Theses supervised by Prof. Dr. Şenay Şanlıer
10 theses · Ege University
Dermokozmetik amaçlı biyomimetik peptit içeren lipit nanopartiküllerin üretilmesi ve karakterizasyonu
21. yüzyılın anahtar teknolojisi olan biyoteknoloji, tüketicinin daha etkili ve güvenli ürün arayışları talepleri doğrultusunda, kozmetik endüstrisini etkisi altına almıştır. Yaşlanma karşıtı cilt bakım ürünlerinde meydana gelen yıllık % 6 lık büyüme hacmi biyonanoteknolojik ürünlerin pazarda etkinliğini arttırmıştır. Bu anlamda tez çalışmasında deri yaşlanmasına karşı engelleyici ürünler ortaya çıkarma amacıyla MMP-12 enziminin inhibisyonuna yönelik inhibitör peptit (PEP3) dizayn edilmiştir. PEP3, 13 µM konsantrasyon da, MMP-12 enzimini % 88 oranında inhibe etmiştir. 10 ug/ml PEP3 konsantrasyon ile HS68 hücre hattı üzerinde yapılan Western blot deneyinde, kollajen I, IV, elastin ve fibronektin proteinlerin miktarlarında artış gözlenmiştir. PEP3, katı lipit nanopartikül (KLN) ile kapsüllenmiş ve transdermal salınım çalışması yapılmıştır. Yüklenme etkinliği % 59,92 olarak bulunmuştur. PEP3 yüklü KLN, mannitol ile kurutularak stabilite çalışması yapılmıştır. Nanotoksikolojik açıdan güvenlik değerlendirilmesi yapılan PEP3'ün, KLN içeren formülasyonunun, 28 gün kullanımı sonrasında başlangıca göre %18 oranında kırışıklık azalışı meydana getirdiği bulunmuştur. Fonksiyonerliği ve güvenirliği kanıtlanmış olan PEP3 aktif içerik olarak dermokozmetik sektörüne DervatylTM marka (dermal renovation peptide) ürün adı ile sunulmuştur.
Glukoz kaplı manyetik nanopartiküllerin sentezlenerek ilaç yüklenmesi ve in vivo çalışmaları
Kanser tüm dünyada hızla artmakta ve ölüm nedenlerinin baĢlıca sebepleri arasında yer almaktadır. Son istatistiksel bilgilere göre 2020 yılında dünyadaki kanser hastası sayısının 15 milyondan fazla olacağı hesaplanmıĢtır. Kanser türlerinin çoğu lokalizasyonuna ve evrelerine bağlı olarak cerrahi müdahele, radyoterapi ve/veya kemoterapi gibi uygulamalar kullanılarak tedavi edilebilmektedir. Antrasiklin bir antibiyotik olan doxorubisin en geniĢ kullanım alanına sahip ve gerek tek bir ajan gerekse kombinasyonlu biçimde intravenöz olarak hastaya uygulanan antikanser ilaçlardan biridir. BaĢta over kanseri olmak üzere, meme, akciğer, tiroid kanseri, ve bazı tür lösemilerin tedavisinde kullanılır. Doxorubisinin düzensiz kalp atıĢları, kalp yetmezliği gibi istenmeyen birçok yan etkisi vardır. Yan etkilerinin hastanın yaĢam kalitesini düĢürmesi nedeniyle, hedef hücreye gönderilebilecek doxorubusin türevinin hazırlanması çalıĢmamızın temelini oluĢturmaktadır. Bu amaçla, glukoz kaplı manyetik nanopartikül sentezlendikten sonra hidrazon bağı ile doksorobusin bağlanmıĢtır. Glukoz kaplı manyetik nanopartiküllerin her adımda FTIR ile karakterizasyonu yapılmıĢ ve boyut analizinde nanopartiküllerin 60 ile 40 nm arasında oldukları tespit edilmiĢ, ilaç yükleme veriminin ise % 47,4 olduğu belirlenmiĢtir. HazırlanmıĢ ve karakterize edilmiĢ bu formülasyon, sağlıklı sıçanlara uygulanarak biyodağılımları ve dıĢarıdan uygulanan manyetik alan ile yönlendirilebilir olduğu tespit edilmiĢtir
Pseudomonas aureofaciens'de mcl-polihidroksialkanoatların hücre içi yıkım metabolitlerinin GC-MS ile profillenmesi
Polihidroksialkanoatlar (PHA), aşırı karbon kaynağının bulunduğu azot sınırlamalı stress koşulları altında bakterilerde granüler halde enerji rezervi depolanan biyopolimerlerdir. Fiziksel ve kimyasal özelliklerinin petrol-türevli polimerlere benzer oluşu bu biyopolimerlerin petrol-türevli plastiklerin yerini alabilmesine olanak sağlamaktadır. Aynı zamanda biyouyumlu ve biyobozunur özellikte olmaları nedeniyle PHA'lar doku mühendisliği ve biyomedikal alanında da kullanım potansiyeline sahiptir. Endüstriyel olarak üretimi ve kullanım açısından üzerine yapılmış ve devam eden birçok çalışma bulunmaktadır. Yapılan bu çalışmalar ağırlıkla üretim veriminin arttırılması ve kullanım potansiyelleri yönündedir. Ancak üretici mikroorganizmada yıkım da devam etmektedir. Bu işlem ise hücre içi PHA depolimerazlar olarak adlandırılan enzimler tarafından yapılmaktadır. PHA sentezinin arttırılması yanında, yıkımının da bloke edilmesinin/hızının azaltılmasının üretim verimini daha da arttıracağı açıktır. Bu işlemin getireceği bir diğer avantaj, üretim süresinin azalması, üretim maliyetinin düşürülmesi anlamına gelmektedir. Mevcut literatürler incelendiğinde PHA'ların hücre içi yıkım yolaklarının belirlenmesi üzerine yapılmış araştırmalar oldukça azdır. Bu tez çalışmasında, PHA üretici olarak olarak Pseudomonas aureofaciens seçilmiştir ve karbon kaynağı olarak oktanoik asit kullanılarak üç farklı koşulda mcl-PHA metabolizması incelenmiştir. PHA üretiminin teşvikdildiği, açlık ve PHA üretiminin teşvik edilmediği koşullarda belirli periyotlarla örnek alınarak bu örneklerdeki PHA profilleri çıkartılmış ve yağ asidi türevli metabolitler GC-MS ile analizlenmiştir. Yapılan analizler sonucu elde edilen metabolitlerden 3-hidroksioktanoat, trans/cis-3-oktenoik asit ve 2-oktenoik asidin doğrudan poli-3-hidroksikoktanoat (PHO) metabolizmasıyla ilşkili olduğu ve polimerin biyosentez ve yıkımının bu metabolitler üzerinden gerçekleştiği düşünülmektedir. Diğer metabolitlerin ise dolaylı yollardan temel metabolitlerin ileri dönüşüm ürünleri veya organizmanın rutin metaboliti olduğu düşünülmektedir. Elde edilen bu veriler ile PHO metabolizmasının anlaşılmasına yardımcı olabilecek literatür bilgisinin sağlanacağı düşünülmektedir.
Pseudomonas aureofaciens'de mcl-polihidroksialkanoatların hücre içi yıkım ürünü organik asitlerin belirlenmesi
Plastiklerin sahip olduğu fiziksel ve kimyasal özelliklere sahip olan, biyolojik olarak parçalanabilen biyobozunur plastiklere örnek olarak polihidroksialkanoatlar (PHA) verilebilir. Polihidroksialkanoatlar (PHA); hidroksialkanoatların (HA) poliesterleridir. Birçok bakteri tarafından karbon ve enerji kaynağı olarak karbon kaynağının aşırısının bulunduğu fakat esansiyel (N, P, S, O ve Mg gibi) elementlerin sınırlandırıldığı koşullarda üretilen PHA'ların ekstrasellüler yıkımları üzerine çalışmalara rastlanılmakla birlikte PHA'ların hücre içi yıkım yolaklarının belirlenmesi üzerine yapılmış araştırmalara rastlanılmamıştır. Bu tez kapsamında, model organizma olarak Pseudomonas aureofaciens seçilmiştir. C/N oranları değiştirilerek organizmada önce PHA biyosentez ve ardından yıkım yolakları teşvik edilerek hücre içi PHA yıkım ürünü olan organik asitler belirlenmiştir ve çalışılan PHA üretiminin teşvik edildiği, açlık ve PHA üretiminin teşvik edilmediği koşullarda belirli periyotlarla örnek alınarak bu örneklerdeki PHA profilleri çıkartılmıştır. Yapılan analizler sonucunda formik asit konsantrasyonun özellikle açlık ve PHA üretiminin teşvik edilmediği koşullarda farklanması, üretiminin teşvik edildiği, yıkımın teşvik edildiği ve PHA üretiminin teşvik edilmediği koşullarda valerik asit konsantrasyonun çalışılan diğer organik asit konsantrasyonlarından daha yüksek olması, izobütirik asitin ise sadece mcl-PHA üretiminin teşvik edildiği koşullarda tespit edilmesi, glutamik asit, treonin ve valin amino asit konsantrasyonlarının da çalışılan diğer amino asit konsantrasyonlarından farklılık göstermesi bu organik asitlerin PHA metabolizması ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Tüm bu sonuçlar, hücre içi mcl-PHA yıkım yolağının aydınlatılması ile ilgili yapılacak çalışmaların öncüsü niteliğinde olup, yapılacak yeni çalışmalara ışık tutacaktır.
Nanobubble sentezi, karakterizasyonu ve biyouyumluluğunun belirlenmesi
Bu tezde, akciğer kanserinin hedefli tedavisine imkan sağlayabilen ilaç taşıyıcı sistemin sentezi, karakterizasyonu ve biyouyumluluk testlerinin yapılması amaçlandı. Sağlıklı dokularda bulunmamasına karşılık akciğer kanserinde seviyesi artan matriks metaloproteinazlarından biri olan matriks metalloproteinaz-11 enziminin parçalayabileceği peptid dizisi belirlendi. Peptid yapısına akciğer kanserinde kullanılan kemoterapi ilaçlarından pemetrexed ve pazopanib bağlandı. Elde edilen peptid-ilaç konjugatları manyetik nanopartiküllere konjuge edildi ve bu manyetik nanokonjugatlar lipozom yapılı nanobubble'lar içine hapsedildi. Manyetik alan ve ultrases duyarlı nanotaşıyıcı sistemin dışarıdan lokal olarak uygulanan manyetik alan ile tümörlü dokuya hedeflendirilebileceği ve hedeflemenin ardından yine lokal olarak uygulanan ultrases ile de taşıyıcı sistemin nanobubble içerisinden çıkarak o bölgede birikeceği düşünülmektedir. Başlıca hedef, ilaçların terapötik indeksini artıran buna karşılık sağlıklı dokulardaki yan etkisini azaltabilen, immunolojik cevaba neden olmayan, dual hedef ve dual tedavi olanağı sağlayan ilaç taşıyıcı sistemi hazırlamaktır. Elde edilen nanokonjugat yüklü nanobubble'ın karakterizasyon çalışmaları ve biyouyumluluk testleri yapılmıştır.
Kanser tedavisinde hedgehog yolağı inhibisyonuna yönelik organometalik bileşiklerin sentezlenmesi, karakterizasyonu ve kanser tedavi potansiyelinin in vitro/in vivo/ex vivo araştırmaları
Kanserde sürekli çoğalma özelliği metabolik yolaklar ile düzenlenmektedir. Ancak Hedgehog yolağı gibi bazı metabolik yolaklar özellikle kanserin agresif olması, invazyon, metastaz yapma ve rekürrens gösterme gibi yetenekler kazanmasında önemli rol oynamaktadır. Hedgehog metabolik yolağı normal koşullar altında embriyonik gelişim sürecinde ve kendini yenileyen dokularda aktif iken, bu yolak üzerindeki bir yeniden düzenlemenin kanser oluşumuna neden olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca, Hedgehog metabolik yolağının kanser kök hücresinde aktivitesinin yüksek olması bu metabolik yolağa yönelik inhibitör arayışlarına önem katmıştır. Doktora tez çalışması kapsamında Hedgehog metabolik yolağına yönelik organometalik bileşik sentezlenmesi, karakterizasyonu, hücre kültürü çalışmaları, nüde farelerde ksenograft kanser modeli oluşturularak tedavi potansiyelinin incelenmesi ve ex vivo çalışmalarının gerçekleştirilmesi amaçlanmıştır. Çalışma sonucunda %62 oranında bir verim ile cis-4-hidroksifenilplatinum(II)diamin bileşiği sentezlenmiştir. A549-luc ve SKOV3-luc hücre hatları üzerinde yapılan MTT denemesi sonucunda IC50 değerleri sırasıyla 13,44 ve 7,91 μM olarak hesaplanmıştır. Ksenograft modellerde i.v. ilaç uygulama ile tedavi grubunda iyileşme gözlenirken kontrol grubunda tümör büyümesi devam etmiştir.
Folat reseptör hedefli doksorubisin yüklü manyetik nanopartikül içeren eritrosit veziküllerinin over kanserinde kullanılabilirliğinin in vitro koşullarda araştırılması
Over kanseri tanısı geç konabilen bir kanser türüdür dolayısıyla vakaların çoğunda tedavi için geç kalınmaktadır. Bu sebeple over kanserinde etkili bir tedavi izlenmesi oldukça önemlidir. Günümüzde kanser tedavilerinde karşılaşılan en büyük problem ise kanserli dokunun dışında sağlıklı dokuların da hasar görmesidir. Bunun yanında kişinin bağışıklık sistemi tarafından ilacın etkisiz hale getirilmesi de verilecek dozun artmasına ve buna bağlı olarak kişinin sağlıklı dokularının daha fazla tahrip edilmesine yol açmaktadır. Bu tez kapsamında bahsedilen problemlerin aşılması amaçlanmıştır. Bağışıklık sisteminin önüne geçebilmek adına hastanın kendisinden alınan eritrositlerin içeriği boşaltılarak yerine doksorubisin yüklü manyetik nanopartiküller enkapsüle edildi ve eritrosit veziküllerine over kanser hücrelerinde arttığı bilinen folat reseptörünün hedeflenmesi için folat çapası takıldı. Yapılan optimizasyon çalışmaları sonucunda 1 mL ghost hücresi başına bağlanan folat-PEG-DSPE miktarı 38,70 μg olarak bulundu. Yaklaşık %98 verimle doksorubisin yüklü manyetik nanopartiküller eritrosit veziküllerine yüklendi. Biyouyumluluk çalışmaları için yapılan protein bağlama, hemoliz ve makrofajlarca alım denemeleri sonucunda hazırlanan ilaç taşıyıcı nanopartiküler sistemin biyoyumlu olduğu ve makrofajlarca yalnız %1 oranında tutulduğu saptandı. Sitotoksisite testlerinde A2780, OVCAR3 ve SKOV3 hücreleri için IC50 değerlerinin literatür ile uyumlu olduğu ve folat çapası bağlı yapının folat çapasız yapıya göre daha fazla hücre içine girerek daha çok hücre ölümüne sebep olduğu belirlendi. Sonuç olarak geliştirilen folat bağlı doksorubisin yüklü manyetik nanopartikül içeren eritrosit veziküllerinin biyouyumlu, yüksek hedefleme kapasitesine sahip bir ilaç taşıyıcı sistem olduğu görülmüştür. Over kanseri tedavisinde kullanılabileceği düşünülmektedir.
Kanser hücrelerine hedefli biyomimetik ilaç taşıma sistemlerinin hazırlanması, karakterizasyonu ve biyopotansiyelinin araştırılması
Epitelyal over kanseri kadınlarda jinekolojik kanserlerden en fazla ölüme neden olan türdür. Manyetik ajanlar tümörlü dokuya dışarıdan uygulanan manyetik alan yoluyla direk olarak yönlendirilerek ilaç preparatlarının yan etkilerinin azaltılmasına yardımcı olurlar. Antineoplastik bir ilaç olan doksorubisin klinikte meme, over gibi birçok kanserin tedavisinde kullanılmaktadır. Eritrosit vezikülleri kişinin kendi hücrelerinden hazırlanması dolayısıyla ilaç taşıyıcı sistem olarak biyouyumluluk sorunu ortadan kaldırabilmektedir. Çalışma kapsamında doksorubisin yüklü, nişasta ve PEG diasit kaplı manyetik nanopartiküller sentezlendi. Nanopartiküller, folat ligandı takılı eritrosit ghost hücrelerinden extruder ile oluşturulan veziküller içerisine yüklendi. Hazırlanan nanoboyutlu ilaç taşıyıcı biyomimetik sistemin in vitro ilaç salım çalışmalarının ardından biyouyumluluk testleri ve over kanseri hücreleri üzerinde sitotoksisite çalışmaları yapıldı. Elde edilen sonuçlara göre biyomimetik ilaç taşıma sisteminin kontrollü ilaç salımı yaptığı, biyouyumlu olduğu ve folat reseptörü ile etkileşerek hücrelerde sitotoksisite yarattığı bulundu. Dişi fareler üzerinde gerçekleştirilen biyodağılım çalışması ve ex vivo analizlerde ilaç taşıyıcısının folat reseptörü aracılığıyla ve manyetik olarak hedef dokuda birikebildiği saptandı. Sonuç olarak, biyomimetik tasarlı doksorubisin taşıma sisteminin over kanserinde kişiselleştirilmiş tedavi sağlama potansiyeli olduğu düşünülmektedir.
Dermokozmetik amaçlı biyomimetik peptit içeren lipit nanopartiküllerin üretilmesi ve karakterizasyonu
21. yüzyılın anahtar teknolojisi olan biyoteknoloji, tüketicinin daha etkili ve güvenli ürün arayışları talepleri doğrultusunda, kozmetik endüstrisini etkisi altına almıştır. Yaşlanma karşıtı cilt bakım ürünlerinde meydana gelen yıllık % 6 lık büyüme hacmi biyonanoteknolojik ürünlerin pazarda etkinliğini arttırmıştır. Bu anlamda tez çalışmasında deri yaşlanmasına karşı engelleyici ürünler ortaya çıkarma amacıyla MMP-12 enziminin inhibisyonuna yönelik inhibitör peptit (PEP3) dizayn edilmiştir. PEP3, 13 µM konsantrasyon da, MMP-12 enzimini % 88 oranında inhibe etmiştir. 10 ug/ml PEP3 konsantrasyon ile HS68 hücre hattı üzerinde yapılan Western blot deneyinde, kollajen I, IV, elastin ve fibronektin proteinlerin miktarlarında artış gözlenmiştir. PEP3, katı lipit nanopartikül (KLN) ile kapsüllenmiş ve transdermal salınım çalışması yapılmıştır. Yüklenme etkinliği % 59,92 olarak bulunmuştur. PEP3 yüklü KLN, mannitol ile kurutularak stabilite çalışması yapılmıştır. Nanotoksikolojik açıdan güvenlik değerlendirilmesi yapılan PEP3'ün, KLN içeren formülasyonunun, 28 gün kullanımı sonrasında başlangıca göre %18 oranında kırışıklık azalışı meydana getirdiği bulunmuştur. Fonksiyonerliği ve güvenirliği kanıtlanmış olan PEP3 aktif içerik olarak dermokozmetik sektörüne DervatylTM marka (dermal renovation peptide) ürün adı ile sunulmuştur.
Doksorubisin yüklü hyaluronik asit nanopartiküllerin sentezi karakterizasyonu ve farklı kanser türlerinde uygulanabilirliğinin ın vıtro araştırılması
Kanser, Dünya Sağlık Örgütü'nün verilerine göre dünyada çapındaki ölümlerin ikinci sebebidir. Günümüzde kanser tedavisine yönelik çeşitli terapi stratejileri geliştirilmektedir. Yaygın olarak kullanılan tedavi yöntemlerinin neden olduğu yan etkiler ve kısıtlamalar yeni tedavi yöntemlerin geliştirilmesine öncülük etmektedir ki bu amaçla ilaç taşıyıcı sistemlere ihtiyaç duyulmaktadır. Bu çalışmada ilaç taşıyıcı sistem olarak hyaluronik asit nanopartiküllerin sentezi ve karakterizasyonu gerçekleştirilmiş olup, antikanser özellik göstermesi amacıyla bu nanopartiküllere doksorubisin yüklenerek farklı kanser hücre hatlarında sitotoksik etkisi incelenmiştir. Yalnızca hyaluronik asit kullanılarak oluşturulan nanopartiküller yeterli verimde, yeterince hızlı ve kolay üretilemediği için kitosan ile modifiye edilerek hyaluronik asit nanopartiküller hızlı ve başarılı bir şekilde oluşturuldu. Oluşturulan nanopartiküller için optimum hyaluronik asit konsantrasyonu 0.01 mg/mL, optimum ilaç yükleme pH'ı 8 ve konsantrasyonu 1.5 mg/ml olarak belirlendi. SKOV-3 ve A549-Luc hücre hatları için nanopartiküler sistemin IC50 değeri sırasıyla 48 ve 72 saat için 0,002 +/- 0,00265 mikrogram/ml ve 0,00078 +/- 0,00066 mikrogram/ml ve 0,84 +/- 0,69 mikrogram/ml ve 0,29 +/- 0,066 mikrogram/ml olarak tespit edildi. Sonuç olarak, hyaluronik asit nanopartiküllerin farklı kanser hücre hatlarında doksorubisin taşıyıcısı olarak potansiyele sahip olduğu düşünülmektedir.