Theses supervised by Prof. Dr. Bülent Kaya
11 theses · Akdeniz University
İki heterosiklik amin'in genotoksisitesine karşı klorofil a ve klorofil b'nin Drosophila kanat somatik mutasyon ve rekombinasyon testi ile koruyucu etkilerinin araştırılması
Bu çalışmada Drosophila melanogaster'de somatik mutasyon ve rekombinasyon testi (SMART) ile klorofil a ve klorofil b'nin (0.5 ve 1 µM) IQ ve MeIQx heterosiklik amin (HCA) bileşiklerine (1, 2 ve 5 ppm) karşı koruyucu etkileri araştırılmıştır. Çalışmada normal ve yüksek metabolik aktiviteye sahip Drosophila hatları kullanılarak iki çekinik gen olan mwh (multiple wing hair) ve flr3 (flare) bakımından transheterozigot larvalara kronik uygulamalar yapılmıştır. Öncelikle üçüncü evre larvalarda HCA dozlarının genotoksik etkileri belirlenmiştir. Antigenotoksisite çalışmalarında iki farklı uygulama grubu oluşturulmuştur. İlk grupta klorofil a, b ve HCA dozları eş zamanlı olarak 3. evre larvalara uygulanırken ikinci grupta klorofil a ve b 2. evre larvalara uygulandıktan sonra 3. evreye ulaştıklarında HCA dozları uygulanmıştır.Normal metabolik aktiviteye sahip bireylerde HCA'ların genotoksik etkilerinin azaltılmasında klorofil a ve b her iki uygulama şeklinde de başarılı olmuştur. Bununla birlikte ön uygulama grubunun eş zamanlı uygulama grubundan daha etkili olduğu belirlenmiştir. Klorofil a ve b'nin etkinlikleri arasında belirgin bir fark bulunmamıştır. Yüksek metabolik aktiviteye sahip bireylerde IQ'nun üç dozunda da genotoksik etki gözlenmemiştir. MeIQx'in düşük dozlarında da genotoksik etki bulunmazken 5 ppm yüksek dozu zayıf pozitif etki göstermiştir. IQ'nun her 3 dozunda ve MeIQx'in 2 dozunda genototksik etki görülmediği için bu dozlarda klorofil a ve b'nin yüksek metabolik aktiviteli bireylerdeki koruyucu etkileri tez kapsamında değerlendirilmemiştir. MeIQx 5 ppm dozunda eş zamanlı uygulamalarda klorofil a 1 µM dozu frekans artışına neden olmuştur. Ancak bu frekans artışı istatistiksel düzeyde önemli değildir. Klorofil a'nın diğer dozlarında ve klorofil b dozlarında antigenotoksik etki belirlenmiştir. Ön uygulama gruplarında klorofil a ve klorofil b'nin tüm dozlarında genotoksik etkide belirgin bir azalma olduğu görülmektedir ve eş zamanlı uygulamalara göre daha etkilidir.
Ayçiçek ve soya yağlarının kızartma ve kaynatma ürünlerinin Drosophila Melanogaster'de genotoksik etkilerinin araştırılması
Bu çalışmada, Drosophila melanogaster'de somatik mutasyon ve rekombinasyon testi (SMART) ile iki bitkisel yağ olan ayçiçek ve soya yağının kızartma ve kaynatma ürünlerinin genotoksik etkileri araştırılmıştır. SMART yöntemi için, genomlarında çekinik flare (flr3) ve çoklu kanat kılı (mwh) genlerini taşıyan üçüncü evre transheterozigot larvalar söz konusu yağların üç farklı konsantrasyonu (% 6, % 12 ve % 24) ile kronik olarak beslenmiştir. Söz konusu yağların genotoksik etkileri, larvaların kanat imajinal disk hücrelerinde meydana gelen genetik değişimlerin (nokta mutasyon, parça kopması, ayrılmama ve rekombinasyon) sonucunda oluşan mutant trikomlara göre değerlendirildi. Değerlendirme, Graf vd tarafından belirtilen sınıflandırma (küçük tek tip, büyük tek tip, ikiz, toplam mwh ve toplam klonlar) esas alınarak yapıldı. Ayrıca, kızartma ve kaynatma işlemine tabii tutulan yağlarda toplam polar madde (TPM) miktarı ve sıcaklık ölçüldü.Kaynatma ve kızartma işlemine tutulmayan ayçiçek ve soya yağının genotoksik etkisi olduğu saptanmıştır. Üç kez onbeş, otuz ve altmış dakika süresince ayçiçek yağı kaynatılmasında toplam klonlar için güçlü genotoksik etkiler gözlenirken ayçiçek yağı ile patates kızartılmasında ise bazı genotoksik etkiler gözlenmiştir. Öte yandan, üç kez onbeş, otuz ve altmış dakika süresince soya yağı kaynatılmasında özellikle altmış dakikada toplam klonlar için pozitif yanıt elde edilirken soya yağı ile patates kızartılmasında otuz ve altmış dakikada bazı genotoksik aktiviteler elde edilmiştir.Kaynatma ve patates kızartılması işlemine tutulan yağlarda TPM miktarı önemli ölçüde artmıştır. Yağda patates kızartılmasındaki TPM miktarı yağın kaynatılmasına göre daha yüksek bulunmuştur.Sonuç olarak, bu çalışmada kullanılan ayçiçek ve soya yağının kızartma ve kaynatma ürünlerinin D. melanogaster'de genotoksik etkiye neden olduğu saptanmıştır. Bu etkinin, kızartma ve kaynatmanın sayısı, kızartma sıcaklığı ve zamanı, kızartma yağının çeşidi ve TPM miktarından ileri geldiği sonucuna varılmıştır.
Resveratrol'ün Drosophila melanogaster'de antigenotoksik etkilerinin araştırılması
Bu çalışmada, Drosophila melanogaster'de somatik mutasyon ve rekombinasyon testi (SMART) kullanılarak farklı mekanizmalar ile hasara neden olan üç mutajene karşı (EMS, 4-NQO ve K2Cr2O7) Resveratrol'ün antigenotoksik etkileri araştırılmıştır. SMART genetik değişimleri geniş bir spektrumda hızlı ve ucuz şekilde belirlemeye yarayan güvenilir bir yöntemdir. Bu çalışmada larvalar ön ve eş zamanlı uygulamalara maruz bırakıldılar. Ön uygulama çalışmasında; ikinci evre transheterozigot larvalar Resveratrol (1, 5 ve 10 mM) dozları ile beslendikten 24 saat sonra mutajen kimyasallara maruz bırakılmıştır. Eş zamanlı uygulamalar için ise, üçüncü evre transheterozigot larvalar eş zamanlı olarak hem Resveratrol hem de mutajenlere maruz bırakılmıştır. Bu mutajenlerin genotoksik etkileri, larvaların kanat imajinal disk hücrelerinde meydana gelen genetik değişimlerin (nokta mutasyon, parça kopması, ayrılmama ve rekombinasyon) sonucunda oluşan mutant trikomlara göre değerlendirildi. Değerlendirme, Graf vd tarafından belirtilen sınıflandırma (küçük tek tip, büyük tek tip, ikiz, toplam mwh ve toplam klonlar) esas alınarak yapıldı. Resveratrol'ün 1, 5 ve 10 mM dozları Drosophila'da eş zamanlı denemelerde K2Cr2O7'a karşı güçlü bir antigenotoksik aktivite oluşturmuştur. Yine eş zamanlı denemelerde Resveratrol'ün 5 ve 10 mM dozları EMS'ye karşı antigenotoksik etki gösterirken, Resveratrol'ün 1 mM dozu genotoksik aktiviteyi çok az miktarda arttırmıştır. Diğer taraftan Resveratrol'ün 1 ve 5 mM dozları 4-NQO'ın oluşturduğu toplam klon sayılarını azaltırken, 10 mM dozu ise toplam klon sayılarını arttırmıştır. Ön uygulamalı denemelerde Resveratrol'ün 1, 5 ve 10 mM dozlarının K2Cr2O7'a ve EMS'ye karşı güçlü antigenotoksik aktiviteye sahip olduğu gözlenmiştir. Ayrıca Resveratrol'ün 1 ve 10 mM dozlarının 4-NQO'in indüklediği genotoksik hasarı arttırdığı, 5 mM dozunun ise bu hasarı azalttığı gözlenmiştir. Bu çalışma, Resveratrol'ün ön uygulamalı denemelerinde EMS ve K2Cr2O7`ın neden olduğu genotoksik hasara karşı Resveratrol'ün koruyucu potansiyelinin eş zamanlı uygulamalara göre daha yüksek olduğunu göstermiştir. Sonuç olarak Resveratrol, D. melanogaster' de EMS ve K2Cr2O7 karşı antigenotoksik etki göstermiş ancak 4 NQO'in genotoksisitesine karşı çelişkili sonuçlar görülmektedir.
Gümüş ve kobalt nanopartiküllerinin ve iyonik formlarının genotoksik potansiyellerinin KOMET yöntemi ile araştırılması
Son yıllarda hızla gelişen teknoloji ile birlikte yeni teknolojik ürün olarak nanopartiküllerin (NP, <100 nm) üretimi ve farklı alanlardaki kullanımları hemen her alanda giderek yaygınlaşmıştır. Nano kelime anlamı ile bir metrenin milyarda biri kadar olan bir ölçüdür ve 10 atomluk bir genişliği kapsamaktadır. NP'ler maksimum 100 nm veya 100 nm'den daha küçük çapta ve boyutlarına özgül özelliklere (örneğin elektron tutucu etki ve geçici mıknatıslık özelliği) sahip bileşikler olarak tanımlanmaktadır. NP'lerin çok farklı alanlarda birçok avantajı nedeniyle yaygın olarak kullanılmalarına karşın insan sağlığına ve çevreye etkileri hakkındaki bilgiler hala çok yetersizdir. Bu nedenle son teknoloji ürünü olan bu maddelerin genotoksik potansiyellerinin tespiti biyo-güvenilirlik bakımından önemlidir. Günümüzde birçok hastalığın gerek farklı mutasyonlar gerekse indüklenmiş rekombinasyon ile ilişkili olduğu bilinmektedir. Bu açıdan toplum sağlığı bakımından yoğun maruz kalınan bu tür maddelerin etkilerinin tespiti önemlidir. Bu sebeple bu çalışmada KOMET ya da SCGE olarak adlandırılan Tek Hücre Jel Elektroforez testi ile nanoteknoloji alanında yaygın olarak kullanılan Gümüş (Ag) ve Kobalt (Co) NP'lerinin iki farklı partikül büyüklüğünün (Ag: 15 ve 40 nm; Co: 15 ve 50 nm) ve bu NP'lerin iyonik formlarının literatür verileri ışığında konsantrasyon taraması ve ön uygulamaları yapılmış ve bu çalışmalar sonucunda üç farklı konsantrasyon belirlenmiştir. Belirlenen bu konsantrasyonların insan periferal kan lenfositlerinde (0.01, 0.1 ve 1 mM) ve Drosophila melanogaster'in kan hücreleri olan hemositlerinde (0.1, 1 ve 10 mM) tek iplik DNA hasarına olan etkileri değerlendirilmiştir. Ayrıca, KOMET testi ile oksidatif DNA hasarı; bu hasarın bulunmasına özgü bakteriyel enzimler, spesifik olarak okside olmuş pürin bazlarının miktarını gösteren Formamidopirimidin-DNA glikosilaz (FPG) ve yine spesifik olarak okside olmuş pirimidin bazlarının miktarını gösteren Endonükleaz III (Endo III) kullanılarak ayrıca analiz edilmiştir. Sonuç olarak, hem insan periferal kan lenfositlerinde hem de D. melanogaster hemositlerinde KOMET testi uygulamaları sonucunda Ag ve Co NP'lerinin her iki nanoboyutunun ve iyon formlarının genel olarak en yüksek konsantrasyon uygulamalarında genotoksik ve oksidatif DNA hasar yarattığı gözlemlenmiştir.
Farklı zincir uzunluklarına ve yapılarına sahip kuaterner amonyum silan bileşiklerinin toksik etkilerinin Drosophila melanogaster'da değerlendirilmesi
Alkol bazlı ve alkolsüz ürünler de dahil olmak üzere küresel dezenfektan tüketimi, COVID-19 pandemisinin başlangıcından bu yana çarpıcı bir şekilde artmıştır. Bu nedenle, bu tür ürünlerin ve karışımlarının toksik potansiyeli belirsizliğini korumaktadır. Ayrıca, alkol de dahil olmak üzere dezenfenktan üretiminde hammaddelerin yetersizliği bildirilmiştir. Dünya yeni bir zorluk veya pandemi ile karşı karşıya kaldığında malzemelerde ani bir eksiklik yaşamadan daha az yan etkisi olan ürünler elde etmek önemlidir. Bu amaçla bu çalışmada yeni bir dezenfektan olan silan kuaterner amonyum bileşikleri (Si-QAC'ler) sentezlenmiştir. Bu çalışmada, yeni sentezlenmiş alkolsüz dezenfektanların genotoksik, sitotoksik, apoptotik ve nörotoksik potansiyelleri model organizma olan Drosophila melanogaster'de değerlendirilmiştir. Silan grubunun farklı yapılara ve zincir uzunluklarına (12 C- 18 C) sahip kuaterner amonyum bileşikleri ile reaksiyonuna dayanarak yeni dezenfektanlar sentezlenmiştir. Si-QAC'lerin antimikrobiyal aktivitesi MİK testi kullanılarak değerlendirilmiştir. Genotoksik potansiyel, SMART (mutasyon ve/veya rekombinasyon) ve Komet (DNA kırıkları) analizleri kullanılarak değerlendirilmiştir. Ayrıca tripan mavisi testi kullanılarak sitotoksik potansiyel, kaspaz aktiviteleri ölçülerek apoptotik potansiyel incelenmiştir. Ek olarak, TAS/TOS testi kullanılarak oksidatif stres potansiyel değerlendirilmiştir. DNA onarım mekanizmasını anlamak amacıyla, RT2-PCR kullanılarak farklı DNA onarım yollarında yer alan 36 genin ekspresyonunu ölçülmüştür. Si-QAC'lerin nörotoksik potansiyelini anlamak için Drosophila üzerinde larva hareketi, pupa pozisyonu, negatif jeotaksis ve duyarlılık dahil olmak üzere çeşitli deneyler gerçekleştirilmiştir. SMAR testinde, Si-QAC-1'in tüm konsantrasyonlarda genotoksik etkisi olduğu kaydedilirken, yalnızca sadece en yüksek Si-QAC-2 konsantrasyonunda (% 300) mutasyon riski bulunmaktadır. Kalan Si-QAC'lerde istatistiksel önemde bir değişiklik gözlenmemiştir. Bununla birlikte, komet testi sonuçlarına göre Si-QAC-1 (% 100), Si-QAC-3 (% 25, % 50, % 100, ve % 200), Si-QAC-4 (% 50, % 200, ve % 300), ve Si-QAC-5 (% 50, % 100, % 200, ve % 300)'de DNA kırıkları tespit edilmiş ama Si-QAC-2'de anlamlı bir değişiklik belirlenmemiştir. Ayrıca, Si-QAC-2 için sitotoksik potansiyel kaydedilmemiştir, ancak Si-QAC-1'in (% 200 ve % 300), Si-QAC-3'ün (% 100, % 200, ve % 300), Si-QAC-4'ün (% 100 ve % 200), ve Si-QAC-5'in (% 300) konsantrasyonlarında anlamlı hasarlar bildirilmiştir. Kaspaz aktiviteleri, Si-QAC-1 (% 50) hariç tüm konsantrasyonlarda tüm Si-QAC'lerde artmıştır. RT2-PCR analizine göre, Si-QAC-2 (% 25) ve Si-QAC-3 (% 300) DNA onarımında yer alan genlerin çoğunu yukarı-regüle ederken, Si-QAC-1 (% 300) ana genleri aşağı-regüle edilmiştir. Tüm Si-QAC'ler oksidatif strese yol açmıştır. Larva hareketi testinde, Si-QAC-3'e (% 300) maruz kalan larvaların geçtiği mesafe kontrol grubuna göre artmış ve dolayısıyla hız da artmıştır. Negatif jeotaksis deneyinde, tüm Si-QAC'ler için herhangi bir fark gözlenmemiştir. Pupa pozisyonu deneyinde, Si-QAC-1'e maruz kalan larvalar besinden uzakta bulunmuştur. Duyarlılık testinde, Si-QAC-1 (% 25), Si-QAC-2 (% 200) ve Si-QAC-3 (% 50 , % 100, % 200, ve % 300) larvaları termoreseptörlerinden etkilemiştir. Sonuç olarak, Si-QAC-2 umut verici bir dezenfektan gibi görünmektedir, ancak en yüksek konsantrasyonlar bir miktar hasara neden olmaktadır. Bununla birlikte, dezenfektanın piyasaya sürülmesinden önce tüketicilerin güvenliğini sağlamak için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.
Yüksek şeker ve yüksek kafeinin Drosophila melanogaster'de dna hasarı ve oksidatif hasar yaratma potansiyelinin araştırılması
Son yıllarda Dünya genelinde ve özellikle Türkiye'de diyabet prevalansında önemli bir artış gözlemlenmektedir (WHO 2021). Bu artış, bireylerde hayati tehlikelere neden olurken, ekonomik açıdan da ülkelere büyük zarar vermektedir. Diyabet, bireylerde kalp hastalıkları, böbrek yetmezliği, körlük ve uzuv kaybı gibi ciddi sağlık sorunlarına neden olarak yaşam kalitesini düşürür ve ölüm riskini artırır (Global Burden of Disease 2021; Diabetes Collaborators 2023). Sürekli ilaç kullanımı, glukoz takibi ve komplikasyonlarla uğraşmak, bireyde hem psikolojik hem de ekonomik yük oluşturur (Seuring vd. 2015). Diyabetli bireylerde depresyon ve anksiyete sık görülen eşlik eden durumlardır (de Groot 2023). Toplumsal düzeyde diyabet, sağlık sistemleri üzerinde büyük bir mali yük yaratır; küresel sağlık harcamalarının yaklaşık %10'u diyabet ve komplikasyonlarına ayrılmaktadır (Uluslararası Diyabet Federasyonu 2024) Ayrıca iş gücü kaybı, erken emeklilik ve üretkenlik düşüşü ekonomik zararları büyütmektedir (Kurkela vd. 2021). Düşük ve orta gelirli ülkelerde sağlık hizmetlerine erişimde eşitsizlikleri artırarak yoksulluk döngüsünü besler (Parker vd. 2024). Yüksek şeker ile beslenme sonucunda meydana gelen oksidatif stresin insan sağlığı üzerinde nörotoksik etkilerinin olduğu bilinmektedir (Krawczyk 2023). Yaygın olarak kullanılan kafeinin Tip 2 diyabetli bireyler üzerindeki potansiyel toksisitesi hakkında bu çalışma ile birlikte literatüre yeni bilgiler ekleyerek konu kapsamında literatürdeki bilgilerin ileri taşınması hedeflenmiştir. Çalışma kapsamında kullanılan normal şeker Lewis besin ortamında bulunan şeker dozunu ifade etmektedir (Normal şeker; 11,7/128ml) Katları olan şeker miktarı bu miktarın katlarıdır. Kafein dozları mg/ml olarak verilmiştir ve K ile ifade edilmektedir (K: Kafein). Bu amaç doğrultusunda çalışmada, şeker ve kafeinin birlikte ve yalnız kafein kullanımının nörotoksik etkisi in vivo ortamda Drosophila melanogaster bireylerinin beyin hücrelerinde alkali tek hücre jel elektroforezi (KOMET) deneyi ile araştırılmıştır. Şeker ve kafein ile beslenme tercihi için D. melanogaster erginlerinde iki yönlü besine yönelim analizi gerçekleştirilmiştir. Hücresel oksidatif stres seviyesini değerlendirmek için toplam antioksidan ve oksidan seviyesinin (TAS/TOS) ölçümü gerçekleştirilmiştir. Ergin beyinlerindeki sitotoksik miktarı, membran hasarından yola çıkarak hücre canlılık testi akridin Oranj değerlendirilmiştir. Ek olarak serbest radikallerin neden olduğu oksidatif stres ile lipidlerin bozunma durumunu ortaya koymak amacıyla lipid peroksidasyonu (LPO) araştırılmıştır. Drosophila beyin hücrelerinde gerçekleştirilen KOMET sonuçlarına göre NŞ 0,5K– 2XŞ 0,1K – 2XŞ 0,5K konsantrasyonlarında DNA hasarının anlamlı bir şekilde artış gösterdiği belirlenmiştir. Besine yönelim değerlendirme sonucuna göre bireyler larval evreden ergin hale kadar yüksek şekerle beslenmelerine rağmen deney düzeneğinde yine yüksek şekeri tercih ederken yüksek kafein dozlarından kaçınmışlardır. TAS/TOS analizinde Kontrol grubuna kıyasla NŞ 0,1K ve NŞ 0,5K konsantrasyonlarda antioksidan miktarı azalma göstermiştir. Oksidan seviyesinde ise anlamlı bir değişiklik gözlemlenmemiştir. Akridin oranj testine göre hücre ölümü kontrol grubuna oranla yüksek şeker uygulamalarında istatistiksel önemde arttığı gözlemlenmiştir. Konsantrasyonlar arası lipid peroksidasyonu için anlamlı bir fark gözlemlenmemekle beraber NŞ 0,5K konsantrasyonu kontrole kıyasla az miktarda farklılık göstermiştir. Yüksek şeker ve yüksek kafein geniş doz aralıkları (NŞ 0,1K - NŞ 0,5K – NŞ 1K – NŞ 2K – 2XŞ 0,1K - 2XŞ 0,5K - 2XŞ 1K - 2XŞ 2K - 4XŞ 0,1K - 4XŞ 0,5K - 4XŞ 1K - 4XŞ 2K - 8XŞ 0,1K - 8XŞ 0,5K - 8XŞ 1K - 8XŞ 2K) kullanılarak D.melanogaster'de larval ağırlık, larval sürünme, pupa pozisyon, ergin ağırlık, negatif jeotaksis, ömür uzunluğu ve iki yönlü besin analizi olmak üzere yedi davranış parametrelerinde değerlendirilmiştir. İki yönlü besin analizi hariç diğer davranış deneyleri için 1. 3. ve 5. nesillerde ölçüm gerçekleştirilmiş ve sonuçlar kontrole göre kıyaslanmıştır. İki yönlü besin analizi için dört doz (NŞ 0,1K – NŞ 0,5K – 2XŞ 0,1K – 2XŞ 0,5K) çalışılarak sonuçlar elde edilmiştir. Larval sürünme deneyinde nesiller ilerledikçe sürünme mesafesinin dozların artışına bağlı olarak azaldığı gözlemlenmiştir. Larval ağırlık deneyinde ileri nesillere gidildikçe doz ilişkili olarak ağırlık kaybı gözlemlenmiştir. Pupa pozisyon deneyinde doz maruziyeti ile nesiller ilerledikçe hem pupa oluşma sayısı azalırken hem de larvalar alt bölgelerde (D – E – BY) daha çok pupa oluşturmuştur. Negatif jeotaksis deneyi sonucunda ileri nesillerde doza bağlı uçan/tırmanan birey sayısı azaldığı belirlenmiştir. Ergin ağırlık deneyinde dişi ve erkek bireylerde ayrı ayrı ağırlık ölçümü gerçekleştirilmiştir. Deney sonucunda 5. nesil hariç diğer nesillerde dozla ilişkili olarak hem erkek hem dişi bireylerde ağırlık kaybı görülmüştür. 5. nesilde kontrol kıyasla yine azalmıştır fakat önceki nesillere oranla artış gözlemlenmiştir. Ömür uzunluğu deneyinde ise bireyler nesiller ilerledikçe 0,1K'nın şeker birlikteliklerinde ömür uzunluğunda artış gözlemlenirken diğer dozlar için yaşam sürelerinin kısaldığı gözlemlenmiştir. İki yönlü besin analizinde 3. larval evre bireyler ergin olana kadar 2 kat şekere maruz kalmalarına rağmen besin tercihleri yine yüksek şekerli besinler olmuştur. Kafein yer alan besinleri tercih etmemişlerdir. İki kafein dozuna maruz kaldıklarında ise düşük doz kafeini tercih etmişlerdir.
Farklı formlardaki nanohidroksiapatitlerin sitotoksik ve genotoksik etkilerinin araştırılması
Biyomalzemeler, ortopedik uygulamalarda, yüz ve çene cerrahisinde, yapay kalp parçalarında, metal parçalarda ve vücuda yerleştirilebilir cihazlarda kullanılmaktadır. Bu malzemeler organizmaya uyumlu olması, alerjik olmaması, fiziksel ve kimyasal etkenlere karşı dayanıklı olması sebebiyle tıp alanında yaygın olarak kullanılmaktadır. Hidroksiapatit (HA) doku ile uyumluluk gösteren biyoaktif kalsiyum fosfat seramiklerindendir. Bu çalışmada nano boyutlu HA (nHA)'ların küre ve çubuk formlarının etkileri in vivo ortamda Drosophila melanogaster'da ve in vitro ortamda iki farklı hücrelerinde (insan embriyonik böbrek epitel (293T) ve insan vasküler endotel (HUVEC) hücre hatları) araştırılmıştır. in vivo çalışmalarda Drosophila Kanat Somatik Mutasyon ve Rekombinasyon Testi (SMART) ve Tek Hücre Jel Elektroforezi (KOMET) yöntemleri ile nHA'ların potansiyel genotoksisitesi araştırılmıştır. Hücre ölüm yolaklarındaki aktivasyonun incelenmesi amacıyla Drosophila hemositlerinde kaspaz aktiviteleri değerlendirilmiştir. Drosophila'da gen ifadelerinin araştırılması amacıyla Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT2-PCR) yöntemi ile DNA tamirinde görevli 36 adet genin ifadeleri araştırılmıştır. in vitro çalışmalar kapsamında 293T ve HUVEC hücre hatlarında WST-1 hücre canlılık testi ve tripan mavisi testi ile sitotoksisite ve KOMET ile genotoksisite potansiyeli değerlendirilmiştir. Elde edilen sonuçlara göre nHA küre ve çubuk formlarının potansiyel genotoksik etkileri D. melanogaster somatik hücrelerle ile yapılan SMART testinde küre formda küçük tek tip, toplam mwh klonlar ve toplam klonlar bakımından 50, 100 ve 200 ppm'lik konsantrasyonlarda genotoksisite tespit edilmiştir. Çubuk formlu nHA uygulamalarında çalışılan hiçbir dozda genotoksik etki gözlenmemiştir. Drosophila hemositleri ile yapılan KOMET testinde 100 ppm konsantrasyonundaki küre ve çubuk formlu nHA'lar Drosophila hemositlerinde kuyruk yoğunluğu bakımından genotoksisiteye sebep olmuştur. Yapılan kaspaz aktiviteleri çalışmalarında küre formda 200 ppm'lik konsantrasyonun kaspaz-3/7, kaspaz-8 ve kaspaz-9 aktivitesini arttırdığı belirlenmiştir. Çubuk formlu nHA 25 ve 50 ppm'lik dozlarda içsel yolak sinyal kaskadlarını (kaspaz9 ve kapaz3/7) aktive ederken, yüksek konsantrasyonlarda dışsal apoptotik yolağı (kaspaz8) aktive ettiği belirlenmiştir. Gen aktivasyonun incelendiği RT2-PCR analizinde küre formda 25 ppm'lik uygulamada Mlh1 ve Brca2 genlerinde artış gözlenirken spel1, Rad51C, dap, MCPH1, Rad51D, Rad1, Pms2, mu2, Sir2 genlerinde azalma meydana gelmiştir. 200 ppm'lik konsantrasyonda ise Mlh1 geninin ifadesinde artış gözlenirken Fen1, Rad9, Fancd2, Rad51C, Hus1-like, dap, DNA-ligl, MCPH1, Rad51D, Ercc1, Rev1, Pms2, tefu, RpLP2 genlerinin ifadesinde ise azalma meydana gelmiştir. Çubuk formda 25 ppm'lik konsantrasyonda azalma, Mlh1 ve Brca2 gen ifadelerinde artış gözlenmiştir. Bunun yanında CG9601/PNKP, Rev1, Dap, mu2, RpLP2, Pms2, spel1, Sir2, Rad51C, PCNA, stg, Rad51D, Fen1, MCPH1 genlerinde azalma meydana gelmiştir. 200 ppm'lik konsantrasyonda çalışan genlerin ifadelerinde artış meydana gelmemiş olup Xpac, spel1, Fen1, Rad9, Tbp, Cdk7, DNApol-eta, Fancd2, XRCC1, Rad51C, Hus1-like, Ogg1, dap, DNA-ligl, CG9601, mei-41, MCPH1, put, Rad51D, Rev1, Rad17, Rad1, Pms2, mu2, tefu, RpL32, Sir2, RpLP2, stg, SdhA genlerinde azalma tespit edilmiştir. Tez çalışması kapsamında 293T hücrelerinde WST-1 testi ile yapılan değerlendirmede hem küre hem de çubuk formlu nHA uygulamalarında 24, 48 ve 72 saatlik inkübasyon sürelerinde doza bağlı olarak hücre canlılığının arttığı gözlenmiştir. Tripan mavisi ile yapılan testte küre formda doza bağlı olarak azalan sitotoksik etki gözlenmiştir. Çubuk formda ise sitotoksik etki saptanmamıştır. HUVEC hücre hattında WST-1 testinde hücre canlılığının hem küre hem de çubuk formda doza bağlı olarak arttığı gözlenmiştir. Tripan mavisi ile yapılan değerlendirmede sadece 24 saatlik inkübasyonda küre formda 1000, 800, ve 600 ppm'lik konsantrasyonlarda sitotoksik etki gözlenmiştir. Çubuk formda ise 48 ve 72 saatlik inkübasyon sürelerinde sitotoksik etki gözlenmiştir. in vitro komet sonuçlarına göre küre formlu nHA 293T hücrelerinde kuyruk yoğunluğu parametresinde genotoksik etkinin her üç inkübasyon süresinde de düşük dozlarda daha fazla olduğu gözlenmiştir. Çubuk formlu nHA'nın 293T hücrelerindeki genotoksik etkileri kuyruk yoğunluğunda 24 saatlik inkübasyon süresinde 200 ppm haricindeki dozlarda genotoksik etki gözlenirken 48 saatlik inkübasyon süresinde 400 ppm'lik dozda 72 saatlik inkübasyon süresinde 200 ve 400 ppm'de DNA hasarı gözlenmiştir. Küre formlu nHA'nın HUVEC hücrelerindeki genotoksik etkisi kuyruk yoğunluğu parametresinde 24 saatlik inkübasyon süresinde 200 ppm, 48 saatlik inkübasyon süresinde 800 ppm ve 72 saatlik inkübasyon süresinde 1000 ppm haricindeki tüm dozlarda DNA hasarı gözlenmiştir. Çubuk formlu nHA HUVEC hücrelerinde kuyruk yoğunluğu parametresinde 24 saatlik inkübasyon süresinde 200 ve 400 ppm, 48 saatlik inkübasyon süresinde 400 ve 800 ppm dozlarında genotoksik etki gözlenmiştir. Bunun yanında 72 saatlik inkübasyon süresinde çalışan dozların hiçbirinde DNA hasarı gözlenmemiştir. Çalışmadan elde edilen sonuçlara göre çubuk formun hem D. melanogaster'da yapılan hem de 293T ve HUVEC hücre hatları ile gerçekleştirilen deneylerde küre forma göre daha az toksik etkiye neden olduğu gözlenmiştir. Küre form hem morfolojik yapısı hem de boyutsal olarak çubuk forma göre daha küçük olması sebebiyle hücrelerdeki toksisite yanıtlarını indüklemiş olabileceği düşünülmektedir.
Drosophila melanogaster'de demir bazlı metalik-manyetik nanopartiküllerin etkilerinin araştırılması
Nanopartiküllerin (NP'lerin) yeni bir sınıfı olan manyetik NP'ler (MNP) günümüzde ilaç taşıma sistemleri, tıbbi tanı ve tedavi, hücre ayrıştırma, biyosensörler, manyetik rezonans görüntüleme, kanser ve hipertermi tedavileri de dahil olmak üzere birçok alanda sıklıkla kullanılmaktadır. Özellikle MNP'lerin doğrudan insan üzerinde kullanım alanlarına sahip olması, bu NP'lerin insan ve dolayısıyla çevre üzerindeki potansiyel toksisiteleri hakkındaki bilgi eksikliği nedeniyle büyük bir endişe yaratmaktadır. Bu nedenle MNP'lerin toksikolojik değerlendirmelerinin yapılması ve bu değerlendirmelere göre de MNP kullanımlarının tekrar gözden geçirilmesi oldukça önemlidir. Bu çalışmada 4 farklı metalik-MNP'ün (Fe3O4 NP, CoFe2O4 NP, MnFe2O4 NP ve NiFe2O4 NP) Drosophila melanogaster üzerindeki genotoksik potansiyelleri; Drosophila kanat somatik mutasyon ve rekombinasyon testi (SMART) ve Drosophila hemositlerinde alkali tek hücre jel elektroforezi testi (KOMET) yöntemleriyle araştırılmıştır. Çalışma kapsamında gerçekleştirilen SMART yönteminden elde edilen veriler değerlendirildiğinde, NiFe2O4 NP'ünün en yüksek konsantrasyonunda ve CoFe2O4 NP'ünün ise 3 ve 10 mM'lık konsantrasyonlarında toplam klon sayısı parametresine göre istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde genotoksisitenin indüklendiği tespit edilmiştir. Fe3O4 NP ve MnFe2O4 NP uygulamalarının ise istatistiksel önemde farklılık tespit edilmemiştir. KOMET yönteminden elde edilen veriler 3 parametre açısından değerlendirildiğinde; kuyruk uzunluğu parametresi bakımından Fe3O4 NP, CoFe2O4 NP, NiFe2O4 NP'lerinin çalışılan bütün konsantrasyonlarda (1, 3, 5 ve 10 mM) ve MnFe2O4 NP'lerinin ise en yüksek 3 konsantrasyonunda (3, 5 ve 10 mM) istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde DNA hasarının indüklendiği belirlenmiştir. Kuyruk yoğunluğu parametresi bakımından Fe3O4 NP ve NiFe2O4 NP'lerinin en yüksek konsantrasyonlarında (10 mM) istatistiksel olarak anlamlı bir DNA hasarının indüklendiği tespit edilmiştir. Son parametre olan kuyruk momenti açısından Fe3O4 NP ve MnFe2O4 NP'lerinin en yüksek 2 konsantrasyonunun (5 ve 10 mM), NiFe2O4 NP'lerinin ise 3, 5 ve 10 mM'lık konsantrasyonlarının istatistiksel olarak anlamlı DNA hasarına yol açtığı gösterilmiştir. CoFe2O4 NP'leri ise kuyruk momenti parametresi bakımından istatistiksel olarak anlamlı bir DNA hasarına yol açmamıştır.
İnsektisit formülasyonlarında farklı oranlarda bulunan düşürücü ve sinerjist etkili madde kombinasyonlarının genotoksik etkileri
Dünya nüfusunun hızlı bir ivme kazanarak artması evrensel gıda ürünlerine olan talebin artmasına sebep olmakta ve beraberinde bu talebin karşılanabilmesi gerektiği için pestisit kullanımının önemli bir oranda artışına neden olmaktadır. Yeterli düzeyde ürün elde edebilmek amacıyla pestisit kullanımı her geçen gün hızla artarken beraberinde insan ve diğer canlıların, onların yaşadığı çevrenin pestisitlere maruz kalması kaçınılmazdır. Maruziyet insan ve diğer canlıların sağlığına zarar verebilecek boyutta tehdit edebilmektedir. Bu tehdidin boyutunun tespit edilebilmesi için araştırmaların yapılması büyük bir önem arz etmektedir. Pestisitlerin kullanımının canlılarda verebileceği en önemli zarar kuşkusuz genetik materyal olan DNA'da meydana gelecek hasarlardır. Genetik materyalde meydana gelebilecek hasarların tespitinde çok çeşitli model organizmalar kullanılmaktadır; ancak en yaygın model organizma ökaryotik bir model organizma olması ve çalışmaların da in vivo koşullarda yapılabilmesi bakımından Drosophila melanogaster'dir. Bu nedenle bu tez çalışmamızda genetik yapısı bakımından büyük oranda insanlarla benzerliği bulunan ökoryatik bir model organizma olan D. melanogaster'de in vivo bir test yöntemi olan kanat somatik mutasyon ve rekombinasyon testi (SMART) kullanılarak, normal ve yüksek metabolik aktiviteye sahip bireylerden elde edilen 72 ± 4 saatlik transheterozigot larvalarına, insektisit grubundan Tip I sınıfı düşürücü etkiye sahip Tetramethrin (1, 5, 25, 50 ve 100 ppm) ve S-bioallethrin (0.1, 0.5, 1, 5 ve 50 ppm) ile kimyasallarda sinerjist etki sağlayarak daha fazla etkili olmalarını sağlayan Piperonil bütoksit (PBO) (1, 5, 25, 50 ve 100 ppm) tek başına uygulamaları ve PBO + S-bioallethrin ( 25 ppm PBO + 0.5, 1 ve 5 ppm S-bioallethrin) ile PBO + Tetramethrin (25 ppm PBO + 3.125, 6.25 ve 12.50 ppm Tetramethrin) birlikte uygulamaları yapılarak oluşturabileceği genetik hasarlarının boyutları araştırılmıştır. Çalışmamızda normal ve yüksek metabolik aktiviteye sahip D. melanogaster bireyleri kullanılması ile olası genetik etkilerin kimyasalın kendisinden mi yoksa parçalanma ürünlerinden mi kaynaklı olduğunun tespiti amaçlanmıştır. Drosophila SMART yöntemi kanat imajinal disk hücrelerinde delesyon, nokta mutasyon, ayrılmama ve rekombinasyon sonucunda meydana gelen genetik değişimler ve bu değişimlerin fenotipte mutant trikomlar olarak gözlenebilmesi esasına dayanır. Çalışmamızda kullanılan pestisitlerin Drosophila larvalarının kanat imajinal disklerinde meydana getirdiği genetik değişimlerin bir sonucu olarak fenotipe yansıyan mutant trikomlarının tespit edilmesi ile sonuçlar değerlendirilmiştir. Bu çalışmanın sonucunda; normal metabolik aktiviteye sahip bireylerde Tetramethrin, S-bioallethrin ve PBO'nun tek başına uygulanan tüm dozlarının klon frekanslarında nispeten kontrol grubuna göre istatistiki açıdan önemli olmayan azalma saptanmıştır. Normal bireylerin birlikte uygulama dozlarından 25 ppm PBO + 6.25 ppm Tetramethrin ve 25 ppm PBO + 12.50 ppm Tetramethrin dozunun klon sayısı göreceli olarak kontrol grubuna göre daha yüksek çıksada diğer taraftan birlikte uygulamaların dozlarında toplam klon sayısında bir azalma gözlenmiştir. Ancak bu ortaya çıkan farklar istatistiksel olarak önemli değildir. Yüksek metabolik aktiviteye sahip bireylerde tek başına uygulamalarda S-bioallethrin ve Tetramethrin'in bütün dozlarının klon frekanslarında kontrol grubuna göre nispeten bir artış gözlenmiş ancak istatistiki olarak kontrol grubundan farksız olmadığı belirlenmiştir. PBO'nun tek başına uygulanan dozlarında 50 ve 100 ppm'de klon frekansını azalttığı gözlenirken 1, 5 ve 25 ppm dozlarında ise kontrol grubuna göre artış olduğu görülmesine rağmen istatistiksel önemde değildir. Yüksek metabolik aktiviteye sahip bireylerde birlikte uygulamalarda 25 ppm PBO + 6.25 ppm ve 25 ppm PBO + 12.50 ppm Tetramethrin dozunda toplam klon sayısında istatistiksel önemde olmayan bir artışla birlikte uygulanan diğer dozlarında klon frekansında kısmen bir düşüş gözlenmiştir. Elde edilen normal ve yüksek metabolik aktiviteye sahip bireylere yapılan bütün uygulamalarda klon frekanslarındaki değişimlerin istatistiksel önemde olmadığı saptanmıştır. ANAHTAR KELİMELER: Drosophila, Genotoksisite, Piperonil bütoksit (PBO), S-Bioallethrin, SMART, Tetramethrin.
Bazı fungisitlerin genotoksik etkilerinin Drosophila smart yöntemi ile araştırılması
Gıda ihtiyacı ve ekonomik sebeplerle, tarımda verimi artırmak, zararlılarla mücadele etmek ve ürünlerin çabuk bozulmalarını önlemek için pestisit kullanmak gerekmektedir. Kullanılan bu pestisitler, bazen hedef dışı organizmalara negatif etkileri, çevre kirliliği oluşturması, besinler üzerindeki kalıntıları nedeniyle insan sağlığını olumsuz etkileyebilmektedir. Bunun yanı sıra, organizmaların zamanla pestisitlere karşı direnç kazanabilmesi sebebiyle yeni ve güvenli pestisit geliştirme çalışmaları sürekli olarak devam etmektedir. Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı'nın verilerine göre ülkemizde son 10 yılda pestisit olarak en çok kullanılan kimyasallar fungisitler olmuştur. Bu nedenle bu çalışmada ülkemizde fungus kontrolünde yaygın olarak kullanılan dört fungisitin (Metiram, propamocarb hydrochloride, hymexazol ve kresoxim methyl) genotoksik etkileri model organizma Drosophila melanogaster ile yapılan in vivo kanat Somatik Mutasyon ve Rekombinasyon Testi (SMART) ile araştırılmıştır. Bu test sisteminde, 72±4 saatlik transheterozigot larvalar fungisit içeren Drosophila hazır besini ile 48 saat boyunca kronik maruziyete bırakılmıştır. Çalışmada mwh/mwh ve flr3/TM3, Bds genetik yapılı bireylerin çaprazlanması ile elde edilen transheterozigot larvalar kullanılmıştır. Çalışılan bütün fungisitler suda çözdürülerek 1, 2, 5 ve 10 mM dozları larvalara uygulanmıştır. Maruziyet sonucunda kanat imajinal disk hücrelerinde oluşan bazı mutasyonlar (delesyon, nokta mutasyon ve ayrılmama) fenotipe mutant kanat trikomları şeklinde yansıması ile tespit edilebilmektedir. Sonuçlar istatistiksel olarak değerlendirildiğinde propamocarb hydrochloride'in sadece 10 mM'lık dozunun ikiz klon kategorisinde; kresoxim methylin 1 mM'lık dozunun küçük tek tip klonlarında ve bütün dozlarının ise ikiz klonlarında; hymexazolun 5 ve 10 mM dozlarının ikiz klonlarında; metiramın 1, 2 ve 5 mM dozlarının ikiz klonlar kategorisinde bir miktar klon artışı olduğu tespit edilmiştir, fakat oluşan bu artışların istatistiksel olarak önemsiz olduğu bulunmuştur. Diğer çalışılan dozlar ve kategorilerin istatistiksel değerlendirilmesinde ise kontrol grubuna göre negatif sonuçlar elde edilmiştir. Sonuç olarak metiram, propamocarb hydrochloride, hymexazol ve kresoxim methylin Drosophila SMAR testi ile değerlendirilmesinde genotoksik etki bulunmamıştır (p>0.05).
MgO and CeO2 nanopartiküllerinin ve iyonik formlarının genotoksik etkilerinin drosophila smar testi ile araştırılması
Metal oksit nanopartiküllerinin (NP) küresel satışlarının her geçen yıl hızlı bir şekilde arttığı dikkate alındığında insanların ve çevrenin bu NP'lere maruziyetinin artması kaçınılmaz bir sonuçtur. Artan bu maruziyet ile beraber ortaya çıkabilecek olumlu veya olumsuz sağlık etkilerinin araştırılması büyük önem taşımaktadır. Bu çalışmada da Drosophila melanogaster üzerinde in vivo bir test sistemi olan kanat somatik mutasyon ve rekombinasyon testi (SMART) ile kullanımı yaygınlaşmaya başlayan seryum oksit (CeO2) ve magnezyum oksit (MgO) nanopartikülleri ve bunların iyonik formlarının genetik hasar (delesyon, nokta mutasyonu, ayrılmama ve rekombinasyon) yaratma potansiyelleri araştırılmıştır. İki gen bakımından (mwh ve flr3) transheterozigot olan 72 ± 4 saatlik larvalara CeO2 ve MgO NP'leri ile iyonik formlarının her biri için 4 farklı konsantrasyonu (1, 2, 5 ve 10 mM) ile uygulaması yapılmıştır. Drosophila SMART, kanat imajinal disk hücrelerinde oluşan genetik değişimler sonucu heterozigotluğun kaybolması ve farklılığın fenotipte gözlenmesine göre değerlendirilmektedir. Çalışma sonucunda CeO2 iyonik formunun sadece en yüksek dozunda (10 mM) toplam klon sayısını indüklediği saptanırken, CeO2 NP uygulama sonuçlarının ise tüm dozlarında toplam klon frekansını inhibe ettiği saptanmıştır. MgO NP'nün uygulama sonuçlarında sadece en yüksek dozunda (10mM) toplam klon sayısını arttırarak pozitif sonuç verdiği ve MgO iyonik formunun ise uygulama dozlarından 5mM haricinde diğer dozlarda (1, 2 ve 10mM) toplam klon sayısını kontrol grubuna göre istatistiki olarak arttırarak genotoksisiteyi indüklediği gözlenmiştir.