Cell culture
100 theses under this subject heading
Farklı hücre senkronizasyon yöntemlerinin erken ve geç pasaj sayılarındaki sığır ve koyun hücreleri üzerindeki etkilerinin incelenmesi
Donör hücrelerin hücre döngüsü aşaması, nükleer transfer embriyolarının gelişim yeteneğini etkileyen önemli bir faktördür. G0/G1 aşamaları nükleer transferde en uygun hücre döngüsü aşaması olarak kabul edilmektedir. Bu çalışmada, sığır ve koyunlardan alınan granüloza hücreleri erken (5.) ve geç (15.) pasajlarda analiz edilmektedir. Deney grupları, aktif olarak bölünen hücrelerden, 24/72 saat konfluent (%10 FBS) ve 24/72 saat serum açlığı (%0.5 FBS) uygulanan hücrelerden oluşmaktadır. Hücre döngüsü fazları, GO/G1, S ve G2/M'deki hücre yüzdeleri hücrelerin propidyum iyodür, hücre canlılığı, apoptoz/nekroz hücre yüzdeleri hücrelerin propidium iyodür ve Annexin V-FITC ile boyanması sonrasında akış sitometri cihazında belirlenmiştir. Uygulama gruplarında 24/72 saat konfluent hücrelerde G0/G1 oranı %78.69-%87.58 arasında, 24/72 saat serum açlığı uygulanan hücrelerde G0/G1 oranı %83.02 %96,16 arasında değiştiği görülerek kontrol grubundan (%68,22-76,97) yüksek bulunmuştur (P<0.05). Analiz bulgularına göre erken ve geç apoptotik hücrenin toplam oranının %1.17 %4.42 arasında, nekroz hücrelerin %1.41-%6.46 arasında değiştiği tespit edilmiştir. Koyun 15th pasaj hariç en iyi senkronizasyon serum açlığı deney gruplarından elde edilmiştir. Koyun 15th pasaj uygulama grupları arasında istatiksel olarak fark bulunmamıştır (P<0.05).
Abdominal cerrahide kullanılmak üzere PHBHHx membranların hazırlanması ve karakterizasyonu
Abdominal cerrahi sonrası iyileşme sürecinde hastaların yaklaşık %90'ında peritoneal adezyonlar gelişmektedir. Adezyonlar, iyileşme sürecinden kaynaklanan anormal fibröz veya skar dokusudur. Yapışkanlık önleyici olarak degrade olmayan polypropilen ve polietilenterrafitalat meshlerin dışında, degrade olabilen poliglaktin, poliglikolik asit, poli4-hidroksibutirat meshlerde kullanılmaktadır. Degrade olan meshlerin mekanik problemlerinin yanı sıra adhezyon problemi görülmüştür. Sunulan tez çalışmasında abdominal cerrahi sonrası oluşan yapışıklıkların önlemek için PHBHHx membranlarının hazırlanması ve in-vitro, karakterizasyonun yapılması amaçlanmıştır. PHBHHx membranların serbest yüzey enerjilerini düşürmek, fibroblast adhezyonunu engellemek, pıhtılaşma faktörlerini uyarmamak için oleik asit, polietilen glikol-400 (PEG), PEG-8000, izopropil miristat ilave edilerek modifiye edilmiştir. PHBHHx membranların serbest yüzey enerjileri, dinamik mekanik test cihazı ile mekanik özellikleri, su tutma kapasiteleri, belirlenmiştir. Modifikasyonlar ile insan fibroblast hücre adhezyonu korele edilmiştir. Aynı zamanda modifikasyonun sitokin salımına etkisi, hücresel oksidasyona etkisi, insan serum albümin bağlama kapasitesi belirlenmiştir. Kan pıhtılaşma faktörlerini etkilemeyen, hücre adhezyonuna izin vermeyen, proinflomatuar sitokinleri uyarmayan formülasyonlar belirlenmiştir.
İnsan nöroblastoma hücre kültüründe amiloid beta ile oluşturulan alzheimer hastalığı modelinde atorvastatinin sestrin-2, sirtuin-1, TPP1 ve LC3B ekspresyonuna etkisi.
Çelik, H. İnsan Nöroblastoma Hücre Kültüründe Amiloid Beta ile Oluşturulan Alzheimer Hastalığı Modelinde Atorvastatinin Sestrin-2, Sirtuin-1, TPP1 ve LC3B Ekspresyonuna Etkisi. Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Farmakoloji Programı Yüksek Lisans Tezi, Ankara, 2019. Alzheimer hastalığı (AH), beyinde amiloid-beta (Aβ) peptidlerin birikimi ve nörofibriler yumakların oluşumu ile karakterize, bilişsel fonksiyonların azaldığı ve demansın gözlendiği nörodejeneratif bir hastalıktır. Lipid metabolizmasındaki bozuklukların AH gelişimi ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Kolesterolün amiloid prekürsör protein (APP)'den Aβ oluşumunu etkilediğinin gösterilmesi, AH patogenezinin Aβ-kolesterol yolakları açısından araştırılması ihtiyacını ortaya koymaktadır. Son yıllarda yapılan çalışmalar AH patolojisi ile otofaji yolakları arasında da yakın bir ilişki olduğunu göstermektedir. Otofaji, AH'nın patolojisini oluşturan Aβ gibi protein agregatlarının lizozomal yıkımla parçalanmasında ve hücreden uzaklaştırılmasında yaşamsal öneme sahiptir. Nörodejeneratif hasara ve Aβ toksisitesine karşı koruyucu olarak değiştikleri gösterilen, bu etkilerinde antioksidan ve otofajiyi indükleyici mekanizmaların sorumlu olduğu düşünülen sestrin-2 (SESN2) ve sirtuin-1 (SIRT1) ile lizozomal bir enzim olan tripeptidil peptidaz 1 (TPP1) ve otofaji belirteci mikrotübülle ilişkili protein hafif zinciri (LC3B) proteinlerinin etki mekanizmalarında kolesterol düşürücü atorvastatinin rolünün araştırılması amaçlanmıştır. İnsan nöroblastoma (SH-SY5Y) hücre hattına uygulanan Aβ (10 μM)'nın SESN2 ekspresyonunda artış, SIRT1 ekspresyonunda azalma yaptığı, eşzamanlı atorvastatin (1μM) tedavisinin bu proteinlerdeki değişiklikleri kontrol seviyelerine geri döndürdüğü ayrıca hücrelerde 3-hidroksi-3-metilglutaril koenzim A'yı (HMG-KoA) ve lipid peroksidasyonunun göstergesi malondialdehiti (MDA) inhibe ettiği gösterilmiştir. Otofaji belirteci LC3B, Aβ (10 μM) ile atorvastatinin (1μM) eşzamanlı uygulaması ile artmış, lizozomal bir enzim olan TPP1 seviyelerinde ise değişiklik olmamıştır. Bu tez çalışmasında, atorvastatinin Aβ hasarı sırasında farmakolojik etkisini, HMG-KoA redüktaz enzim inhibitörü ve antioksidan etkisinin yanı sıra, SESN2, SIRT1 ve LC3B proteinlerinin ekspresyonlarını değiştirerek gösterdiği sonucuna varabiliriz. Anahtar Kelimeler: Alzheimer hastalığı, atorvastatin, sestrin-2, sirtuin-1, otofaji Destekleyen Kuruluş: HÜBAB (Proje Numarası: THD-2017-13478)
Sodyum florürün (NAF) böbrek hücre serilerindeki sitotoksik etkisinin araştırılması
Bu çalışma, farklı dozlarda ve zamanlarda alınan hücre örneklerinde, NaF uygulanması ile belirli düzeylerde sitotoksisite oluştuğu belirlenen NRK-52 böbrek hücre serisinde, sitotoksisitenin meydana gelmesinde, apoptotik, otofajik ve nekrotik mekanizmaların olası rollerinin araştırılması amacıyla planlandı. Hücreler, in vitro koşullarda düzenli geçişlerde çoğaltıldı. NaF'nin IC50 değeri MTT ile belirlendi. Hücre numuneleri, hücrelerin IC50 değerlerine göre hazırlanan örneklerden 3, 12 ve 24 saat sonra alındı. Biyokimyasal analizler için, hücreler tripsinizasyon ile toplandı ve donma / çözme metodu ile lize edildi. MRNA manuel yöntemle izole edildi. Apoptotik, otofajik ve nekrotik genler için cDNA elde edildi ve hedef gen DNA, gerçek zamanlı PCR yöntemi ile amplifiye edildi. Bu seçilmiş genlerin ekspresyonu değerlendirilmiş ve NaF kaynaklı moleküler yollarda zamana bağlı olarak önemli değişiklikler tespit edilmiştir. Üçüncü saatte hücrelerin apoptotoik yolağı kullanarak apoptoza girdikleri, 12. saatteki ölümlerin tamamen otofajik yolak kaynaklı olduğu ve 24. saatte ise, otofajide duramayan hücrelerde nekrotik sinyal ve apoptozis yolaklarındaki genler vasıtasıyla, hücre ölümünün tamamlandığı tespit edildi. Sonuç olarak, NRK-52 böbrek hücre serisinde NaF bağımlı hücre ölümlerinde, moleküler mekanizmaların zamana bağlı olarak aktivite gösterdiği belirlendi. NaF eklendikten sonraki 3. Saatten itibaren sitotoksik etki mekanizmalrının harekete geçtiği ve 12 ve 24. Saatlerde farklı mekanizmaların hücre ölümlerini hızlandırdığı kanısına varıldı. Anahtar kelimeler: NaF, böbrek, sitotoksisite, hücre kültürü
Enkapsüle edilmiş miR-3670, miR-8078 temelli tedavi yaklaşımının meme kanserinin immünoterapisindeki etkinliğinin araştırılması
Bu çalışmada amaç, MCF-7 meme kanseri hücrelerinde aşırı eksprese edilen bir immün kontrol noktası olan PD-L1'in ekspresyonunu mikroRNA-3670 (miR-3670) ve mikroRNA-8078 (miR-8078) kullanarak inhibe etmek ve meme kanserindeki immünoterapötik özelliklerini araştırmaktır. Biyoinformatik analizlerimiz sonucunda miR-3670'in PD-L1 mRNA'nın iki farklı bölgesine yüksek bağlanma skorlarıyla (82.15 ve 87.35) bağlanabildiği, PD-L1 ligand sentez yolaklarını ve kanser hücrelerinin temel düzenleyici yolaklarını önemli ölçüde hedef aldığı ve meme kanserinde PD-L1 ekspresyonunu etkili bir şekilde baskıladığı tespit edilmiştir. Sitotoksisite analizi, her iki miRNA'nın 1nM dozunun MCF-7 hücre hattında yüksek toksisite sergilerken, sağlıklı bir meme dokusu hücre hattı olan HME1'de daha az toksik olduğunu tespit edilmiştir. Total RNA analizleri, toplam RNA konsantrasyonları ile sitotoksisite seviyeleri arasında anlamlı bir korelasyon olduğunu belirlemiştir. Yüksek sitotoksik dozlarda toplam RNA miktarında bir azalma gözlenirken, düşük sitotoksik dozlarda bir artış belirlenmiştir. RT-PCR ve ELISA analizlerimize dayanarak, miRNA-3670 ve miRNA-8078 mimiklerinin 1 nM dozlarının MCF-7 hücrelerinde hem PD-L1 gen ifadesini hem de sPD-L1 protein seviyelerini azalttığı tespit edilmiştir. Ancak, HME1 hücreleri üzerinde anlamlı bir etki tespit edilememiştir. MCF-7 hücrelerinde, miR-3670 ve miR-8078 hücre sağkalımını azaltıp apoptozu tetiklerken, HME1 hücrelerinde anlamlı bir farka neden olmamıştır. Hücre göçü analizimize göre, miRNA'lar MCF-7 hücrelerinde hücre göçü üzerinde güçlü bir inhibitör etkiye sahipti (sırasıyla %81.47 ve %99.8) ve anti-metastatik özellik sergilemiştir. Tersine, HME1 hücrelerinde hücre göçünü inhibe edemediği (sırasıyla %22.8 ve %6.2) tespit edilmiştir. Morfoloji ve biyoinformatik analizlere (KEGG ve GO) dayanarak, her iki miRNA da lamellipodia varlığında önemli bir düşüşe yol açarak MCF-7 hücrelerinde EMT'den MET'e geçişe neden olduğu tespit edilmiştir. Ancak, HME1 hücrelerinde görünür morfolojik değişiklikler gözlenmemiştir. Metastazla ilişkili parametreler üzerinde yapılan ELISA analizlerine göre, MCF-7 ve HME1 hücrelerinde miR-3670 ile miR-8078'in 1nM dozu serbest e-kaderin antijen seviyelerini önemli ölçüde azalttığı tespit edilmiştir. Ayrıca, miR-3670 ve miR-8078'in MCF-7 ve HME1 hücrelerinde sVEGF-A seviyesinde ve sTINAGL-1 antijen seviyesinde azalmaya neden olduğu bulunmuştur. miR-3670 ve miR-8078'in MCF-7 hücrelerinde koloni oluşumunu sırasıyla %17.7 ve %78.2'lik bir azalma ile önemli ölçüde engellediği belirlenmiştir. MCF-7 hücre hattında 3D sferoid oluşumunu %90 oranında engellediği ve tipik olarak elipsoid şekilli 3D sferoidlerin aksine amorf sferoidlerin (sırasıyla %13 ve %22) gelişmesine neden olduğu tespit edilmiştir. Oluşturulan 3D sferoidlerin boyutunun 100 µm'nin altında kaldığı ve hacimlerinin 1 mm3 ten az olduğu tespit edilmiştir. HME1 hücre hattında 3D sferoid yapı gözlenmemiştir. Sonuç olarak; miRNA'ların (miR-3670, miR-8078), meme kanseri hücrelerinde bağışıklık tepkilerinin yeniden yönlendirilmesi yoluyla kanser immünoterapisi için potansiyele sahip olabileceğini göstermiştir. Özellikle mevcut kanser tedavisi yaklaşımlarında giderek daha önemli hale gelen kişiselleştirilmiş kanser immünoterapisi de ve hedefe yönelik tedaviye ilişkin gelecekteki araştırmalar için bir temel sağlayabilir.
Havayolu modellemesi amaçlı tasarlanan mühendislik ürünü 3B hücre kültür sistemlerinin geliştirilmesi
Kronik hava yolu hastalıkları çevresel ve genetik faktörlerin rol oynadığı bir dizi karmaşık mekanizmaya sahiptir. Bu hastalıkların moleküler patolojilerinin çalışılması ve kritik cerrahi ameliyatlar sonrasında ihtiyaç duyulan doku nakli için in vivo ortamı taklit eden uygun hücresel model sistemlerin kurulması oldukça önemlidir. Literatürde havayolunu modellemek için çeşitli hücresel in vitro model sistemler oluşturulmuştur. Havayolu hücre kültürleri için kullanılan in vitro modeller arasında en yaygın yöntemlerden biri hava-sıvı arayüzü (Air Liquid Interface -ALI-) kültür sistemi ve bu sistemde kullanılan transwell-insert membran yapılarıdır. Ancak halihazırdaki ALI-kültür uygulamalarında transwell membranların her iki yüzüne de ekim yapabilecek pratik bir sistem tasarımı bulunmadığı için hücre-hücre etkileşimi incelenirken ALI kültür sisteminin iki yüzü etkin kullanılamamaktadır. Ticari olarak günümüzde satılan sistemlerin 3 boyutlu (3B) hücre ko-kültür sistemlerine yatkınlığı da son derece kısıtlıdır. Çalışmanın ilk basamağında; halihazırda ALI kültür sistemlerde kullanılan transwellerin kullanımı daha efektif hale getirilerek modifiye edilmiş ve bu amaçla transwell adaptörler 3B yazıcıdan çıkartılmış, sızıntı denemeleri gerçekleştirilmiş ve ALI sistemine uyarlanarak epitel-fibroblast ko-kültürleri yapılmıştır. Ko-kültür modeller üzerinde immünositokimya ve gerçek zamanlı PZR çalışmaları gerçekleştirilmiş ve modellerin etkinliği doğrulanmıştır. Denemelerin sonucunda 3B ko-kültür sistemine dönüşümünü sağlayan yeni bir ürün geliştirilmiştir. Çalışmanın ikinci kısmında epitel doku greft gelişimine uygun transwell yapısında kullanılmak üzere biyobozunur membranlar geliştirilmiştir. Bu amaçla poli (L-laktik asit) (PL24, Corbion, intrinsik viskozite=1.5-2.0 dL/g) ve poli(e-kaprolakton) (PCL12, Corbion, intrinsik viskozite=1.0-1.3 dL/g polimerleri kullanılarak elektroeğirme yöntemiyle örgüsüz nanofiber ağ yapısında membranlar sentezlenmiştir. Optimizasyon ve karakterizasyon çalışmaları yapıldıktan sonra uygun bulunan membranlar 3B ALI-kültür sistemine entegre edilerek hücre kültür sistemlerinde değerlendirilmiştir. Geliştirilen biyobozunur özellikteki membranın, fizyolojik ortamda doğal olarak oluşan bariyer yapısı gibi sürdürülebilir özellikte olduğu ve havayolu modellemesi için ALI-kültür sistemlerinde kullanımının uygun olduğu sonucuna varılmıştır.
Ekstraselüler matriksin hücre yaşlanması üzerindeki etkisinin hücre kültürü temelli modelle değerlendirilmesi
İnsan diploid fibroblastları, büyümenin durması, morfolojideki değişiklikler ve değişmiş gen ifadesi ile karakterize edilen replikatif senesens durumuna girmeden önce sonlu sayıda hücre bölünmesini tamamlama kapasitesine sahip olup, bu süreçte ekstraselüler matris (ECM) ile etkileşim, hücrelerin yaşlanma ve senesens sürecine girmelerinde önemli bir rol oynamaktadır. Hücre yaşlanmasının altında yatan biyolojik süreçlerin anlaşılması, doku mühendisliği ve yaşlanmaya karşı geliştirilen tedavi yöntemleri için kritik bir öneme sahiptir. Ancak, yaşlanma sürecinde çevresel faktörlerin etkisi ve özellikle hücresel mikroçevrenin bu süreçteki rolü henüz tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu bağlamda, yaşlı hücreleri görünüşte genç bir duruma geri döndürmek için genç dermal dokudan gelen ekstraselüler matris (ECM) ile etkileşimin senesens sürecini tersine çevirdiği öne sürülmüş ve ayrıca, yaşlı ECM'nin genç hücreler üzerindeki etkisi de ek olarak incelenmiştir. Bu çalışmada, üç boyutlu biyoyazıcı teknolojisi kullanılarak üretilmiş hücresizleştirilmiş ECM (dECM) modeli yardımıyla fibroblast hücrelerinin yaşlanma süreci incelenmiştir. Çalışmamızda, fibroblast hücrelerinin yaşlanma sürecini daha doğal bir hücresel mikroçevrede gözlemlemek amacıyla üç boyutlu kültür modeli kullanılmıştır. Bu model, hücrelerin in vivo benzeri bir ortamda yaşlanma mekanizmalarını daha gerçekçi bir şekilde incelemeye olanak tanımıştır. Genç ve yaşlı sıçan derisinden elde edilen dECM, yaşlı ve genç hücrelerle birlikte kullanılarak ECM'nin biyokimyasal özelliklerinin yaşlanma üzerindeki etkisi araştırılmıştır. Bu kapsamda, dECM'nin kimyasal yapısı Fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopi (FTIR) ve DNA miktarı ölçümü ile doğrulanmış, yaşlanmaya etki eden SIRT1, p53, GLB1, COL1A1, NF-κB ve MMP1 gibi genlerin ekspresyon seviyeleri, 0, 3, 7 ve 10. günlerdeki örneklerden alınan verilerle gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PZR) kullanılarak analiz edilmiştir. Çalışmanın sonuçları, dECM'nin yaşlı hücrelerin bazı genç fenotip özelliklerini geri kazanabilme kapasitesine sahip olduğunu ve ECM'nin genç özelliklerinin yaşlanmış hücrelere aktarılabileceğini göstermiştir. Bu bulgular, ECM'nin yaşlanmayı yavaşlatma veya kısmen tersine çevirme potansiyeli üzerine yeni bir bakış açısı sunarak, hücre-mikroçevre etkileşimlerinin yaşlanma sürecine etkisini ortaya koymaktadır. Çalışmamız, ECM'nin hücre yaşlanması üzerindeki etkilerini açıklayarak, doku mühendisliği ve rejeneratif tıp alanında yaşlanma karşıtı stratejilere katkı sağlayacak veriler sunmaktadır.
İnsan keratinositleri ile oluşturulan In Vitro yara iyileşmesi modeline göbek kordonu mezenkimal kök hücre eksozomlarının ve hiperglisemik ortamın etkileri
Akut ve kronik yaraların iyileştirilmesinde, hem geleneksel hem de rejeneratif tedavi yöntemleri tercih edilir. Akut yaraya kıyasla, kronik yara tedavi sürecinin daha uzun ve zorlu olması rejeneratif yaklaşımlara kapı açar. İyileşme bozukluğu ile karakterize diyabetik yaralar, kronik yapıları ve karmaşıklıkları nedeniyle klinik tedavi aşamasında zorluk teşkil eder. Başlangıçta canlı hücre uygulamasını içeren rejeneratif tedavi yöntemleri, zamanla geliştirilerek günümüzde yalnızca hücresel ajanların kullanıldığı 'hücresiz tedavi' düzeyine ulaşmıştır. Hücreler tarafından salgılanan ekstraselüler veziküllerin bir türü olan eksozomlar, kaynaklandıkları hücrenin ana parakrin özelliklerini taşır ve zengin hücresel materyal içerikleri sayesinde migrasyon ve proliferasyon gibi yara iyileşmesine dahil olan fizyolojik mekanizmaları tetikleme özelliklerine sahiptir. Çalışmamızda hiperglisemik ve normoglisemik ortamlarda kültürlenen insan keratinosit hücre hattı (HaCaT) ile oluşturulan çizik yara modeli üzerinde insan göbek kordonu kaynaklı mezenkimal kök hücre eksozomlarının (hUC-MSC-Exo) yara iyileştirici etkileri in vitro ortamda incelendi. HaCaT yara modeline hUC-MSC-Exo uygulaması sonucunda hem normoglisemik hem de diyabetik ortamı taklit eden hiperglisemik gruplarda artan hücresel canlılık oranı; migrasyon ve proliferasyon olayları, bozulmuş yara iyileşmesiyle ilişkilendirilen fizyolojik mekanizmalarda görevli trombospondin 1 (TSP-1), BPAG1e (BP230) ilişkili distonin, interlökin 8 (IL-8) ve hidroksiprolin (Hyp) düzeyleri ELISA ile analiz edildi. Oksidan/antioksidan oranını gösteren malondialdehit (MDA) ve glutatyon (GSH) düzeyleri ise biyokimyasal olarak analiz edildi. hUC-MSC-Exo uygulamasının, in vitro yara iyileşmesini normoglisemik ve hiperglisemik ortamlarda zaman-doz bağımlı olarak hızlandırdığı belirlendi. 25 milyon partikül/mL ve 50 milyon partikül/mL hUC-MSC-Exo konsantrasyonlarının hücrelerde metabolik aktiviteyi artırdığı, bu konsantrasyonlar aşıldığında metabolik aktivitenin etkilenmediği, normoglisemik ve hiperglisemik ortamlarda 25M p/ml hUC-MSC-Exo dozunun zamana bağlı olarak en etkili/ideal doz olduğu saptandı. Hem normoglisemik hem de hiperglisemik gruplarda hUC-MSC-Exo uygulamasının kontrol gruplarına kıyasla keratinosit migrasyonunu, yara kapanma oranını; BP230, TSP-1 ve Hyp düzeylerini artırırdığı gözlendi. Bu artıştan hUC-MSC eksozomlarının keratinositlerde çeşitli hücresel sinyal yolakları ve büyüme faktörü sentezlerini uyararak, aynı zamanda içerdiği metabolik düzenleyiciler aracılığıyla yaptığı saptandı. Çalışmamızda aynı zamanda, hem normoglisemik hem de hiperglisemik gruplarda keratinositlerden akut dönemde IL-8 sentezini uyararak yara iyileşmesinin inflamatuar fazını tetiklediği, kronik dönemde ise düşürerek yara iyileşmesinin proliferatif evresine katkı sağladığı belirlendi. Çalışmamızda diyabette bozulmuş yara iyileşmesiyle ilişkili patofizyolojik mekanizmalarda yer alan moleküllerin rolünü hUC-MSC-Exo tedavisi ile birlikte açıklamaya çalıştık. Anahtar kelimeler: Eksozom, Hiperglisemik ortam, Yara iyileşmesi, Diyabet, Keratinosit
GW8510 farmakolojik inhibitörünün ın vitro pankreas kanseri modeli üzerine etkilerinin araştırılması
Pankreas kanseri yüksek insidans ve kötü prognoz ile karakterize bir hastalıktır. Pankreas kanseri hastalarının birçoğu, hastalığın ileri evrelerine kadar asemptomik olarak kalabilmektedirler. Güncel koşullarda hastalığın etkin bir tedavisi bulunmamakta ve tedavi edilebilen hastalarda bile hayatta kalma süresinin çok kısa olduğu bilinmektedir. Yaşam süresinin bu denli kısa olduğu bilinen pankreas kanseri hastalığını tedavi etmeye yönelik yeni stratejilerin geliştirilmesinin önemli ve gerekli olduğu görülmektedir. Bu tez kapsamında yapılan ön çalışmada TCGA (The Cancer Genome Atlas- Kanser Genom Atlası) veri bankasında bulunan 176 pankreas kanseri hastasından alınan doku örneklerinden elde edilen tüm genom gen ekspresyon mikroarray verileri ve hastaların klinik bulguları değerlendirilmiştir. Bu değerlendirme sonucunda Ribonükleotid Redüktaz Alt ünite M2 proteinini kodlayan RRM2 geninin pankreas kanseri hastalarında yüksek oranda eksprese olduğunu ve bu yüksek ekspresyonun hastalarda düşük yaşam oranı ve kötü prognoz ile ilişkisinin istatistiksel olarak anlamlı olduğunu tespit edilmiştir (p= 1.62e-4). Kötü prognoz ve yüksek mortalite ile ilişkili bulunan RRM2'ye yönelik literatürde yapılan inhibitör araştırması GW8510'un RRM2 üzerinde inhibitör etkili olduğu fakat bu etkiye yönelik pankreas kanserinde hiçbir araştırma bulunmaması sebebiyle GW8510'un pankreas kanserindeki terapötik etkinliğini araştırmaya yönelik olarak bu tez projesi tasarlanmıştır. Bu amaçla, pankreas kanseri tedavisinde sıklıkla kullanılan Gemsitabin ile GW8510'in sinerjik etkinliği araştırılmıştır. Hücre canlılığı analizi WST-8 metodu ile gerçekleştirilmiş, ardından kullanılan iki kimyasal ajanın sinerjitik etki gösterdiği dozlar CompuSyn kombinasyon analiz programı ile belirlenmiştir. Apoptoz ve hücre döngüsü deneyleri akış sitometri yöntemi kullanılarak, laboratuvar ortamında oluşturulan yara iyileşme modelinin analizi ise Image-J programı ile gerçekleştirilmiştir. GW8510 ajanının RRM2 protein seviyeleri üzerine olan etkisi ise ELISA yöntemi ile belirlenmiştir. Elde ettiğimiz sonuçlar, 10 µM dozda GW8510 uygulanan PANC-1 hücrelerinde % 34 oranında hücre canlılığının inhibe olduğu göstermiştir. Kombinasyon analizi ile 10 µM GW8510 : 10 µM Gemcitabin kombinasyonunun sinerjistik etkileşim gösterdiği belirlenmiştir. Bu kombinasyon dozunun % 89.9 oranında hücrelerin migrasyonunu inhibe ettiği tespit edilmiştir. Bu tez ile GW8510 ajanının PANC-1 pankreatik karsinom hücrelerinde RRM2 protein seviyeleri üzerindeki inhibitör etkisi ilk kez gösterilmiştir. GW8510 'un RRM2 geninin inhibisyonu aracılığıyla pankreas kanseri tedavisindeki kullanım potansiyeli umut vericidir. GW8510'un pankreatik karsinom hücreleri üzerine olan sitotoksik etkinliğinde farklı metabolik yolakların olası rolünün aydınlatılması için ileri çalışmalara ihtiyaç bulunmaktadır.
Mersin (Myrtus Communis l.) bitkisinin farklı ekstraktlarının fenolik içeriğinin belirlenmesi ve hücre kültüründe antioksidan – antiinflamatuar etkilerinin araştırılması
Mersin bitkisi (Myrtus communis L.), kırmızı meyveli üzümsü bir bitki olup, içerdiği fenolik bileşikler ve antosiyanidin bileşenlerinden dolayı güçlü antioksidan ve anti-inflamatuar özelliklere sahiptir. Bu çalışmanın amacı, mersin bitkisinin farklı ekstraktlarının antioksidan ve antiinflamatuvar etkilerini invitro belirlemek ve iyi bilinen bir antiinflamatuvar molekül olan ferulik asit içeriği en yüksek olan mersin ekstraktının invitro antiinflamatuvar etkisini araştırmaktır. Bu çalışmada mersin bitkisi yaprağı, kurutulmuş, kurutulmuş parçalanmış, ham mersin meyvesi, mersin çekirdeği ve çekirdeksiz mersin meyvesi kullanılmış, farklı zaman periyotlarında (1 dak., 3 dak., 5 dak., 10 dak.) demleme ve kaynama teknikleri ile ekstraktlar elde edilmiştir. Bu ekstraktlarda LC-MS/MS ile kateşin, etil ferrulat, gentisik asit, p-koumarik asit, sirinsik asit, kaempferol, epikateşin, rutin, kafeik asit ve ferulik asit gibi fenolik bileşiklerin miktarları belirlenmiş in-vitro antioksidan (FRAP, TEAC ve DPPH yöntemleri ile) ve antiinflamatuvar (hyaluronidaz inhibisyon miktar tayini ve WST-1 testi ile) aktivite testleri spektrofotometrik yöntemler ile gerçekleştirilmiştir. Ferulik asit içeriği ile antioksidan ve antiinflamatuvar aktiviteleri en fazla çıkan mersin bitkisi ekstraktlarının, makrofaj hücre kültüründe (human monocytic cell line, THP-1) sitokin seviyelerine (IL-1𝛼, IL-1𝛽, NF-κB, IL-6, IL-10, TNF-𝛼 ve IFN-𝛾) etkisi belirlenmiştir. Bu çalışma mersin bitkisinin demleme ve kaynama ekstraktlarının THP-1 hücre hattında antiinflamatuvar potansiyelini değerlendiren ilk çalışmadır. Çalışmanın ilk aşamasında demleme ve kaynama sonucu elde edilen mersin bitkisi ekstraktların LC-MS/MS analizlerinde en yüksek konsantrasyonlara genel olarak demleme ekstraktlarında 5. dakikada ulaşıldığı tespit edilmiş ve bu dakikadan sonra düşme veya artış yüzdelerinde azalmalar olduğu gözlenmiştir. Bu dakikalarda en yüksek konsantrasyonlara ferulik asit ve kaempferolün sahip olduğu tespit edilmiştir. Bu nedenle çalışmada 5. dakika süre seçilmiştir. Kurutulup parçalanmış meyvenin kaynaması ile elde edilen ekstrakttaki fenolik bileşiklerin konsantrasyonlarının diğer ekstraktlara oranlara daha fazla olduğu tespit edilmiştir. Bu ekstraktlarin TEAC, FRAP ve DHPP aktivitelerinin, LC-MS/MS sonuçlarına paralel olarak demleme ve kaynama süresi ile antioksidan aktivitelerde değişkenlik olduğu ve çoğunlukla artan zaman ile birlikte antioksidan aktivitelerde artış olduğu tespit edilmiştir. En yüksek aktivite gösteren mersin fraksiyonunun, kurutulup parçalanmış meyve ekstraktı olduğu ( TEAC (10,90 ± 0,36 - 18,53 ± 2,78), FRAP (0,67 ±0,05 - 3,45 ± 0,41) ve DHPP (22,32 ± 1,21 - 109,86 ± 0,52 ) tespit edilmiştir. Hyaluronidaz aktivitesinin inhibisyonu yüzdesinin demleme ve kaynama ekstraktlarının LC-MS/MS ve antioksidan sonuçları ile korelasyon gösterdiği ve bu korelasyonun en fazla kurutulup parçalanmış meyvenin 5. dakika ekstraktında olduğu tespit edilmiştir. WST-1 demleme ve kaynama ekstraktlarının inhibisyon yüzdelerinin LC-MS/MS ve antioksidan sonuçları ile korelasyon gösterdiği, çoğunlukla en yüksek inhibisyonların 5. dak ve 10. dakikalarda gözlendiği tespit edilmiştir. Çalışmanın 3. aşamasında in vitro antioksidan ve antiinflamatuvar etkileri en yüksek tespit edilen mersin bitkisi ekstraktı olan kurutulup parçalanmış ham meyvenin kaynama ve demleme ekstraktı ile ferulik asit'in; lenfosit hücre kültüründe inflamasyon üzerine etkileri belirlenmiştir. IL-1𝛽, TNF-𝛼 ve IFN-𝛾 sonuçları istatistiksel anlamlı olurken, NF-κB, IL-6, ve IL-1𝛼 düzeylerindeki düşüşler ile IL-10 düzeyindeki artış istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır. Bu projeden elde edilen veriler mersin bitkisi ekstraktlarının antioksidan ve antiinflamatuvar etkili olup, kansere ve otoimmun hastalıklara karşı koruyucu olabileceğini işaret eder niteliktedir.
Yaban mersininde bulunan hidroksisinnamik asidlerin antioksidan aktivitesi ve kanser hücre kültüründe apopitozis induksiyonu üzerine etkisi
Son zamanlarda, Yaban merisini meyvesi ülkemizde oldukça popülerdir. Yaban mersini, sahip olduğu Hidroksisinnamik asitler nedeniyle tıbbi özellikleri olan antioksidan bileşiklerin ümit verici bir kaynağı olan aromatik bir bitkidir. Sıkılaştırıcı fakat tatlı ve yenilebilir olan mavi-siyahımsı meyveler, güçlü antioksidan özelliklere sahip olan flavanoidler ve Hidroksisinnamik asitler (Kafeik, p-Kumarik ve Ferulik asit) içerir. Bu tür gıdalarda bulunan fenolik bileşikler, serbest radikal temizleme, oksijen radikal absorbansı ve metal iyonlarının şelatlanması gibi birçok potansiyel yolla antioksidan olarak hareket edebilirler. Yaban mersininde bolca bulunan C vitamini, serbest radikalleri tutarak hücrenin DNA'sını korur ve kanser oluşumunu engeller. Yine yaban mersininde bulunan antisiyaninler, ellagik asit ve urolitin gibi maddeler, DNA'nın serbest radikallerce hasarını azaltarak kansere karşı koruyucu etki göstermektedir. Bu çalışmada ülkemizde doğal olarak yetişen Yaban mersini bitkisinin meyvelerini ve yapraklarını kullanarak farklı infüzyon ve kaynama yöntemleri ile elde edilen yaban mersini çayları, içerisinde bulunan Hidroksisinnamik asitlerin varlığı, antioksidan aktiviteleri ve apopitosiz üzerine değerlendirilecektir. Yaban mersini çayları; yapraklar, ham meyve, kurutulmuş ve parçalanmış ham meyve, meyve çekirdekleri ve çekirdeksiz ham meyve farklı infüzyonlar ve kaynatma: 1 dak, 3 dak, 5 dak,7 dak, 10 dak. Fenolik seviyeler LC MS / MS tekniği ile belirlenmiştir. Tüm ürünlerin invitro HCT-116 Kolon kanseri hücre hattında antioksidan ve aktiviteleri spektrofotometrik yöntemlerle analiz edilmiştir. Antioksidat aktivitesi için MDA ve TEAC değerlendirilmiştir. Sitotoksisite ve canlılık testleri WST-8 (Water Soluble Tetrazolium Salt-8) solüsyonu eklenerek yapılmıştır. Apopitosiz için ise intrensek ve ekstrensek yolakların kaspazlarının aktive olması için gerekli reseptörlerinden olan TRAIL ve Apaf-1 ELISA Kit yöntemiyle değerlendirilmiştir. Sonuç olarak, Yaban mersini çay ekstraktlarında bulunan hidrosinnamik asitlerin HCT-116 kolon kanseri hücre hattında antioksidan potansiyelini değerlendiren ilk çalışma olup TEAC trolox eşdeğerine göre etken maddeler karşılaştırıldığında en yüksek sonuçlar yaban mersini çay ekstratı 13,5 mM olarak hesaplanmıştır ve elde ettiğimiz veriler 5 dk kaynatma yöntemi kullanılarak hazırlana yaban mersini çayının zengin antioksidan kaynağı olduğunu göstermektedir. Hidrosinnamik asit olan Kafeik, p-kumarik ve Ferulik asit ve bunların kombinasyonları ile ve yaban mersinin kendisiyle gerçekleştirerek hücre kültürü in vivo çalışmalarında tekli olarak hidrosinnamik asitleri değerlendirdiğimizde 48.saat IC50 konsantrasyonu 39,9 μg/ml ile p-Kuarik asit en etkili hidroksisinnamik asit olarak değerlendirilmektedir. Yapılan ikili ve üçlü hidrosinnamik asit konsantrasyonlarında görülmektedir ki kafeik asid ve ferulic asidin 1:1 oranında IC50 dozlarının yarısının birleşiminin yapmış olduğu sitotoksite, tek başarına yaptığı belirlenen IC50 dozlarının yarısının yapmış olduğu sitotoksite, 2.6 kat daha fazladır. Yapılan üçlü kombinasyonda yine her bir hidroksisinnamik asidin 1:1 oranında IC50 dozlarının yarınsın birleşiminin yapmış olduğu sitotoksiteden, tek başarına yaptığı belirlenen IC50 dozlarının yarısının yapmış olduğu sitotoksiteden 4.5 kat daha fazladır. 5 dk kaynama yöntemi ile yapılan yaban mersini çayının içerisindeki hidroksisinnamik asitler hesaplandığında yaban mersini çayının tekli ve kombine şekildeki hidroksisinnamik asitlerden daha fazla etkili olduğu gözlenmektedir. Yaptığımız çalışmada ayrıca TRAIL ve Apaf-1 ELISA kit sonuçlarına bakılarak Kafeik, p-Kumarik, Ferulik asit başta olmak üzere bu hidrosinnamik asitlerin kombinasyonları ve yaban mersini çay ekstraktının karşılaştırılmasıyla elde edilen en yüksek değerin 80000 μg/mL % 50 öldürme konsantrasyonunda 5 dk kaynama yöntemi ile hazırlanan yaban mersini çay ekstraktının olduğu görülmektedir. Anahtar Kelimeler: Yaban Mersini, Antioksidan, Apopitosiz, Kolon kanseri, Apaf-1,TRAIL
Hepatosellüler karsinoma hücre kültürlerinde ganoderma lucidum'un NRF2/are sistemi ve hemoksijenaz-1 (HO-1) üzerine etkileri ve sitotoksisite çalışmaları
Günümüzde dünyadaki altıncı en yaygın kanser türü hepatosellular karsinomadır. Bununla birlikte, hepatosellülar karsinoma(HCC) 'nın moleküler etiyolojisine odaklanan çalışmalar sınırlıdır. Nrf2 sinyal yolağı, bir dizi sitoprotektif genin ekspresyonunu arttırarak hücreleri çeşitli toksik maddelerden ve kanserojen maddelerden koruyabilir. G. lucidum, kanser de dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların önlenmesi ve tedavisinde geleneksel tıpta kullanılmaktadır. Çalışmamızın amacı, G. lucidum'un HCC'deki potansiyel sitotoksik rolünü değerlendirmektir. Bu amaçla, hücre canlılığı testi ve Nrf2 sinyal yolağı ile ilgili proteinlerin analizi yapıldı. HCC hücreleri için G. lucidum'un en etkili konsantrasyonu 100 µg/ml olarak bulundu. 24, 48 veya 72 saat boyunca G. lucidum ekstraktları (100 veya 50 µg/ml) uygulandıktan sonra sitoplazmik / nükleer Nrf2 ve HO-1, NQO1 veya Keap1 protein seviyelerindeki süreye bağlı olarak değişiklikler gözlemlendi. 100 µg/ml ekstraktı içeren G.lucidum özütü çözeltisinin 24 saatlik ve 48 saatlik uygulamaları sonunda hücre canlılığının, sırasıyla, % 53 ve % 59 oranlarında engellediği gösterilmiştir. Sonuç olarak, bulgularımız G. lucidum'un HCC hücrelerinde anti-kanserojen etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Ek olarak, fitokimyasal maddelerin kullanımı ile Nrf2 sinyal yolağının aktivasyonu da bu çalışma ile gösterilmiştir. Elde ettiğimiz veriler, kanser tedavisinde fitokimyasal maddelerin kullanımı ile sağlanan Nrf2 aktivasyonunun moleküler etki mekanizmalarının aydınlatılmasının önemini de vurgulamaktadır. ANAHTAR SÖZCÜKLER: Ganoderma lucidum, Nrf2/ARE yolağı, sitotoksisite, hepatoselüler karsinoma hücre hattı (HCC)
C6 glioma hücrelerinde morinda citrifolia ve paklitakselin etkilerinin araştırılması
Bu çalışmada in vitro C6 glioma hücre modelinde Morinda citrifolia (noni) ekstresi ve paklitakselin farklı konsantrasyonlarının ß-katenin sinyal yolu ile hücre proliferasyonunda meydana getirdiği değişiklikler immünositokimyasal olarak incelendi.Hücre proliferasyonunun değerlendirilmesinde hücre siklusunda S fazına özgü bir işaretleyici olan bromodeoksiuridin (BrdU) uygulandı. Noni ile inkübasyon sonrasında BrdU inkorporasyonunda kontrol gruba kıyasla azalma izlenirken, sadece paklitaksel uygulanan ve noniyle paklitakselin birlikte uygulandığı gruplarda S fazında hiç hücre gözlenmedi. Glioma hücrelerinde, plazma membranlarının intraselüler sınırları boyunca ß-katenin ekspresyonu izlendi. Noni ekstresi ile inkübasyon sonrasında plazma membranı seviyesinde normal seviyelerde ekspresyon izlendi. Paklitaksel inkübasyonu sonrasında nükleusta belirgin ß-katenin ekspresyonu izlendi. Noni ve paklitakselin birlikte uygulandığı gruplarda ise ß-katenin ekspresyon ve lokalizasyonunda bir değişiklik olmadığı görüldü.Çalışmamız sonucunda plazma membranında bulunan ß-katenin ekspresyonunun noni ekstresi uygulamasıyla değişmediği, düşük dozda paklitaksel uygulamasında nükleustaki ß-katenin ekspresyonunun arttığı izlendi.
Hücre kültürü kaynaklı hücreler arası matris tabanlı biyomürekkep ile 3 boyutlu biyobaskı
3 boyutlu (3B) biyoyazıcı teknolojisi gelecekte doku mühendisliği çalışmaları adına umut vadeden bir teknoloji olarak görülmektedir. Günümüzde ise farklı hücre tipi ve hücre yoğunluğuna sahip doku ve organlar üretmek mümkün değildir. Karmaşık dokuların 3B biyoyazıcı ile oluşturulamamasının temel zorluklarından birisi farklı hücre tiplerinin farklı hücre dışı ortamlara ihtiyaç duymalarıdır. Bu hücre dışı ortama hücreler arası matris (HAM) adı verilmektedir. HAM vücuttaki hücreleri ve dokuları çevreleyen, destekleyen ve onlara şekil veren geniş bir protein ve sinyal molekülleri ağıdır. Hücre dışı matris, hücrelerin çevrelerindeki diğer hücrelere bağlanmasına ve iletişim kurmasına yardımcı olur. hücre büyümesinde, hücre hareketinde ve diğer hücre işlevlerinde önemli bir rol oynar. 3B biyobaskı yönteminde hücre dışı ortam biyomürekkep adı verilen doğal veya sentetik polimerler yardımı ile taklit edilmeye çalışılır. İyi tasarlanmış bir biyomürekkep 3B basılan yapı içindeki hücrelerin büyümesini, çoğalmasını ve farklılaşmasını desteklemelidir. Bu nedenle, son zamanlarda doğal dokuların hücresizleştirilerek biyomürekkep tasarımında kullanılma fikri önem kazanmıştır. Hücrelerin uzaklaştırılması sonucu elde edilen HAM'ye hücresizleştirilmiş hücre dışı matris (dHAM) adı verilmektedir. Hazırlanmasında dHAM kullanılan biyomürekkeplere dHAM tabanlı biyomürekkep adı verilmektedir. Bu tür biyomürekkeplerin dokuya özgü kompleks bileşimleri hücreler için biyokimyasal olarak en iyi ortamı sağlarlar. Bu çalışmada ise hücreler arası matris doğal dokular yerine 2 boyutlu (2B) hücre kültüründen elde edilerek bir biyomürekkep hazırlanmıştır. Hazırlanan bu dHAM tabanlı biyomürekkebin 3B olarak basılan yapıdaki hücrelere etkisi gözlemlenmiştir.
Hücre-ECM yoğunluk oranının üç boyutlu kök hücre kültürlerinin kondrojenik farklılaşmasına etkisinin araştırılması
Doku mühendisliği işlevsiz dokuları restore etmek ve yaşam beklentisini arttırmak amacıyla bir organ veya doku kaybı veya yetmezliği yaşayan hastaları tedavi edebilmek için umut verici bir tedavi yaklaşımı olmuştur. Doku mühendisliğinde elde edilecek ürünün doğal yapıya en yakın özellikte olması ve en yüksek faydayı sağlaması beklenmektedir. Mezenkimal kök hücrelerin (MKH) doku mühendisliği uygulamalarında kullanımı son derece yaygın olup MKH'lerin kondrojenik farklılaşabilme yeteneklerinden yararlanılarak üç-boyutlu (3B) doku mühendisliği ürünleri tasarlanabilmektedir. Mevcut kıkırdak dokusunu destekleyebilecek fonksiyonel bir kıkırdak doku tasarlamak amacıyla dokunun mekanik özelliklerini belirleyen hücre-ECM yoğunluk farkları önemlidir. Çalışmada üç-boyutlu hücre kültürü ortamında insan plasenta kaynaklı umbilikal kord mezenkimal kök hücre – ECM yoğunluğunun kondrojenik farklılaşması üzerine etkileri araştırıldı. 3B kültür ortamında hücre sayısı sabit tutularak hücre-ECM yoğunluk farkı için ĸ-karragenan'ın 4 farklı konsantrasyonunda ve iki farklı kültür ortamında (standart ve kondrojenik tam kültür ortamı) sferoidler hazırlandı. Kondrojenik farklılaşma için her iki kültür ortamında ve 4 farklı konsantrasyonda hazırlanan sferoidlerin morfolojik ölçümleri, füzyon deneyleri ve histokimyasal boyamaları incelendi. Çalışma sonucunda 3B kültür yöntemiyle hazırlanan sferoidlerin kondrojenik farklılaşma gösterdiği tespit edildi.
Denovo sentezlenen antrakinon türevlerinin pankreas kanseri hücre kültüründe etkinliğinin araştırılması
Dünya çapında pankreas kanserinin görülme sayısı 459.000'dir. Bunların 432.250'si ölümle sonuçlanmaktadır. Kanser mortalite sıralamasında 7. sırada yer almaktadır. Pankreas kanseri nispeten kısa hayatta kalma süresine ve kanser teşhisinin ardından 5 yıllık düşük sağ kalım oranına sahiptir. Ayrıca insidans oranı yılda %1.5 artmaktadır ve pankreas kanseri hastalarının hayatta kalma oranı sabittir. En aktif kemoterapi rejimleriyle tedavi edildiğinde bile sağ kalımları yüz güldürücü değildir. Radyoterapi, lokal olarak ileri hastalığı olanların tedavisine katkısı çok az olduğu görünmektedir. Bu nedenle, bu tümör hücrelerini daha etkili bir şekilde hedefleyebilen ve nüksetme insidansını azaltabilen yeni ilaçlara kritik bir ihtiyaç vardır. Bunlardan, en umut verici yaklaşım olan immünoterapi etkili bir terapötik stratejidir. Son yıllarda pankreas kanseri hastalarında immünterapi tedavisi için telomeraz inhibitörleri kullanılmıştır. Yapılan çalışmalar, telomeraz aktivitesinin pankreas adenokarsinomunun prognozunu iyileştirebileceğini ve terapötik bir hedef olabileceğini göstermektedir. Antrakinon türevleri, yarım asırdır antikanser ajanları olarak kullanılmaktadır. Bu moleküller, DNA ile etkileşime girme yetenekleri açısından önemlidir. Yapılan birçok çalışma doğal antrakinonların antikanser, anti-inflamatuar, immünosupresif, antimikrobiyal, diüretik, katartik, laksatif, damar gevşetici, antioksidan ve fitoöstrojen aktiviteleri gibi çok çeşitli biyoaktivitelere sahip olduğunu göstermiştir. Ftalosiyaninler, aromatik yapısı ve π-elektronlarınca zenginliği sayesinde güçlü kimyasal, termal ve foto kararlılığa sahip yoğun renkli sağlam moleküllerdir. Ftalosiyanin bileşiklerinin telomerik G-Kuadrupleks DNA'ya bağlanma özellikleri kanser tedavisinde yeni bir araştırma alanıdır. Biz bu çalışmada yeni sentezlenen ve moleküler docking analizlerinde G-Kuadrupleks DNA'ya bağlanma enerjileri yüksek olarak belirlenen antrakinon yan zincir taşıyan 2 farklı ftalosiyanin türevleri çinkoftalosiyanin bileşiklerinin (p–ZnPc ve np–ZnPc) pankreas kanseri hücre hatlarında (Mia-PaCa-2 ve PANC-1) telomeraz inhibitörü aktivitelerinin belirlenmesi için; Telomeraz reverse transkriptazın (TERT) ekspresyon tayini araştırarak olası yeni aday telomeraz inhibitörlerinin gösterilmesi amaçladık. Anahtar kelimeler: Pankreas kanseri, Antrakinon, Ftalosiyanin, Telomer, Telomeraz inhibitörü
Investigation of the effects of SUMO modification on two critical proteins: A pathogenic NEK1 mutant that drives ALS pathogenesis and the CRISPR-associated CAS9 protein
Small Ubiquitin-like modifier (SUMO) is an essential eukaryotic post-translational modification. SUMO isoforms attach to specific lysine residues on target substrates to modi-fy their function, activity, solubility and stability. Dysregulation of sumoylation is associated with various pathological conditions ranging from cancer to neurodegeneration. In this study, we focused on a mutant form of NEK1 protein, called truncated NEK1 (or tNEK1), which was recently linked to the pathogenesis of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS). Previous studies from our lab had established that tNEK1 was prone to aggregation and associated with PML nuclear bodies (NBs). Here, we showed that PML also facilitates tNEK1 sumoylation and ubiquitylation. Furthermore, pharmaceutical agents that induce PML NB biogenesis, such as interferon-alpha (IFN), promote tNEK1 hypersumoylation in a PML-dependent manner. These findings have important implications for the management of tNEK1-linked ALS in the clinic, as IFN may promote the hypersumoylation, degradation, and clearance of this toxic protein in vivo, in a PML-dependent manner. In addition, our lab has created a transgenic mice model that expressed tNEK1 to study the effect of this mutation in vivo. In this study, we have performed motor neuron function assays (specifically, foot-print and walking assays). Our results indicate that tNEK1-expressing mice display a walk-ing disorder, implying that tNEK1 expression in vivo may lead to ALS pathogenesis. Finally, we have also conducted studies on the CRISPR-associated Cas9 protein that we have recently discovered to be a sumoylation target. We have identified the major SUMO conjugation site on this protein and showed that sumoylation impacted on both the stability and DNA-binding ability of this important protein.
Theileria annulata'nın hücre kültürü pasajlarında atenüasyon düzeylerinin moleküler belirteçler ile incelenmesi
Amaç: Bu araştırma T. annulata ile enfekte hücre kültürünün düşük, orta ve yüksek pasajlı suşlarında T. annulata'ya özgü atenüasyon markerları kullanılarak hedef gen bölgelerindeki ekspresyon seviyelerindeki farklılaşmaları tespit etmek amacı ile yapılmıştır. Gereç ve Yöntem: Bu çalışmada parazit materyali olarak, T. annulata 'nın Acarlar ve Cincin izolatlarına ait düşük, orta ve yüksek pasajlar, Ankara/Pendik izolatının orta ve yüksek pasajları ile aşı suşu olan TeylovacTM kullanılmıştır. İlk olarak, ilgili her bir izolattan RNA ektrakte edilmiş ve akabinde ekstrakte edilen her bir RNA örneğinden cDNA'lar sentezlenmiştir. Daha sonra atenüasyon markerları kullanılarak RT-PZR yapılarak farklı aşamadaki pasajlarda ilgili makerlerin ekspresyon seviyeleri incelenmiştir. Bulgular: Yapılan incelemeler sonucunda HDAC, ADAM-19, MMP9 ve TIMP-3 gen bölgelerinin ekspresyon seviyeleri ölçülmüş ve farklı pasajlara sahip izolatlar arasında gen ekspresyon seviyelerinde önemli bir artış veya azalma tespit edilmemiştir. Sonuç: Bu araştırmada atenüasyon markerı olarak belirlenen gen bölgelerinin kullanılan tüm izolatlarda eksprese edilmediği tespit edilmiştir. Ayrıca T. annulata hücre hatlarının farklı pasajları arasında ilgili genlerin ekspresyon seviyeleri arasında pozitif ve/veya negatif korelasyon belirlenemiştir. Anahtar Kelimeler: Atenüasyon, aşı, hücre kültürü, marker Theileria annulata
Kolajen proteini ile H-ras aktif hücrelerinin etkileşimi
Düşük molekül ağırlıklı GTP-bağlı protein süper ailesinin üyesi olan ras proteinler, normal selüler proliferasyonunu düzenleyen kritik sinyal yolaklarının aktifliğini kontrolde rol almışlardır. Aktif ras proteinlerinin genellikle insan tümörlerinin gelişimine katkıda bulunduğu gösterilmiştir.Kolajen proteinleri memelilerde çok miktarda bulunurlar ve dokuların biyokimyasal yapıları için önemlidirler. Ayrıca hücre adezyonu, taşınması, büyümesi, morfogenez ve yara iyileşmesinde önemli role sahiptirler. Bunun aksine insan kanser tiplerinin birçoğunda kolajen protein geninde mutasyon olduğu saptanmıştır.Yapılan bu çalışmada, 5RP7 H-ras aktif hücrelerinin kolajen tip IV proteinine bağlanma kapasitesi saptanarak kolajen tip IV' e bağlı hücrelerin apoptotik indeksinin belirlenmesi amaçlanmıştır.Sıçan 5RP7 hücrelerinin büyüme eğrisinin çıkarılması için tripan mavisi ile boyama yöntemi, hücrelerin kolajene bağlanma oranlarının belirlenmesi için MTT ve kristal mor boyama yöntemleri, kolajene bağlı hücrelerin apoptotik indeksinin belirlenmesi için ise agoroz jel elektroforez yöntemi kullanılmıştır.5RP7 hücrelerinin büyümesi zamana göre tripan mavisi ile belirlenmiştir. Bu sonuca göre, diğer çalışmalar için optimum hücre sayısı 12,5x104 ml/hücre olarak tespit edilmiştir. 5RP7 hücrelerinin kolajen tip IV' ün değişik konsantrasyonlarına bağlanma kapasitesi MTT deneyi ve kristal mor yöntemi ile araştırılmıştır. Her iki metotun sonucuna göre, hücrelerin düşük kolajen tip IV dilüsyonunda (2.5 µg/ml) bile kontrol hücrelerine göre oldukça yüksek bağlandığı tespit edilmiştir. DNA fragmentasyonu deneyine göre kolajen tip IV' e bağlı 5RP7 hücreleri apoptoza gitmeyerek DNA merdiven görüntüsü göstermemiştir. Hücreler kolajen tip IV' e kuvvetlice bağlanmıştır.
Kanserli hücrelerde folik asit içeren magnetik nanopartikül etkileşimi
Dünyada ölümcül hastalıkların başında yer almakta olan kanserin tedavisinde, çeşitli sitotoksik ajanlar kullanılarak, çoğalan kanser hücrelerinin yok edilmesi amaçlanmaktadır. Aslında bu sitotoksik ajanların spesifik hücre özgüllükleri olmayıp, toksisiteyi başlatıp tüm sistemde yan etkileri olduğu görülmektedir. Kanser hücrelerinde pek çok reseptör üretilebilmektedir. Bu özelliklerinden faydalanılarak çeşitli kanser hücreleri hedeflenip, bu hedef reseptörlere uygun kompleksler sitotoksik ajan olarak oluşturulabilir.Bu çalışmada folik asit ile magnetik nanopartiküllerin kanserli hücrelerle etkileşimleri değerlendirilmiştir. Folik asit ile modifiye edilmiş magnetik nanopartiküller, çeşitli kanser hücrelerine hücre kültürü tekniği ile uygulanıp, bu yeni komplekslerin kanser hücreleri tarafından endositozis yoluyla alınıp alınmadığının, hem hücresel hem de ince yapı seviyesinde incelenmesi amaçlanmıştır.İlk aşamada nanopartiküller folik asit ile bağlanarak, bu kompleksin kanserli dokular içine geçmeleri sağlanmıştır. Folik asidin, kanser hücreleri yüzeyindeki folat reseptörüne yüksek affinite ile bağlanması düşünülmüştür. Böylece folik asit bağlanmasının, nanopartiküllerin hedef hücrelere geçişini kolaylaştırdığı düşünülmüştür. Hücrelerin ince yapı görüntüleri ve nanopartiküllerle etkileşimi Geçirimli Elektron Mikroskobu kullanılarak tespit edilmiştir.
2006-2010 yılları arasında takip edilen febril nötropeni ataklarındaki kültürlerde üreme oranları, antibiyortik duyarlılıkları antibiyotik dirençleri
2006-2010 Yılları Arasında Takip Edilen Febril Nötropeni Ataklarındaki Kültürlerde Üreme Oranları,Antibiyotik Duyarlılııkları Antibiyotik Dirençleri
Yeni amino asit konjugatlarının meme kanserine karşı in vitro ve in vivo etkilerinin araştırılması
Kanser, günümüzde ölümcül hastalıklar sınıflandırmasında ilk sıralarda yer almaktadır. Ülkemizde ve dünya genelinde en sık görülen kanser türlerinden biri meme kanseridir. Kanser tedavisinde kullanılan ve geleneksel tedavi yaklaşımı olarak benimsenen kemoterapötik ajanların negatif yan etkilerinden dolayı, yan etkisi olmayan ajanların geliştirilmesi oldukça önem kazanmıştır. Tez çalışmamız, ürettiğimiz iki antikanserojen aktivite adayı maddenin molecular docking (in silico) analizleri ile meme kanseri hücre hatlarındaki (in vitro) analizleri sonucunda en etkili bileşiğin seçilerek, meme kanseri oluşturulmuş dişi sıçanlar üzerinde bu maddenin uygun dozda uygulanması (in vivo) esasına dayanmaktadır. Sentezlenen glisin içeren hidroksi sinamik asit konjugatı (HCA-Gly-OCH3) ve kumarin içeren sistein amino asit konjugatı (Cys-PA-N3-Kum) bileşiklerinin in vitro aşamada hücre canlılığı ve hücre proliferasyonu analizleri gerçekleştirilmiştir. Hücre kültürü analizleri sonucunda Cys-PA-N3-Kum bileşiğinin daha etkili bir antikanserojen aktivite adayı olduğu belirlenmiştir. Daha sonra bu bileşik, DMBA ile meme kanseri oluşturulmuş Wistar albino dişi ratlar üzerinde uygulanmıştır. Sentezlenen bileşiğin kontrolünü yapmak amacıyla klinikte de kullanımı olan Tamoksifen ilacı da deney hayvanları üzerinde uygulanmıştır. Çalışmanın hayvan deneylerinin ardından moleküler biyolojik ve histopatolojik analizler yapılmıştır. Grupların MDA, GSH, CAT aktivitelerine ek olarak, gruplarda DNA hasarının ne düzeyde olduğunu belirlemek için de gerekli analizler yapılmıştır. Ayrıca p53, COX-2, HER2 ve TNF-α protein ekspresyonlarının ne düzeyde olduğu da Western Blot yöntemiyle belirlenmiştir. Genel olarak tedavi gruplarında MDA seviyelerinin azaldığı, CAT ve GSH seviyelerinin ise arttığı görülmüştür. Tedavi gruplarında COX-2, HER2 ve TNF-α protein ekspresyonlarının azaldığı, p53 protein ekspresyonunun ise arttığı belirlenmiştir. Tümör boyutu ve tiplendirmelerini belirlemek amacıyla yapılan histopatolojik analizlerde, hasar gruplarında invazif tümörlerin fazla olduğu, amino asit konjugatı ve tamoksifen gruplarında tümör oluşumlarında azalma ve boyutlarında küçülme olduğu belirlenmiştir. Yapılan in silico analizlerde, makromolekülün aktif yöresine yakınlaşma, etkileşilen kalıntılar, bağ tipleri, tahmini Ki'ler, doklama skorları gibi tüm veriler beraber değerlendirildiğinde HER2 ve p53 üzerinde konjugatın daha etkin olabileceği ortaya çıkmıştır. Elde edilen sonuçlar doğrultusunda, Cys-PA-N3-Kum konjugatının meme kanserine karşı koruyucu etkileri olduğunu ve bu maddenin gelecek çalışmalar için ümit verici neticeleri olduğu anlaşılmaktadır.
PARP ve PLK1 ikili inhibisyonunun MCF-7 ve MDA-MB-231 meme kanserli hücre hatlarına karşı etkilerinin araştırılması
Moleküler biyolojinin gelişmesiyle birlikte araştırmacılar, DNA hasarı onarım yollarını hedef alan ilaçların geliştirilmesinin kanseri tedavi etmenin etkili yollarından biri olduğunu belirlemişlerdir. Çünkü bu tür hedef ilaçlar sadece anti-kanser etkinliği göstermekle kalmaz, aynı zamanda kanser hücrelerinin geleneksel kemoterapötik ilaçlara, özellikle de DNA'ya zarar vererek kanser hücrelerini öldüren ilaçlara duyarlılığını arttırmaktadır. Küçük moleküller, ilaç direncinin üstesinden gelmek ve kanser hastalarının prognozunu ve hayatta kalma oranını iyileştirmek için anti-kanser ajanları olarak görev yapmakta ve böylece kanserler için potansiyel yeni tedaviler sunmaktadır. Geleneksel kemoterapi ilaçlarıyla karşılaştırıldığında etkinlik ve güvenlik açısından avantajları nedeniyle, hedefe yönelik terapötik ilaçlar ana kanser tedavileri haline gelmiştir. Tez çalışmamız PARP inhibitörü olaparib ve PLK1 inhibitörü BI-2536 ilaçlarının MCF-7 ve MDA-MB-231 meme kanseri hücre hatlarındaki tedavi yanıtlarının daha iyi anlaşılmasını sağlayan hücresel bileşenlerin tespit edilmesine ve takip eden çalışmalarda moleküler mekanizmalarının anlaşılmasına dayanmaktadır. Bu amaçla gerçekleştirdiğimiz çalışmalarda MCF-7 ve MDA-MB-231 meme kanseri hücre hatları kullanarak PLK1 aktivitesinin meme kanseri hücrelerinin canlılığı, MCF-7, U2OS ve MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinde olaparib ve BI-2536 kombinasyon tedavisinin koloni sağ-kalımı ve kanser hücre migrasyonuna olan muhtemel etkileri araştırılmıştır. MCF-7 ve MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinde olaparib ve BI-2536 moleküllerinin mono ve kombinasyon tedavileri DNA hasarı, hücre döngüsü ve apoptotik sinyal yolaklarındaki proteinlerin ekspresyon düzeylerine Western blotlama yöntemiyle bakılmıştır. RNA interferans teknolojisi kullanılarak eksprese edilen BRCA2 ifadesi engellenmiş ve Western blotlama analizi ile MCF-7 ve U2OS meme kanseri hücre hatlarında BRCA2 gen ekspresyonundaki manipülasyon tespit edilmiştir. BRCA2-efektif ve BRCA2-defektif MCF-7 hücrelerinde hücrelerin canlılığı ve koloni sağ-kalımı belirlenmiştir. Ayrıca olaparib ve BI-2536 bileşiklerin proteinler ile moleküler etkileşimleri moleküler docking analizleri ile tespit edilmiştir. Elde ettiğimiz sonuçlar; MCF-7 ve MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinde olaparib ve BI-2536 moleküllerinin kombinasyon tedavisinin meme kanseri hücrelerinin hücre canlılığını azalttığı ve koloni sağ-kalımlarını baskıladığını göstermektedir. MCF-7 ve MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinde olaparib ve BI-2536 kombine tedavinin ilgili bireysel tedavilere kıyasla daha fazla DNA hasarına neden olarak sinerjik sitotoksik etki gösterdiği tespit edilmiştir. Sonuç olarak, meme kanser hastalarında artan PLK1, p53, p21, γH2AX, Nrf-2, Cyclin E, A ve B1 ekspresyonu ile azalan HER-2, NF-κB ve Cyclin D1 ekspresyonu dikkate alındığında PLK1 inhibisyonunun PARP inhibitörlerinin anti-kanser kapasitesini arttırma potansiyeline sahip olabileceği saptanmıştır.
Enteroinvazif patojenlere karşı probiyotik mikroorganizmaların hücre kültürü ortamında etkinlikleri
ENTEROİNVAZİF PATOJENLERE KARŞI PROBİYOTİK MİKROORGANİZMALARIN HÜCRE KÜLTÜRÜ ORTAMINDA ETKİNLİKLERİ Giriş ve Amaç: Probiyotikler "yeterli miktarda alımı sonucu konağın sağlıklı kalmasına yardımcı olan canlı mikroorganizmalar" olarak tanımlanmıĢtır. Bu sebeple uzun yıllardır gerek terapötik gerekse profilaktik olarak çok çeĢitli alanlarda kullanımına yönelik araĢtırmalar sürdürülmektedir. Enteroinvazif patojenlerle oluĢan gastroenteritlerin antibiyotiklerle tedavi edildiği bilinmekte ancak antibiyoterapinin flora üzerinde oluĢturdukları olumsuz etki ve mikroorganizmalarda antibiyotiklere karĢı geliĢen direnç sorunu yeni tedavi arayıĢlarını gündeme getirmiĢtir. Gereç ve Yöntem: Bu projede in vitro ortamda probiyotiklerin patojen bakterilere karĢı inhibitör rollerini araĢtırmak ve probiyotikleri kullanarak patojen bağırsak bakterilerine karĢı tedavi stratejileri geliĢtirmek hedeflendi. ÇalıĢmada, bağırsak epitel hasarına neden olan; Salmonella Typhi ve Shigella dysenteria‟ya karĢı probiyotiklerin etki mekanizmalarını aydınlatmak adına; Lactobacillus acidophilus ve Saccharomyces boulardii ile yapay kalın barsak epitel hücreleri kullanıldı. Bulgular: Probiyotik mikroorganizmaların ve solubl ürünlerinin patojen mikroorganizmalar üzerine etkinliğini anlamak için yapılan çalıĢmanın ilk basamağında Müller Hinton plaklarında patojen mikroorganizmalara karĢı, probiyotiklerin inhibisyon zonu oluĢturmadığı görüldü. ÇalıĢmanın ikinci basamağı olan yara iyileĢmesi hücre proliferasyonu bölümünde; S. Typhi ve S. dysenteria‟nın hücre kültüründe Caco-2 hücresinin yara iyileĢme proliferasyon sürecini bozduğu, L. acidophilus‟un tek baĢınayken bu proliferasyon üzerine etkisi olmadığı fakat S. boulardii‟nin tek baĢınayken kontrol grubuna kıyasla hasarlı hücrenin proliferasyonunu iyileĢme yönünde arttırdığı görülmüĢtür. Enfeksiyon modelinde destrüktif etkisiyle bilinen S. Typhi ve S. dysenteria‟nın patojenitesinin azalıp azalmadığına L. acidophilus ve S. boulardii eĢliğinde bakıldığında ise L. acidophilus‟un S. Typhi ile olan kombinasyonunda kontrole göre yara iyileĢmesini hızlandırdığı, S. dysenteria ile olan kombinasyonunda ise yara iyileĢmesi üzerine etkisi 59 olmadığı görülmüĢtür. S. boulardii ise mevcut kullanılan bakteriyolojik miktarlar ile S. Typhi ve S. dysenteria‟nın eĢit miktarının yarattığı destrüktif etkiyi engelleyememiĢtir. Sonuç: Probiyotiklerin akut enfeksiyöz, invazif bakteriyel diyaredeki etkisi net değildir. Anlamlı istatistikler çıkmasına rağmen klinik öneme sahip olup olmadığını anlamak için daha çok randomize kontrollu çalıĢmaya ihtiyaç vardır.