlamsız mutasyonu, MSH6 geninde c.1628A>C yanlış anlamlı mutasyonu tespit edilmiştir. MSH6 geninde saptanan mutasyon ilk defa bu çalışmada tespit edilmiştir. Ayrıca klinik önemi kesin olarak bilinmeyen ve meme kanseri için daha düşük risk oluşturduğu bilinen bazı varyantlar olgularda tespit edilmiştir. Sonuç: Ailesel meme kanseri genetik olarak heterojen bir hastalıktır. Olguların genetik yapısı ve çevrenin etkisi sonucunda multifaktoriyel kalıtım modeli ile uyumlu olarak farklı mekanizmalarla ortaya çıkabilmektedir. Elde ettiğimiz bulgular Türk toplumunda ailesel meme kanserinin genetik etiyolojisinin anlaşılmasında, genetik danışmada ve klinik tanısında önemli rol oynamaktadır. Hastalığın daha iyi anlaşılması için geniş çaplı popülasyon çalışmaları ve ileri fonksiyonel çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır.
Tip 1 diyabetik deneklerde lentivirus aracılı vazoaktif intestinal peptit gen naklinin terapötik etkinliğinin belirlenmesi
Amaç: Tip 1 diyabet (T1DM) pankreatik beta hücrelerinin spesifik T hücre aracılı dejenerasyonuyla karakterize insülin yetmezliğine sebep olan bir hastalıktır. Vazoaktif İntestinal Peptit (VİP), hem insülinotropik hem de antiinflamatuvar etkileri sayesinde güçlü bir antidiyabetiktir. Ancak peptidazlara karşı (Dipeptidil Peptidaz 4-DPP-4) aşırı hassasiyet sergileyen VİP'den herhangi bir terapötik etki gözlemleyebilmek için peptidin sürekli veya bir çok kez hastaya enjeksiyonu gerekmektedir. Tek doz enjeksiyonla uzun süreli gen sentezi sağlayabilmek için VİP geni taşıyan lentiviral vektörler (LentiVİP) ürettik. Üretilen vektörlerin T1DM üzerindeki terapötik etkinliğini araştırdık. Yöntem: Uzun süreli stabil gen ekspresyonu sağlamak amacıyla güvenilirliği ve etkinliği klinik denemelerde kanıtlanmış 3. jenerasyon HIV tabanlı lentiviral vektörlere VİP kodlayan gen klonlandı. Ayrıca projemizde kullanmak üzere çoklu-düşük doz STZ indüklü T1DM deney hayvan modeli geliştirildi. Üretilen LentiVİP gen nakil vektörünün terapötik etkinliğini projede geliştirilen T1DM deney hayvan modelinde test edildi. Bulgular: LentiVİP gen nakli yapılan diyabetik deneklerde; kan şekerinin düştüğü, pankreas beta hücre fonksiyonunun arttığı ve deneklerin kilo kaybının önlendiği tesbit edildi. Ayrıca diyabet kaynaklı artan serum CRP seviyesinde düşüş, serum oksidan kapasitesinde normalizasyon ve antioksidan kapasitesinde ise iyileşme belirlendi. Sonuç: Elde edilen bulgular LentiVİP gen naklinin ileride T1DM hastalarının tedavisinde yeni bir terapötik yaklaşım olarak değerlendirilebileceğini göstermektedir. Anahtar Kelimeler: tip 1 diyabet, gen tedavisi, lentivirus, vazoaktif intestinal peptit
İnsülin gen naklinin diyabetik hayvan modellerinde terapötik etkisinin belirlenmesi
Amaç: Tip 1 Diyabet (T1DM), insülin eksikliğine yol açan pankreas beta hücrelerinin otoimmün yıkımı ile karakterize bir hastalıktır. Glukoz ile regüle edilen insülin gen ekspresyonunun sağlanması, gün içindeki glukoz seviyesi değişimleriyle korele bir cevabın oluşması ve günde birden fazla insülin enjeksiyonunun önüne geçilmesi gen tedavi çalışmalarının ana konusudur. Diğer hücre tipleriyle karşılaştırıldığında, pankreas beta hücreleri, proinsülinin kontrollü transkripsiyonu ve translasyonu, glukoz duyarlı bir sisteminin olması, prohormon konvertaz ekspresyonu ve regüle edilen bir sekretuar sinyal yolağına sahip olması gibi benzersiz özelliklere sahiptir. Beta hücresi olmayan hücre tiplerine insülin geninin verilmesi başarılı sonuçlar veremediğinden, bu çalışmada pankreas beta hücresine özgü insülin gen ekspresyonunu sağlamak için Multisite Gateway Teknolojisi kullanılarak insülin promotoru kontrolünde proinsülin geni içeren bir lentiviral vektör (LentiINS) oluşturmayı amaçladık. Yöntem: İnsülin gen naklinin T1DM diyabet hayvan modelinde ve ayrıca insülin nakavt (KO) pankreas beta hücre hattında terapötik potansiyelini test etmek için Gateway teknolojisi kullanılarak insülin promotörü (LentiINS) kontrolü altında insülin genini eksprese eden yeni bir lentiviral vektör yapıldı. Bulgular: HIV temelli LentiINS gen tedavi vektörünün intraperitoneal uygulaması plazma glukozunu düşürerek T1DM'li Wistar sıçanların glukoz toleransını arttırdı. STZ enjeksiyonu sonrasında diyabetik sıçanlar ağırlık kaybederken LentiINS enjekte edilen sıçanlarda ağırlık kaybı gözlenmedi. Tekrar insülin gen ekspresyonu sağlanan insülin nakavt pankreas beta hücrelerinin STZ indüklü diyabetik modellerin böbrek kapsülü altına transferiyle bu hayvanlarda plazma kan glukoz seviyesinde düşüş gözlendi. Sonuç: Lentivirüs aracılı gen aktarımı yoluyla insülin promotoru kontrolünde insülin gen ekspresyonunun sağlanması, diyabette doğrudan pankreası hedef alan yeni bir terapötik strateji olarak karşımıza çıkmaktadır. Anahtar Kelimeler: insülin, lentivirus, tip 1 diyabet, crispr
Böbrek transplantasyonunda cross match testlerinin sonuçları ile HLA allelleri arasındaki ilişkinin araştırılması
Amaç: Organ nakli öncesinde yapılan immunogenetik testlerden alıcı ile verici arasındaki çaprazlama testleri organ nakilleri ve özellikle de böbrek nakilleri için son derece önemlidir. Bu çalışmada kronik böbrek yetmezliği (KBY) tanısı almış hastaların HLA allel frekansları ile en duyarlı çaprazlama yöntemi kabul edilen Luminex DSA çaprazlama sonuçları arasında bir ilişki olup olmadığının araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaçla, 2015 ila 2018 yılları arasında yapılan 586 hastaya ait Luminex-DSA sonuçları ile HLA allel frekansları geriye dönük olarak analiz edilmiştir. Yöntem: Hasta ve verici adaylarının HLA-A, B, DRB1 doku tipinin belirlenmesi PCR-SSOP -Luminex yöntemi ile (Gen-Probe) Lifecodes HLA kitleri kullanılarak yapıldı. Çaprazlama testi için Luminex DSA metodu üreticinin protokolüne göre yapıldı. İstatistiki analizler için SPSS Statistics 23.0 ve Arlequin v3.5.2.2 programları kullanıldı. Bulgular: KBY hastalarında HLA-A*02 (%22), A*24 (%16), A*03 (%11), HLA-B*35 (%17), B*51 (%14), HLA-DRB1*11 (%22), DRB1*04 (%18) ve DRB1*03 (%11) en sık görülen alleller olarak saptanmıştır. Hastalar ile donörler arasında yapılan Lum-DSA XM testlerinin %14 (n=82)'ünün pozitif, %86 (n=502)'sının negatif olduğu görüldü. İstatistiksel analizlerin sonucuna göre, HLA-A*29 (p=0.003), HLA-B*08 (p=0.036), HLA-DRB1*01 (p=0.001) ve HLA-DRB1*03 (p=0.0384) allelleri ile Lum-DSA XM arasında pozitif ilişki bulundu. Sonuç: Kronik böbrek hastalarından elde ettiğimiz çalışma sonuçlarımıza göre Luminex DSA- XM yöntemi ile HLA allel frekansı arasındaki pozitif ilişkili allellerin belirlenmesi literatüre katkı sağlayacaktır. Anahtar Kelimeler: HLA allel frekansı, flowsitometrik cross-match, lenfosit crossmatch, luminex cross-match, organ nakli
Solid organ nakillerinde miRNA profilinin meta-analiz yöntemi ile değerlendirilmesi
Amaç: Solid organ transplantasyonu, uygulama sonrası hassas bir monitörizasyon gerektiren bir tedavi yöntemidir. Bugüne kadar transplantasyon sonrası gelişen olaylardan sorumlu olan hedef moleküllerin ve yolakların araştırılması amacıyla birçok miRNA ekspresyon çalışması yapılmıştır. Fakat bu çalışmaların verilerini bir araya getiren ve potansiyel hedef ve yolakları tanımlayan bir integratif meta-analiz çalışması yoktur. Bu çalışmanın amacı transplantasyon hastalarında yapılmış olan benzer araştırma sonuçlarının bir araya getirilmesiyle transplantasyonda biyobelirteç adayı miRNA'ları belirlemek ve bu miRNA'ların hedeflediği genleri ve bu genlerin ilişkili olduğu yolakları biyoinformatik analizlerle ortaya koymaktır. Yöntem: Solid organ transplantasyonunda miRNA ekspresyon çalışmalarına ait literatür taraması yapılmıştır. Doku, kan, idrar örneklerinde yapılan çalışmalar, vaka-kontrol grupları kullanılmış çalışmalar dahil edilmiştir. Çalışmaya dahil edilen yayınlardan tespit edilen anlamlı disregüle miRNA'lara özgü hedef gen ve yolakların belirlenmesi amacıyla KEGG, WebGestalt, miRWalk araçları kullanılarak biyoinformatik analizler yapılmıştır. Bulgular: Literatür taraması sonucunda farklı organ tiplerini içeren 56 adet yayın çalışmaya dahil edilmiştir. Toplamda 3757 denek sayısını içeren 182'si up regüle 164'ü down regüle olmak üzere organ nakli sonrası olaylarla ilişkili 346 adet disregüle ve 3 adet değişmeyen miRNA profili belirlenmiştir. Sonuç: Disregüle miRNA'lar arasından biyobelirteç adayı olarak tespit edilen mir-486-5p ve miR-155'in organ nakli sonrası rejeksiyona dair immün sistemle olan ilişkisi ortaya konmuştur. Anahtar Kelimeler: miRNA, organ nakli, meta-analiz
Prader-willi sendromu bulgularını taşıyan normal karyotipe sahip olgularda metilasyon ve uniparental dizomi (UPD) profillerinin araştırılması
Amaç: Prader-Willi Sendromu (PWS) klinik olarak fenotipik abnormaliteler, bilişsel yetersizlik ve nörometabolik değişimlerle karakterize multisistemik bir hastalıktır. Genetik açıdan ise 15. kromozomun q11-q13 bölgesinde lokalize olan genlerin defekti ile ilişkilidir. Sağlıklı bireylerde bu bölgenin paternal alelleri aktifken, maternal alelleri damgalanmıştır. Paternal genlerin ekspresyon mekanizmasının bozulması ise PWS' ye sebep olmaktadır. PWS' nin klinik bulgularına farklı kromozomlardaki değişimler de sebep olabilmektedir. Dolayısıyla bu durum hastalığın doğru tanısının konulmasını etkilemekte, klinisyenlerin hangi moleküler testi ne zaman isteyeceğini belirlemede sorun oluşturmaktadır. Bu çalışmada PWS' nin klinik bulgularını taşıyan olgularda MS-MLPA analizi yaparak genotip-fenotip korelasyonunun sağlanması; böylece PWS ile Prader-Willi Benzeri Sendrom' un moleküler açıdan ayrımı, doğru tanı, doğru genetik danışmanlık ve uygun tedavi sağlanabilmesi amaçlanmıştır. Yöntem: Klinik olarak PWS' nin fenotipik özelliklerini taşıyan, kromozomal olarak normal karyotipe sahip, FISH yöntemi ile 15q11.2-q13 bölgesinde delesyon taşımadığı belirlenmiş 12 olgu çalışmaya dahil edilmiştir. MS-MLPA yöntemi ile 15q11.2-q13 bölgesinin metilasyon analizi gerçekleştirilmiş; anormal metilasyon paterni gösteren olgulara UPD değerlendirmesi mikrosatellit analizi ile yapılmıştır. Elde edilen veriler mevcut veri tabanları ve literatürle karşılaştırılarak değerlendirilmiştir. Bulgular: 12 olgunun 1 tanesinde anormal metilasyon paterni gözlenmiş ve mekanizmanın aydınlatılabilmesi için mikrosatellit analizi yapılmıştır. Bu olguda anormal metilasyon paterninin UPD' ye bağlı olduğu tespit edilmiştir. 11 olguda ise 15q11.2-q13 bölgesinde herhangi bir değişim saptanmamıştır. Sonuç: 11 olguda herhangi bir değişimin gözlenmemesi bu olguların Prader-Willi Benzeri Sendrom içerisinde yer aldığını göstermiştir. Hastalığın etiyolojisini anlamak, doğru tanı ve genetik danışmanlık verebilmek için daha geniş hasta grubuna sahip çalışmalar yapılması gerekmektedir. Anahtar Kelimeler: prader-willi sendromu, ms-mlpa, 15q11.2-13 metilasyon profili, prader-willi benzeri sendrom, upd
Tümör nekroz faktörü reseptör 1'in (NTFR1) sinyal iletim mekanizmasının araştırılması
Amaç: TNF-α, birçok farklı etki gösteren bir sitokin olup, etkilerinin çoğunu TNFR1 sayesinde sağlamaktadır. TNF-α aracılı NF-κB aktivasyonu, kaspaz aktivasyonu ve nekroptoz indüksüyonu üzerinde pek çok çalışma yapılmış olduğu halde TNFR1 aracılı ERK, Akt ve Stat3 aktivasyonları henüz tam olarak aydınlatılmamıştır. TNFR1'in c-Src ve JAK2 gibi tirozin kinazlara bağlandığı bilinmekte fakat tirozin fosforilasyonu hakkında bir veri bulunmamaktadır. Tez çalışmamızda, TNFR1-JAK2 arasındaki ilişkinin TNFR1 tirozin fosforilasyonuna yol açıp açmadığını, eğer TNFR1 tirozin fosforilasyonuna uğruyorsa bunun TNF-α aracılı ERK, Akt, p38, JNK, Stat3 ve CREB aktivasyonlarını nasıl etkilediğini belirlemeyi amaçladık. Yöntem: TNFR1'in JAK2 ve PKA tarafından fosforile edildiği in vitro kinaz reaksiyonu ile gösterildikten sonra, potansiyel JAK2 ve PKA fosforilasyon motifleri site directed mutagenesis ile A ve D aminoasitlerine dönüştürüldü. Bu mutantların ERK, p38, JNK, Akt, Stat3, CREB, IRS-1 aktivasyon fosforilasyonlarına etkileri western blot ile; Grb2, p85, Stat3 bağlanmasına olan etkileri co-immunopresipitasyonla; NF-κB aktivasyonuna etkileri NF-Luc lusiferaz reporter sistemi ile, apoptotik sürece etkisi kolorimetrik kaspaz aktivasyon ölçümü ile, hücre sağkalımına etkisi MTT ve TNFR1 salınımına etkisi ELISA ile belirlendi. Bulgular: TNFR1, JAK2 ve PKA tarafından fosforile edilmekte, PKA fosforilasyonu JAK2 aracılı tirozin fosforilasyonunu baskılamaktadır. TNFR1'in Y401'den tirozin fosforilasyonu TNFR1 sinyalzomunda Grb2, p85 ve Stat3 bağlantısını kuvvetlendirmekte; ERK ve Akt aktivasyon fosforilasyonlarını arttırmakta, Stat3'ün ise DNA bağlanmasını kuvvetlendirmektedir. TNFR1'in Y360 noktasından fosforilasyonu, CREB ve Stat3 fosforilasyonunu arttırmakta, Y360A mutantı ise JNK ve p38 aktivasyonuna yol açmaktadır. Y401D mutantı ile transfekte hücrelerde, kaspaz aktivasyonu, NF-κB indüksüyon kapasitesi ve hücre sağkalımı düşük bulunmuştur. IRS-1 tirozin fosforilasyonu, TNFR1'in tirozin fosforilasyonundan da, PKA tarafından fosforilasyonundan da negatif etkilenmektedir. Sonuç: TNFR1, PKA ve JAK2 tarafından fosforile edilmekte; PKA fosforilasyonu tirozin fosforilasyonunu baskılayıcı etki göstermektedir. TNFR1 fosforilasyonları, TNF-α aracılı ERK, Akt, Stat3, p38, JNK, CREB aktivasyonları ve IRS-1 tirozin fosforilasyonunu farklı şekillerde düzenlemektedir.
DR5'in hücre yüzeyi ifadesinde hur ve VPS39'un rolünün araştırılması
Amaç: TRAIL (TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand) ligandı TNF ailesine üye, reseptörlerine bağlandığında hücreyi apoptoza yönlendirebilen bir sitokindir. Apoptotik sinyal iletme yeteneğine sahip iki adet hücre yüzeyi reseptörü bulunmaktadır. TRAIL sinyal yolağına dair birçok nokta aydınlatılmış olmasına rağmen, reseptörlerin regülasyonu hala tam olarak anlaşılamamıştır. Kanser hücrelerini TRAIL aracılı apoptoza yönlendirebilmenin ilk koşulu DR4 ve DR5 reseptörlerinin hücre yüzeyinde ifade edilebilmesidir. DR4'ün plazma membranına taşınma mekanizması kısmen anlaşılmış olsa da, DR5'in hücre yüzeyine nasıl çıktığı bilinmemektedir. Yöntem: Tez çalışmasında LNCaP ve HeLa hücreleri anti-HuR ve anti-Vps39 siRNA ile transfekte edilerek bu hücrelerden sitoplazmik, nüklear ve plazma membran fraksiyonları elde edildi. Bu fraksiyonlarda Western Blot ve ELISA yöntemiyle DR5 reseptör miktarı tayin edilerek HuR ve Vps39 baskılanmasının DR5 seviyeleri üzerine etkileri değerlendirildi. Ayrıca, siRNA ile transfekte hücrelerin TRAIL-aracılı apoptoz ve nekroptoz seviyeleri ELISA tabanlı ticari bir kit aracılığıyla belirlendi. Bulgular: HuR proteininin baskılanması LNCaP hücre hattında DR5'in hücre yüzeyi ifadesini düşürmüştür. Western Blot ve ELISA (p=0,036) verileri bu sonucu doğrulamaktadır. Benzer bir sonuç HeLa hücre hattı için de geçerlidir. HuR baskılanması sonucu DR5 yüzey ifadesindeki azalmanın TRAIL aracılı apoptozu engellemesi sadece HeLa hücrelerinde gözlenmiştir. Vps39'un ise DR5'in yüzey ekspresyonunda etkili olmadığı, fakat baskılandığı durumda her iki hücre hattında da nüklear DR5 miktarını değiştirdiği anlaşılmaktadır. Sonuç: Sonuç olarak, HuR proteini DR5'in yüzey ifadesini etkilemektedir. Bu mekanizmanın daha ayrıntılı biçimde aydınlatılabilmesi için ise ileri araştırmalara ihtiyaç vardır.
Osteopetrozis tanılı hastalarda tcırg1 ve snx10 gen mutasyonlarının araştırılması
Amaç: Otozomal resesif osteopetrozis (ARO) kemik yıkımından sorumlu osteoklast hücrelerindeki bozukluğun neden olduğu yoğun ve kırılgan kemik ile karakterize nadir bir genetik kemik hastalığıdır. Bu çalışmada, olguların sırasıyla %50 ve %4'ünden sorumlu olan TCIRG1 ve SNX10 mutasyonlarının araştırılması amaçlandı. Yöntem: Çalışmaya 12 olgu dahil edilmiş olup tanı yaşı 0-37 ay arasındadır. İki genin kodlayıcı ekzonları, periferal kandan DNA izolasyonunun ardından PZR yöntemiyle çoğaltıldı. Sanger dizileme yöntemi ile dizilenen olgular NCBI veri tabanına göre mutasyon ve polimorfizmler açısından değerlendirildi. Bulgular: Sonuç olarak 12 olgunun 4'ünde TCIRG1 geninde 5 farklı mutasyon bulunmuştur. Bunlar, olgulardan birinde intron 6'da heterozigot olarak tanımlanan g.9483G>T (IVS6+1G>T) kesim bölgesi mutasyonu "splicing" ve diğer bir olguda ekzon 15'te homozigot olarak tanımlanan g.10170_10171delTG (p.V595LfsX74) mutasyonu bu çalışmada tanımlanmıştır. Bir diğer hastada birleşik heterozigot olarak ekzon 7'de bilinen bir g.9574_9599del26 (p.Met217fsX) 26bç'lik delesyonu ve ekzon 12'de yine bilinen bir g.13698G>A (p.Gly458Ser) yanlış anlamlı mutasyonu bulunmuştur. İntron 18'de bilinen bir g.11240G>A (IVS18+1G>A) kesim bölgesi mutasyonu ise bir diğer olguda homozigot olarak gözlenmiştir. İki hastada ise ekzon 3'te olasılıkla benign olarak değerlendirilen g.7786C>T (p.Arg56Trp) değişimi heterozigot olarak saptanmıştır. SNX10 geninde ise bir olguda ekzon 7'de g.85603C>G (p.Ser177=) değişimi heterozigot olarak saptanmıştır. İn silico analizler sonucunda kesim bölgesine 7 nükleotid uzaklıkta bulunan bu değişimin olasılıkla hastalık yapıcı olabileceği tahmin edilmiştir. Bilinen polimorfizmlerden TCIRG1 geninde IVS2+83T>C, IVS4+11A>G ve IVS7-14C>A; SNX10 geninde ise IVS2+36T>A ve IVS3-84G>A bulunmuştur. Sonuç: Sonuç olarak çalışmamızda TCIRG1 mutasyonlarına bakıldığında araştırmaya dahil edilen 12 olgunun 4'ünde (%30) en az bir hastalık yapıcı mutasyon saptanmıştır. Daha fazla sayıda hastayı ve ilgili diğer genleri içeren ileri çalışmalar hastalığın genetik etiyolojinin daha iyi anlaşılmasına yardımcı olacaktır. Anahtar kelimeler: osteopetrozis, TCIRG1, SNX10, mutasyon analizi
Sporadik amyotrofik lateral skleroz (ALS) tanısı alan olgularda C9ORF72, SOD1, tardbp, fus ve ubqln2 gen mutasyonlarının araştırılması
Amaç: Sporadik ALS tanısı alan olgularda literatürde en sık gözlenen C9orf72, SOD1, TARDBP, FUS ve UBQLN2 genlerinde mutasyon olup olmadığının ve belirlenen mutasyonun sıklığının saptanması amaçlanmıştır. Yöntem: Sporadik ALS tanısı alan 10 olgunun periferal kan örneklerinden genomik DNA izolasyonu yapılmıştır. C9orf72 geni hekzanükleotid tekrar sayısı artışı fragman analizi yöntemi ile çalışılmıştır. SOD1, TARDBP, FUS ve UBQLN2 genlerinin tüm kodlayan dizileri DNA dizi analizi yöntemiyle taranmıştır. Bulgular: 10 olgunun 2'sinde C9orf72 geninin birinci intronunda (% 20 oranında) heterozigot formda c.-45+162_-45+163insGGGGCC değişimi; SOD1 geninin birinci intronunda 4 olguda (% 40 oranında) heterozigot formda c.72+133C>T değişimi; TARDBP geninin beşinci intronunda 6 olguda (% 60 oranında) homozigot formda c.714+67_714+68insG değişimi tespit edilmiştir. FUS genine ait mutasyon taramasında 3.ekzonda 3 olguda (% 30 oranında) heterozigot formda c.147C>A; 4.ekzonda ise 5 olguda (% 50 oranında) heterozigot, 4 olguda homozigot formda c.288C>T olmak üzere 2 farklı genomik değişim belirlenmiştir. UBQLN2 geninde herhangi bir genomik değişim tespit edilmemiştir. Sonuç: 10 olgunun 2'sinde (% 20 oranında) belirlenen ve daha önce hastalıkla ilişkilendirilmiş olan C9orf72 hekzanükleotid tekrar sayısı artışı bu genomik değişikliğin sporadik ALS'nin ortaya çıkmasında en belirgin genetik defekt olduğunu desteklemektedir. Diğer taraftan C9orf72 hekzanükleotid tekrar sayısı artışı gözlenen olgulardan birinde çalışma kapsamında diğer olgularda gözlenen genomik değişimlerin her birini içermesi, bu varyasyonların patojenik olmadığını desteklemektedir. Bunun yanında 10 olgudan 9'unda FUS geninde varyasyon tanımlanmış olması bu genin oldukça polimorfik olduğunu kuvvetlendirmektedir. Anahtar Kelimeler: ALS, sporadik ALS, gen mutasyonu
Beta talasemi majör hastalarında modifiye edici sall2 geni bağlanma motifinde mutasyon taranması
Amaç: Tezimizin amacı; beta talasemi majör (β-TM) hastalarında kromatin remodelingini ve HbF düzeyini etkileyen modifiye edici SALL2 geni bağlanma motiflerindeki mutasyonları taramaktır. Yöntem: Projemiz, Antalya Eğitim ve Araştırma Hastanesi Adem Tolunay Talasemi ve Kan Hastalıkları Merkezi'ne başvuran, β-TM tanısı konulan, beta-globin gen mutasyonları tanımlanmış 100 hastada planlandı. HbF'i normal 10, HbF'i yüksek olan 66, toplam 76 hastada gerçekleştirildi. Periferik kandan genomik DNA izolasyonunu takiben, SALL2 geni bağlanma motifine özgün primer çiftleri kullanılarak, PZR yöntemiyle ilgili gen bölgeleri çoğaltıldı. Sanger dizileme yöntemi ile mutasyonlar tarandı. Elde edilen sonuçlar NCBI (National Center for Biotechnology Information) veritabanına göre analiz edildi. Bulgular: Çalışılan β-TM 76 hastanın 32'si erkek, 44'ü kadındı. HbF'i yüksek olan hastaların ortalama HbF düzeyleri 10.1 gr/dl idi. Üç PZR amplikonu olarak çalışılan ve HbF'i modifiye eden SALL2 geninde, D1 ve D3 domainlerde (motiflerinde) mutasyon bulunmazken, ikinci domainde (D2) rs61746515 (C>T) g.18721G>A (Gly744=) değişimi; 63(%95.46) hastada GG, 3(%4.54) hastada GA (g.18725C>G p.Gly 746Arg), tespit edildi. rs1263810 (g.18725C>G, p.Gly 746Arg) varyasyonlu toplam 66 hastada; CC, CG, GG genotipleri sırasıyla %9,09, %51,51 ve %39,39 sıklıkta bulundu. Sonuç: Çalışmamızda, Türk toplumunda ve dünyada HbF'i yüksek olan β-TM hastalarında ilk defa ve DNA dizileme ile tespit edilen SALL2 geni bağlanma motifinde rs1263810 (C>G) (Gly746Arg) varyasyonu gösterildi. Amino asit değişimine neden olan bu varyasyonun HbF'in düzenlenmesinde ve SALL2'in kromatin remodelinginde önemli olabileceğini, HbF indüksiyonunda diğer transkripsiyon faktörleri KLF1, BCL11A ile birlikte incelenmesi gerektiğini ortaya koymaktadır. Anahtar Kelimeler: Talasemi majör, HbF, Modifiye edici gen, SALL2
Kronik böbrek yetmezliği hastalarının etiyolojilerine göre hla doku tipinin belirlenmesi ve antikor düzeylerinin araştırılması
Amaç:Bu çalışma kronik böbrek hastalığı tanısı almış 1079 hastanın ve 1111 sağlıklı kontrol bireylerinin HLA allel dağılımı ile etiyolojik alt tiplerinin ilişkili olup olmadığı araştırılması amaçlanmıştır. Ayrıca greft yetmezliği ve rejeksiyon gelişimine neden olduğu bilinen anti-HLA antikorlarının varlığı ile HLA allelerinin bir bağlantısının olup olmadığı araştırılması hedeflenmiştir. Yöntem:HLA-A, B, DRB1 alellerinin belirlenmesi PCR-SSOP ve Luminex yöntemi ile (Gen-Probe) Lıfecodes HLA-A, B, DR kitleri kullanarak yapıldı. PRA (panel reaktif antikor) testi HLA Sınıf I ve II antijenlerine karşı oluşan immunoglobulin G (IgG) antikorlarının tespiti için dizayn edilmiş boncuk temelli bir immunoassay bir yöntem olan Luminex yöntemiyle yapıldı. İstatistiksel analiz için Arlequin v3.5.1.2 kullanıldı. Bulgular: Kronik böbrek hastası bireylerinin tamamının olduğu grupta yapılan istatistiksel verilere göre HLA-A*01 (p=0.0002), HLA-A*03 (p=0.003), HLA-A*11 (p=0.0007), HLA-B*35 (p=0.001), HLA-B*27 (p=0.001), HLA-B*57 (p=0.005), HLA-DRB1*01(p=0.001), HLA-DRB1*04 (p=0.009), HLA-DRB1*14 (p=0.001) hastalıkla pozitif ilişkili bulunmuştur. HLA-A*02 (p=0.001), HLA-A*24 (p=0.0001), HLA-A*26 (p=0.0001), HLA-B*07 (p=0.001), HLA-B*08 (p=0.003), HLA-B*51 (p=0.001), HLA-DRB1*13 (p=0.001), DRB1*11 (p=0.001), HLA-DRB1*03 (p=0.001) alleleri hastalıkla negatif ilişkili olarak bulunmuştur. Hastalığın etiyolojik alttiplerinde daha farklı sonuçlar elde edilmiştir. Sonuç: Çalışma sonuçlarımızdan elde ettiğimiz hastalıkla pozitif veya negatif ilişkili HLA allellerinin alttiplerinin belirlenmesi literature katkı sağlayacaktır. HLA allelleri ve PRA pozitifiliği arasındaki ilişkinin aydınlatılması nakil başarısında önemli rol alacaktır.
3. jenerasyon hıv tabanlı lentiviral vektörlerin ın vıvo uygulamalar için üretimi ve pürifikasyon yöntemlerinin optimizasyonu
Amaç: Lentiviral vektörler (LVV); güvenlik, etkinlik ve uzun süreli ekspresyon açısından tercih edilen, klinik gen tedavi denemelerinde kullanımı her geçen gün artan gen nakil araçlarıdır. Bu vektörlerin terapötik etkinlikleri, üzerlerinde taşıdıkları genlere bağlı olsa da, in vivo uygulamalarda kullanılmaları için, yüksek kalite ve saflıkta üretilmeleri gerekmektedir. Dolayısıyla hem deneysel hem klinik çalışmalarda kullanılabilirliğini arttırabilmek için yeni üretim ve saflaştırma metotları geliştirilmelidir. Yapılan çalışmada, in vivo gen nakil uygulamalarında kullanılmak üzere, uygun titre ve kalitede; yüksek saflıkta, biyogüvenilir lentivirus eldesi için, vektör konsantrasyon ve pürifikasyon tekniklerinin geliştirilmesi hedeflenmiştir. Yöntem: Döner hücre kültürü şişelerindeki 293T hücrelerinin, paketleme ve transfer plazmidleriyle, Chloroquine varlığında geçici CaPO4 transfeksiyonu sonucu 3. nesil LVV üretildi. Ardından düşük hızda santrifügasyon ve filtrasyon ile hücresel debris giderimi yapılıp, sükroz yataklı, yüksek hızlı ultrasantrifüj işlemi ile virus konsantrasyonu gerçekleştirildi. Konsantre edilen viral örnekler; hücresel nükleik asit yıkımı için benzonaz ile muamele edildikten sonra, iyon değişim kromatografisi ile saflaştırma işlemine tabi tutuldu. Elde edilen vektörlerin genoma entegre kopya sayıları kantitatif Real-Time PCR ile hesaplanırken, protein giderim oranları SDS-PAGE ile belirlendi ve MTT testi ile bu vektörlerin hücre canlılığına etkisi değerlendirildi. Bulgular: Yapılan optimizasyon işlemleri ardından %10 FBS ve 25 uM Chloroquine içeren IMDM besiyerindeki transfeksiyonu takiben %10 FBS içeren OPTIMEM besiyerinde yapılan viral üretim metoduyla transdüksiyon etkin LVV'ler başarıyla elde edildi. Viral titre, fonksiyon ve saflık analizleri doğrultusunda, ultrasantrifüj ile 200 kat konsantre edilen örneklerin kromatografik pürifikasyonu ile safsızlıklarından %90 oranında arındırıldığı belirlenirken, viral titre 6,2x10^10 TU/mL olarak hesaplandı. LVV üretiminin başlangıcından son ürüne dek yapılan tüm alt akım işlemlerinin ardından HIV p24 ELISA testi ile toplam vektör geri kazanımı %53 olarak belirlendi. Sonuç: Gerçekleştirdiğimiz bu çalışma ile, genel laboratuvar koşullarına uyarlanabilir özellikte ve oldukça pratik, optimize ve ölçeklendirilebilir bir üretim ve saflaştırma metodu geliştirilmiştir.
Mesane kanserinde kukurbitasin B ve sisplatin'in anti-proliferatif etkilerinin hücre ölüm yolaklarında araştırılması
Mesane kanseri, dünya çapında kanser ölümlerinin önemli bir kısmından sorumlu olan bir malignitedir. Sisplatin (Sis) bazlı kemoterapi, mesane kanseri hastaları için standart tedavi rejimidir, ancak etkinliği yüksek toksisite ve ilaç direncinin gelişmesi ile sınırlıdır. Birçok çalışmada Kukurbitasin B (KuB)'nin apoptoz ve otofajiyi uyararak anti-kanserojen etkiler gösterdiği bildirilmiştir. Bu tez çalışmasında KuB'nin MB49 mesane singeneik fare tümör modeli üzerindeki potansiyel rolü araştırılmıştır. MB49 hücre hattına KuB ve sisplatinin tekli ve kombine dozları uygulanarak hücre canlılığı WST-1 yöntemi ile ölçülmüştür. Tümör modeli oluşturulduktan sonra, fareler dört gruba ayrılarak belirtilen doz ve sürelerde KuB ve sisplatin uygulanmıştır. Apoptoz (Bcl-2, Bax, Kaspaz-3, bölünmüş Kaspaz-3) ve otofaji proteinlerinin (Beklin-1 ve LC3I, LC3II) ifade seviyeleri Western Blot yöntemi ile tespit edilmiştir. PI3K-Akt sinyal yolu ile ilişkili proteinlerin göreceli fosforilasyon seviyelerini belirlemek için fosfo-protein array analizi yapılmıştır. Ajan uygulamaları sonrası tümör dokuları ve organlar, hematoksilen-eozin boyanarak analiz edilmiştir. Bulgularımız, KuB'nin, Bcl-2 ifadesini inhibe ettiğini; Bax ve bölünmüş kaspaz 3'ün ifadelerini arttırdığını göstermiştir. LC3II miktarı, KuB ile tedavi edilen hücrelerde belirgin şekilde artmıştır. KuB; p27, PRAS40 ve Raf-1 proteinlerinin fosforilasyonunu azaltmıştır. KuB ve Sis kombinasyonu sinerjik olarak AKT, ERK1/ERK2, mTOR, BAD proteinlerinin fosforilasyonunu azaltırken, AMPKα fosforilasyonunu artırmıştır. PI3K/AKT/mTOR, KuB'nin hedeflerinden olan bir sinyal yolağı olarak bulunmuştur. KuB ve Sis kombinasyonu tümör gelişimini önemli ölçüde azaltmış ve aynı zamanda akciğer, karaciğer, böbrek, kalp ve mesane üzerinde toksik etki göstermemiştir. Sonuçlarımız, KuB'nin mesane kanserinde geleneksel tedaviyi destekleyebilen yeni bir ajan olabileceğini göstermektedir. Çalışmamız mesane kanseri tedavisinde yeni yolların aydınlatılması ve yeni tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi açısından önemlidir.
Prostat kanserli olgularda miRNA ifadelenme düzeylerinin karşılaştırmalı analizi
Epigenomun önemli bir bileşeni olan mikroRNA'lar (miR'ler), sinyal yolağındaki hedef genlerin transkriptom düzeyinde ifadelenmesini modüle ederek kanser gelişiminde etkin rol oynarlar. Bu tez çalışmasında ilk olarak prostat kanserinde (PCa) yeni miRNA sınıfı olan epi-miRNA'ların ekspresyon seviyesi klinikopatolojik (Gleason Skoru, PSA seviyeleri, TNM Evreleme) evrelere göre kantitatif real time PCR metodu ile araştırılmıştır. Daha sonra ekspresyon seviyeleri önemli ölçüde yüksek bulunan 11 epi-miRNA'nın promoter metilasyon seviyeleri metilasyon spesifik kantitatif real time PCR metodu ile incelenmiştir. Elde edilen sonuçlara göre, miRNA'ların promoter bölgelerinde, PSA seviyeleri (miR-34b / c, miR-148a, miR-152), GS'ler (miR-34a-5p, miR-34b/c, miR-101-2, miR-126, miR-148a, miR- 152, miR-185-5p) ve T evreleme (miR-34a-5p, miR-34b/c, miR-101-2, miR-126, miR-140, miR-148a, miR-152, miR-185-5p) ile doğru orantılı artış gösteren hipometilasyon bulunmuştur. miR-200a/b klinikopatolojik parametrelere göre değerlendirildiğinde, lokal/lokal ileri PCa'da onko-miR, metastatik aşamada tümör baskılayıcı miR olarak görev yapmaktadır. Bir sonraki aşamada PCa'da up-regüle olduğunu bulduğumuz miR-34b, miR-34c, miR-148a, miR-152, miR-200a, miR-200b epi-miRNA'lar (miR-200a ve b metastatik evrede down-regüle olarak tanımlanmıştır) ile onların hedef genleri olan DNA Metiltransferaz (DNMT1, 3a, 3b), PTEN ve NKX3.1'in "epi-miRNA-mRNA" düzenleyici ağı araştırılmıştır. Elde edilen sonuçlarda miR-148a, miR-152 ve miR-200b'nin DNMT1'in ifadelenmesini arttırıp, PTEN genini baskıladığı gösterilmiştir. PCa'nın metastatik yönetiminde epi-miRNA-mRNA çift yönlü geri beslenme döngüsüne ve anti-kanser terapötiklerinde metilasyon örüntüsüne dikkat çeken bu tez çalışması, PCa'da tanısal ve prognostik biyobelirteçler olarak miRNA'ların ve metilasyon sürecinin ve bu süreçte yer alan genlerin mRNA ve miRNA ifade profillerinin bütünleştirici analizine de dikkat çekmesi açısından yeni, öncü ve önemli bir tez çalışmasıdır.
Poli̇ki̇sti̇k over sendromunun eti̇yoloji̇si̇nde interlöki̇n-23 reseptör gen IL-23R) poli̇morfi̇zmi̇ni̇n etki̇si̇
Polikistik Over Sendromu (PKOS), uzun ve kısa dönem sağlık sorunları oluşturan ve üreme çağındaki kadınlarda en sık görülen endokrinolojik bozukluklardan biridir (1,2,3,4). PKOS'un etiyolojisi halen bilinmemektedir ancak genetik, çevresel ve davranışsal faktörler arasındaki karmaşık etkileşimler sonucu olduğuna inanılmaktadır (1,5). PKOS, diyabet (6,7), kardiyovasküler hastalık (8,9,10), endometriyal karsinom ve endometrial hiperplazi (11) için bir risk faktörü olarak benimsenmektedir. PKOS'un etiyolojisi bir sır olmaya devam ederken, bu sendromu olan kadınlarda kronik düşük dereceli enflamasyon varlığını destekleyen kanıtlar ortaya çıkmaktadır (12). IL-23, heterodimerik bir sitokindir ve IL-23 Reseptör de onun altbirimidir. IL-23R, interlökin reseptör olarak adlandırılan proteini yapmayı sağlayan gendir. IL-23 reseptörüne bağlandığında hücre içinde bir dizi kimyasal olay tetiklenir. Bu sinyaller enflamasyonu önler ve yabancı maddelere karşı immün sistem yanıtını koordine etmeye yardım eder. Buna göre, yaptığımız literatür çalışmasında IL-23R, PKOS gibi birçok kanser ve koroner arter hastalık ile ilişkili bulunmuştur (13,14,15,16,17,18,19). PKOS olan kadınların çoğunda kronik enflamatuvar durumların varlığını destekleyen deliller mevcuttur (12,20-29,30-35). Fakat, PKOS'lu kadınlarda IL-23R gen ile ilgili bir çalışma bulunmamaktadır. Bu bilgiler ışığında çalışmamızın amacı IL-23R geninin Arg381Gln polimorfizmiyle PKOS arasındaki ilişkiyi incelemektir. Çalışmamıza yaş ve vücut kitle indeksi (BMI) uyumlu olan 96 PKOS'lu ve 111 sağlıklı kadın dahil edildi. Her iki grupta IL-23R (Arg381Gln) gen bölgesi için genotip ve allel dağılımları saptandı. G allel sıklığının PKOS'da, C alleli sıklığının ise kontrol grubunda daha fazla olduğu bulundu. Sonuç olarak, IL-23R geni Arg381Gln polimorfizminin PKOS ile bir ilişkisi olmadığı düşünülmektedir. Fakat aynı çalışma, hasta sayısı arttırıldığında ya da farklı popülasyonlarla yapıldığında anlamlı bulunma ihtimali barındırır. Anahtar kelimeler: IL-23R geni, reseptör, polikistik over sendromu, polimorfizm.
Adipoq geninin +45T>G VE +276G>T varyasyonlarının multipl skleroz üzerine etkilerinin araştırılması
Multipl Skleroz (MS) Merkezi Sinir Sisteminin (MSS) kronik inflamatuar, demiyelinizan nörolojik bir hastalığıdır. Sıklıkla genç erişkinleri etkiler. MS etyolojisinde genetik, çevresel ve immünolojik faktörlerin yer aldığı multifaktöriyel bir hastalıktır. MS genetiğinde üzerinde en çok durulan HLA (Human Leukocyte Antigen) sınıf I, sınıf II grubudur. MS genetiğinde vitamin D Reseptör Geni (VDR) ve IL7 (İnterlökin) ve IL2 polimorfizmleri de önemli yer tutar. Adiponektin hormonu ile MS ilişkisi henüz araştırılan güncel bir konudur. Adiponektin adipoz doku kaynaklı bir plazma glikoproteinidir. Adipoz doku sadece yağların depo edildiği atıl bir yer değil, önemli sitokinlerin salındığı bir dokudur. Adiponektin bu sitokinlerin en önemlilerinden biridir. Glikoz ve lipid metabolizmasının düzenlenmesinin yanında antiinflamatuar, antiaterojenik ve antidiyabetik özellikleri de vardır. Adiponektin geni (ADIPOQ) üzerinde tanımlanmış birçok polimorfizm vardır. +45T>G (rs2241766) ve +276G>T (rs1501299) polimorfizmleri bunların en yaygın görülenlerinden ve üzerinde en çok çalışılanlarındandır. Yapılan bazı çalışmalarda polimorfizm varlığı ile serum adiponektin seviyesi arasında ters ilişki görülmüş ve polimorfizmler tip 2 diyabet, obezite, metabolik sendrom ve kardiyovasküler hastalıklar ile ilişkilendirilmiştir. Adiponektin ve MS ile ilgili yapılan sınırlı sayıdaki çalışmada, MS hastalarında beyin omurilik sıvısı ve kan serumunda adiponektin seviyeleri ölçülmüştür. Çalışmamızda serum adiponektin seviyesi ile ilişkili olabilecek ve en yaygın görülen ADIPOQ geninin +45T>G ve +276G>T polimorfizmlerinin MS etyolojisi üzerindeki rolleri araştırıldı. Hasta ve kontrol grubu arasında her iki polimorfizm açısından istatistiksel anlam tespit edilemedi.