363
Archived Theses
0
DOIs Assigned
0%
DOI Rate
Discipline
İyonize radyasyon uygulanan böbrek hücre hattında timokinonun dna hasarı ve apoptotik genlere etkisi
İyonize radyasyon ışımaları olarak bilinen X ve gamma ışımalarıyla birlikte alfa ve beta parçacıkları da geçtikleri ortamda iyonizasyona yol açarlar. Bu çalışmada, böbrek hücre hattında iyonize radyasyon sonucu oluşabilecek DNA hasarı ve apoptotik genlere etkisini belirlemek ve bu oluşan hasara karşı timokinon uygulamasının etkilerinin komet assay ve qRT- PCR yöntemiyle belirlemesi amaçlandı. Böbrek hücreleri hücreleri; 37oC, %5 CO2 ve %95 nem içeren ortamda, %10 FBS, %1 L-Glutamin ve %1 penisilin/streptomisin DMEM high glukoz besi yeri (medyum) ortamında çoğaltıldı. MTT canlılık testi sonucuna göre belirlenen Timokinon'un hücre proliferasyonunu en çok arttıran konsantrasyonu 10 µM uygulandı. Çalışma grupları; Kontrol, Timokinon, İyonize Radyasyon, İyonize Radyasyon+Timokinon ve Timokinon+İyonize Radyasyon olmak üzere 5 grup oluşturuldu. Çalışma sonucunda 24 ve 72 saat sonunda belirlenen İyonize Radyasyon toksik dozu gruplarına 18 ve 10 Gy olarak belirlendi. 24 saat inkübe edilen hücrelerden Comet assay ile DNA hasar ve RT-qPCR ile de hedef genlerin ekspresyon düzeyleri belirlendi. DNA Hasarı ve Kuyruk Momenti ölçüm değerleri bakımından gruplar arasındaki istatistiklere göre, her ikisinde de RD grubu diğer gruplardan anlamlı şekilde yüksek bulunmuştur (p<0.05). 24. saatte kaspaz 3,8,9 da TQ ve RD grupları arasında anlamlı fark tespit edilmiştir (p<0.05).72. saatte ise kaspaz 3,8,9 ile kontrol ile diğer gruplar arasında anlamlı fark tespit edilmiştir. Sonuç olarak, yüksek doz iyonize radyasyon uygulamasının 24 ve 72. saatin sonunda böbrek hücre hattında DNA hasarı ve apoptotik enzimleri üzerine etkili olduğu, bununla birlikte, timokinon'un radyasyona bağlı oluşabilecek yan etkileri azaltmada veya etkiler sonucu oluşabilecek komplikasyonları önlemede etkili olabileceği kanısına varıldı.
Ratlarda doksorubisin ile oluşturulan kardiyotoksisite üzerine incir (Ficus carica) çekirdeği yağının etkisi
.Doksorubisin (DOX), yaygın olarak kullanılan anti-tümör ilaçlardan biridir ve yan etkileri arasında kardiyotoksisite yer almaktadır. Bu çalışmanın amacı; antioksidan ve antiinflatuar özelliklerinin olduğu bildirilen incir çekirdeği yağının (İÇY) ratlarda DOX ile oluşturulan kardiyotoksisitede olası koruyucu etkilerini incelemektir. Bu amaçla 32 adet rat kullanıldı ve ratlar rastgele her biri 8 rattan oluşan 4 gruba ayrıldı: Kontrol grubu, İÇY grubu, DOX grubu, İÇY+DOX grubu.14 gün olan deneme sonunda kan örnekleri alındı, kalp histopatolojik değerlendirme için çıkarıldı. Ratların serumunda CK-MB, AST, LDH aktiviteleri ile trigliserit, total kolesterol ve HDL düzeyleri otoanalizörde, MDA, AOPP, GSH, TNF- alfa ve IL-6 analizleri ise uygun rat kitleri kullanılarak ELISA'da yapıldı. LDL seviyeleri formülle hesaplandı. Ayrıca kalp dokusu histopatolojik olarak incelendi. DOX grubundaki ratlara ait kalp dokularının histopatolojik incelenmesinde, kardiyak miyositlerde şiddetli düzeyde hyalin dejenerasyonu, nekroz, interstisyel aralıklarda ödem ve interstisyel damarlarda şiddetli düzeyde hiperemi belirlendi. İÇY+DOX grubunda ise kardiyak miyositlerde hafif düzeyde dejenerasyon ve damarlarda hiperemi saptanırken, nekroz hiç görülmedi. Biyokimyasal analizler sonucu İÇY+DOX grubunda DOX grubuna göre CK-MB (p<0.0001), LDH (p<0.01), AST (p<0.01), trigliserit (p<0.05), total kolesterol (p<0.01), LDL (p<0.01), MDA (p<0.001), AOPP (p<0.001), TNF-α (p<0.0001) seviyeleri düşerken, HDL (p<0.01) ve GSH (p<0.0001) düzeylerinin istatistiksel olarak yükseldiği görüldü. Sonuç olarak; İÇY kullanımı, yükselen kardiyak enzimleri düşürdü, bozulan lipit profilini düzenledi, artan oksidatif stresi ve inflamasyonu azalttı. Dolayısıyla, antioksidan, anti-inflamatuar ve antihiperlipidemik özellikleri nedeniyle İÇY'nın DOX kaynaklı kardiyotoksisitede potansiyel kardiyoprotektif etkilere sahip olduğu söylenebilir. Ancak İÇY'nın klinik uygulamalarda etkinliğini ve güvenliğini belirlemek için ek çalışmalara ihtiyaç vardır.
Silybum marianum (L.) tohum ekstraktının NRK-52E hücre serisinde PI3K/akt/mTOR yolağına ve DNA tamirine etkisinin değerlendirilmesi
Ceran F, Silybum Marianum (L.) Tohum Ekstraktının NRK-52E Hücre Serisinde PI3K/Akt/mTOR Yolağına ve DNA Tamirine Etkisinin Değerlendirilmesi. Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Biyokimya (Veteriner) Anabilim Dalı, Yüksek Lisans Tezi, Van, 2025. Oksidatif strese bağlı olarak, hücre içi yolaklarda ve genetik sistemlerde hasar meydana geldiği bilinmektedir. Silybum Marianum ekstraktında (SME) yer alan silimarin ve türevlerinin hücresel hasarlara karşı koruyucu etki gösterdiği; başta karaciğer olmak üzere birçok dokuyu koruduğu ve protein ekspresyonunu artırdığı rapor edilmiştir. Bu tez çalışmasında, H 2 O 2 kaynaklı genotoksik hasar ve PI3K/Akt/mTOR yolağına olan etkisinin önlenmesinde SME'nin rolünün ortaya konulması amaçlanmıştır. Hücre içi metabolik olaylardan en çok etkilen dokulardan biride böbrektir. Çalışma materyalı olarak rat böbrek hücre hattı seçilmiştir. Çalışma grupları; Kontrol, Serum Açlık(SA), SME, H 2 O 2 (HP), ve SME+HP olarak oluşturuldu. Hücrelere uygulanacak H 2 O 2 ve SME konsantrasyonları, MTT testi ile belirlenmiştir. Genomik hasar tespiti için comet assay analizi, genlerin ekspresyon düzeylerini belirlemek için ise RT-qPCR analizi uygulanmıştır. SME'nin proliferatif konsantrasyonu, 25 μg/ml, H 2 O 2 'nin hücrelerin sitotoksik konsantrasiyonu (IC25) 30 μM olarak belirlenmiştir. Gruplara göre SME ve HP uygulanmış ve 8 saatin sonunda çalışma gruplarından hücre örnekleri ile total mRNA izole edilmiştir. Elde edilen mRNA'ların ekspresyon seviyeleri belirlenmiştir. HP uygulanan grupta, kontrol grubuna göre genomik hasarın arttığı ((p<0,05)) gözlemlenmiştir. SME+HP grubunda ise, genomik hasarın HP grubuna kıyasla anlamlı düzeyde azaldığı (p<0,05) ortaya konulmuştur. Kontrol grubuna göre TP53 ve PARP-1 genlerinin mRNA düzeylerinin HP grubunda azaldığı, SME+HP grubunda ise HP grubuna göre daha yüksek olduğu belirlenmiştir. HP grubunda, PI3K/Akt/mTOR yolaklarında yer alan hedef genlerin ekspresyon seviyelerinin kontrol grubuna göre anlamlı seviyede azaldığı (p<0,05); buna rağmen, SME+HP grubunda bu genlere ait ekspresyon seviyelerinin kontrol grubuna yaklaştığı ortaya konulmuştur. Bu veriler ışığında, sitotoksik konsantrasyonda H 2 O 2 'in genomik hasara, PI3/Akt/mTOR yolak ve TP53 ile PARP-1 tamir genlerinin ekspresyon seviyelerinin azalmasına neden olduğu tespit edilmiştir. Sonuç olarak, Silybum marianum ekstraktının in vitro şartlarda oksidatif stres kaynaklı genotoksik hasarı azaltığı ve PI3K/Akt/mTOR yolaklarındaki olumsuz düzenlemeleri dengelediği, hücresel savunmayı desteklemede potansiyel bir koruyucu ajan olduğu ortaya konulmuştur. Bu sonuçların net bir şekilde desteklenmesi için in vivo ve faz çalışmalarının yapılması gerekmektedir.
Kolon kanserinin tedavisinde fenotiyazin yapılı bileşiklerin kullanımlarının değerlendirilmesi ve etki mekanizmalarının araştırılması
Kansere bağlı ölümlerin en etkili nedenlerinden biri olan kolon kanseri, evrensel bir sorun olarak nitelendirilmektir. Epidomiyolojik çalışmalar, kanser ve nörodejeneratif hastalıkları birbirleri ile ilişkilendirmektedir. Transmembran bir protein olan amiloid prekürsör protein (APP), kanser ile ilgili araştırmalarda son zamanlarda oldukça dikkat çekmektedir. Üç APP aile üyesinden biri olan APP, en fazla çalışılan protein olup, kırılması sonucu β-amiloid peptid oluşumunun neden olduğu Alzheimer hastalığın'da (AH) temel rol oynamaktadır. AH'nda, APP'nin proteolitik olarak işlenmesi, 2 yol ile gerçekleşmektedir: (i) α-sekretaza bağlı amiloidojenik olmayan yol (ii) β-sekretaza bağlı amiloidojenik yol. Bu yolaklarda, sekretazlar adı verilen bir grup enzim tarafından proteolitik kırılma sonucu farklı fonksiyonları olan fragmentler üretilmektedir. APP'nin yanı sıra, diğer üyeler de (APLP1 ve APLP2), sekretazlar tarafından parçalanarak C-terminal fragmentlerin (CTF) salınmasına neden olmaktadır. Son araştırmalar, kanser hücrelerinde aşırı eksprese edilen APP ve/veya APLP2'nin inhibe edilmesinin ya da bu proteinlerin proteolitik kesim enzimlerine (α- ve β-sekretazlar gibi) karşı geliştirilen inhibitörlerin kanser hücre çoğalmasını azalttığını göstermektedir. Çünkü, APP ve amiloid prekürsör-benzeri protein-2 (APLP2) ekspresyonlarının ve bunların kesim ürünüleri CTF'lerin birçok kanser türünde, kanser hücre proliferasyonuna korelasyon göstererek arttığı bulunmuştur. Kolon kanseri ile ilgili in-vitro ve in-vivo çalışmalarda, APP'nin büyüme için gerekli olduğu bildirilmiştir. APP'nin, α-sekretaz (ADAM10) tarafından kesilmesi ile oluşan çözünür, sekrete formu sAPPα'nin sadece nöronal sağlığı destekleme işlevi olmayıp, aynı zamanda hücre büyümesi, çoğalması ve migrasyonu ile de yakından ilişkili olduğu tespit edilmiştir. Yakın zamanda, pankreas kanseri hücre hatları ile yapılan bir çalışmada, α-sekretaz (ADAM10) aracılı sAPPα oluşumu inhibe edildiğinde, hücre büyümesinin ve proliferasyonun etkili bir şekilde azaldığı gösterilmiştir. Aynı zamanda total APP ve sAPPα üzerinden de antikanser etkiye sağladığı katkı araştırılmak istenmektedir. Yakın zamanda laboravuvarımızda gerçekleştirilen çalışmalarda, fenotiyazin yapısına sahip azur B bileşiğinin total APP ve sAPPα üzerinde göstermiş olduğu etkili azalma, ayrıca TBO ve TH'nin PS70 hücrelerinde total APP ve sAPPα düzeylerinde yine, azaltıcı etki göstermesi, fenotiyazin yapısına sahip bileşiklerin, antikanser etkiye katkı sağlayabileceği öngörülmektedir. Sonuç olarak, fenotiyazin yapılı bileşiklerin , total APP, APLP2, sAPPalfa, sAPLP2alfa ve sAPPalfa ile yakından ilişkili alfa-sekretaz üzerine ilişkisi incelenecektir. Ayrıca, sAPPalfa'nın fosfotidil inozitol-3-kinaz-Akt kinaz sinyalizasyon yolağında anahtar bir rol oynaması nedeniyle bu yolak açısından antiproliferatif etkileri değerlendirilecektir.
Meme kanseri hücrelerini saptayan HER2 antikoruyla işlevselleştirilmiş kuvars kristal mikrodenge temelli biyosensörün geliştirilmesi
Bu çalışmada, HER2 ekspresyonu artmış meme kanseri hücrelerinin erken tespit edilebilmesine imkan tanıyabilecek kullanımı kolay, güvenilir, etkili, hızlı, duyarlı, özgül ve doğrudan gerçek zamanlı izlemeye olanak sağlayan antijen-antikor temeline dayalı QCM sensör sistemi geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, QCM çipi polimerik nanopartiküllerle kaplanmıştır. Nanopartikülleri hazırlamak için monomer fazı hidroksietilmetakrilat (HEMA) ve etilen glikol dimetakrilat (EDMA) kullanıldı. Nanopartiküller Zeta Sizer ve FTIR ile incelendi. Nanopartiküllerin homojen şekilde oluştuğu ve boyutlarının 73,22 nm olduğu belirlendi. Elde edilen poli-hidroksietilmetakrilat (PHEMA) nanopartiküller tozsuz ortamda UV ışık altında 20 dk inkübe edilerek çip yüzeyine bağlandı. Nanopartiküllerin bağlı olduğu çip yüzeyinin özellikleri temas açısı, elipsometri, SEM ve AFM ile belirlendi. Nanopartikül kaplanmış altın çip yüzeyi, karbodiimid aracılığıyla bağlanan HER2 antikoru ile işlevselleştirildi. SKBR3, MDA-MB 231 ve fibroblast hücre örnekleri, çip üzerinden 10-500 hücre/ml ve 0.5 ml/dk hızda geçirilerek eş zamanlı hücre analizi gerçekleştirildi. QCM sensör yüzeyi için hücre/cm2 birim alanda meydana gelen kütle artışları (m) karşılaştırıldı. HER2 bağlı QCM çipin tespit limiti (LOD) 10 hücre/ml olarak bulundu. Hücre seçiciliğinin belirlenmesi için yapılan çalışmada sensörün SKBR3 hücrelerine, HER2 içermeyen MDA-MB 231 hücrelerine göre 6.32 kat, fibroblast hücrelerine göre ise 8.40 kat daha fazla seçiciliğe sahip olduğu saptandı. HER2 bağlı çipin tekrar kullanılabilirliği 250 hücre/ml olarak bulundu. Hazırlanan çipin 5 döngü boyunca bağlanma kapasitelerinde bir değişiklik olmadı. Yapılan tez çalışması sonucunda geliştirilen QCM sistemi, SKBR3 meme kanseri hücrelerinde ekspresyonu artmış HER2 hedefli olsa da daha sonraki çalışmalarda diğer HER2 ekspresyonu artmış kanser tiplerinde de kullanılabilir bir QCM sensör sistemi geliştirilmesine katkı sağlayabilecek niteliktedir.
Gut hastalığı tedavisine yönelik medikal tekstil ürünü ve yara örtüsü geliştirilmesi
Bu çalışmada, gut hastalığının sebebi olan kandaki yüksek ürik asit konsantrasyonunun azaltılmasında kullanılabilecek nitelikte ürün/ürünler geliştirilmesi planlanmaktadır. Bu ürün/ürünler, sadece gut hastalığı değil, akut ürik asit nefropatisi, nefrolithiazis ve kronik ürat nefropatisi gibi kandaki ürik asit konsantrasyonunun yüksek olmasından kaynaklanan hastalıklarda da kullanılabilecek potansiyelde olacaktır. Gut hastalığında eklemlerde biriken ürik asit kristallerinin hastaya verdiği rahatsızlık ortadan kaldırılmaya çalışılmaktadır. Ürik asit kristallerinin birikmesinin sebebi ise hastalarda ürikaz enziminin aktivitesinin az veya hiç olmamasından kaynaklanmaktadır. Metabolizmada ürik asidin biyodönüşümü sağlanamadığı için kandaki ürik asit konsantrasyonu artmaktadır. Çözünürlüğü zaten düşük olan ürik asit seviyesi kanda arttıkça özellikle dolaşımın zayıf olduğu bölgelerde kristaller şeklinde birikmektedir. Hatta hastalığın ileri seviyelerinde özellikle eklem bölgelerinde kristallerin birikmesi nedeniyle yaralar oluşmakta ve yara üzerinden ürik asit kristalleri dahi görünmektedir. Bu durum sonucunda hasta büyük acılar çekmektedir. Çalışma kapsamından Nitrilaz enziminin mikrobiyal üretimi, üretimin optimizasyonu ve optimum koşullarda poliakrilonitril (PAN) kumaşın modifikasyonu; Ürikaz enziminin mikrobiyal üretimi, üretimin optimizasyonu ve saflaştırılması ve saflaştırılan ürikaz enziminin, modifiye edilen PAN kumaşa immobilizasyonu ve immobilizasyonun optimizasyonu ve ürikaz farklı destek materyallerine de immobilize edildi. Sonuç olarak, geliştirildi ürün/ürünler gut hastalığı tedavisinde kullanıma uygun olarak tasarlanacaktır. Böylece tedavide kullanılabilecek ve kandaki yüksek konsantrasyondaki ürik asit seviyesi azaltılacaktır. Dolayısıyla ürik asit kristalleri hastada bulunuyorsa kanda çözünmeye başlayacak ve kristallerde dokulardan uzaklaşacaktır. Anahtar Kelimeler: Gut hastalığı, Ürikaz, Nitrilaz, Poliakrilonitril kumaş.
Doğal koruyucu olarak siringomisin E kullanımıyla kuruyemişlerde aflatoksin üretiminin azaltılması
Hem dünyada hem de ülkemizde sağlıklı atıştırmalık olarak aklımıza ilk gelen gıdalar arasında olan kuruyemişler ülkemiz için önemli bir ekonomik kaynaktır. İhraç edilen kuruyemişlerde izin verilen maksimum aflatoksin miktarının aşılmaması için aflatoksinin izlenebilirliği önem taşımaktadır. Kuruyemişlerin uygunsuz hasat, depolama ve işleme koşullarının olması küflerin oluşmasına neden olur. Aspergillus flavus ve Aspergillus parasiticus başta olmak üzere çeşitli Aspergillus türleri tarafından aflatoksinler üretilmektedir. Pseudomonas spp. suşları mayalar ve insan patojenleri dahil olmak üzere geniş bir fungus çeşidine karşı fungisit özelliği göstermektedir. P. syringae pv. syringae tarafından üretilen siringomisin E antimikrobiyal peptidinin fungisit özelliğininolduğu görülmüştür. Böylelikle siringomisin E peptidi ile kuruyemişlerde oluşan aflatoksin oluşumunun önüne geçilmesi ön görülmektedir. Bu tez çalışması kapsamında Siringomisin E antimikrobiyal peptidinin sentezi için çeşitli optimizasyon parametreleri (üretim ortamı, azot kaynağı, azot kaynağı miktarı, karbon kaynağı, karbon kaynağı miktarı, inokülasyon yüzdesi, sıcaklık ve karıştırma hızı) incelenmiştir. Optimum koşullarda üretilen siringomisin E peptidi kolon kromatografisi ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile saflaştırılmıştır. Saflaştırılan siringomisin E kuru üzüme uygulanmıştır. Uygulama sonucunda siringomisin E peptidinin A. flavus'un üremesini engellediği dolayısıyla aflatoksin oluşumunu da önlediği görülmüştür. İşletmenin kendine özgü kuruyemişlerin depolanması, işleme prosedürü ve lojistiği gibi giderlerinin yanında aflatoksin analizinin de eklenmesi, gıda işletmesini ekonomik olarak zora sokmaktadır. Aflatoksin oluşumunun engellenmesi üreticinin marka değerini korumasını sağlarken ekonomik kaybı da önler. Hatta ürünün raf ömrünün uzamasından dolayı üreticinin kar marjı da yükselir. Tüketicinin ise kuruyemişi güvenle tüketirken hem sağlığı korunmuş olur hem de üreticiye güveni artar.
Karmustin yüklü katı lipid nanopartiküllerin hazırlanması, karakterizasyonu ve beyin kanseri hücre hattında in vitro etkinliğinin araştırılması
Dünya çapında meydana gelen ölümlerin ikincil sebebi olan kanser, hücrelerin bölünme yeteneklerinin farklılaşması ve çevre dokulara yayılma gibi özellikler ile karakterize edilen bir hastalıktır. Glioblastoma, merkezi sinir sistemi onkolojik hastalıkları arasında bulunmakta ve primer beyin tümörlerinin % 30' unu oluşturmaktadır. Yaygın olarak yetişkenlerde görülen, invaziv ve agresif özellikte bir beyin tümörüdür. Cerrahi müdahale, radyasyon ve kemoterapi tedavi seçenekleri arasındadır, ayrıca son yıllarda immunoterapi ile tedavi potansiyeli araştırılmaktadır. Kullanılan tedavi yöntemlerinin yan etkileri ve tedavi sonrası sağ kalım oranlarının düşük olması sebebiyle ilaç taşıyıcı sistemler gibi yeni tedavi seçeneklerinin kullanımına ihtiyaç duyulmuştur. Bu çalışmada glioblastoma tedavisinde kullanılan anti-kanser ajanı olan karmustini içeren katı lipid nanopartiküllerin sentezi ve karakterizasyonu yapılmış, oluşturulan sistemin in vitro etkinliği araştırılmıştır. Nanopartiküllerin kan-beyin bariyerinden geçişi için beyin endotel hücrelerinde bulunan MCT-1 reseptörüyle etkileşmeyi sağlayacak stearilamin/β-Hidroksi bütirat konjugatı sentezlenmiştir. Ayrıca nanoyapının sentezi sırasında kan-beyin bariyerini aşmada yardımcı olduğu bilinen Tween 80 ile katı lipid nanopartiküllerin yüzeyleri kaplanmıştır. Karmustin içeren katı lipid nanopartiküller için optimum ilaç miktarı 0,1 mg/ml olarak belirlenmiştir. Nanoyapıların boyutu zeta boyut ölçüm cihazı ve SEM analizi ile belirlenmiş ve zeta potansiyel analizi yapılmıştır. Karakterizasyonu yapılan katı lipid nanopartiküllerin U87-MG-luc hücreleri üzerindeki sitotoksisite denemeleri sonucunda 48. ve 72. saat IC50 değeri sırasıyla 353,4 and 442,3 µg/ml olarak tespit edilmiştir. Yapılan çalışmalar sonucunda karmustin içeren katı lipid nanopartiküllerin beyin kanseri hücre hattı üzerinde etkili sitotoksik potansiyele sahip olduğu düşünülmektedir.
Temozolomid içeren katı lipid nanopartikül hazırlanması, karakterizasyonu ve beyin kanseri hücre hattında etkinliğinin araştırılması
Merkezi sinir sisteminde beyin tümörleri arasında glioblastoma en sık karşılaşılan ve ölümcül olan kanser türüdür. Malignant glioblastomanın heterojen yapısı ve agresif özelliğine sahip olması hastalarda ortalama sağkalımı yaklaşık 15 ay gibi kısa bir süre belirlenmiştir. Bunun yanında hastalığın teşhisin zor olması, kemoterapötik ajanların kan beyin bariyerinden geçişi, ilaç dirençliliği gibi faktörler tedaviyi oldukça kısıtlamaktadır. Glioblastomada kullanılan tedavi yöntemlerinden cerrahi müdahale, radyasyon ve kemoterapi uzun süreli sağkalım oranın arttırılmasında etkili olmamıştır. Tüm bu sorunlara alternatif çözüm bulmak için araştırmacılar farklı tedavi yaklaşımlarını incelemektedir. Nanoteknoloji alanındaki gelişmelerin glioblastoma tedavisinde karşılaşılan zorluklara çözüm olabileceği öngörülmüştür. İlaç taşıyıcı sistemlerden lipid bazlı nanotaşıyıcıların sahip olduğu kan-beyin bariyerinden geçişi kolaylaştırma, hidrofobik ilaç çözünürlüğünü arttırma, yüzey modifikasyonuna olanak tedavi için önemli avantajlar sağlar. Bu çalışmada glioblastoma multiform tedavisinde temozolomid içeren katı lipid nanopartiküllerin sentezlenmesi, karakterizasyonu ve in-vitro etkinliğini araştırılmıştır. Sentezlenen nanoyapının kan-beyin bariyerinden geçişini sağlayabilmek için stearil amin ile konjugasyonu yapılması ve sentez aşamasında Tween 80 ile katı lipid nanopartiküllerin yüzeyi kaplanması amaçlanmıştır. Temozolomid içeren katı lipid nanopartiküller için optimum ilaç miktarı 0,1 mg/ml olarak belirlenmiştir. Nanoyapıların boyut analizi zeta boyut ölçümü ve SEM analizi ile belirlenmiş, ayrıca zeta potansiyel analizi yapılmıştır. Katı lipid nanopartiküllerin U87-MG-luc hücreleri üzerindeki sitotoksisite denemelerine göre 48. ve 72. saat IC50 değeri sırasıyla 430,8 ve 438,8 µg/mL olarak tespit edilmiştir. Yapılan çalışmalar sonucunda temozolomid içeren katı lipid nanopartiküllerin beyin kanseri hücre hattı üzerinde etkili sitotoksik potansiyele sahip olduğu düşünülmektedir.
Bazı nanoteknolojik immobilizasyon yöntemlerin katalaz enzimi aktivitesi üzerine etkisinin biyosensör yöntemi ile belirlenmesi
Bu tez çalışmasının amacı son zamanlarda birçok araştırmacının dikkatini çeken nanoteknolojik immobilizasyon yöntemlerinin katalaz enzimi üzerine etkisinin biyosensör yöntemi ile tespit edilmesini sağlamaktır. Bu nanoteknolojik metaryallerin biyosensör üzerine etkisini incelemek için iki farklı immobilizasyon yöntemi ile tasarlanan enzim temelli biyosensörler şunlardır: I. Au/3-MPA/EDC-NHS/Cys/AuNP/CAT/GA enzim biyosensörü II. GCE/MWCNT/MWCNT-CAT enzim biyosensörü Au/3-MPA/EDC-NHS/Cys/AuNP/CAT/Glutaraldehit enzim biyosensörün geliştirilmesi için altın elektrot yüzeyinde kendiliğinden oluşan tek tabaka oluşumu 3-MPA ile sağlandı. 3-MPA'nın karboksil gruplarını aktive etmek için EDC-NHS kullanıldı. Daha sonra elektrot sisteamin çözeltisine daldırılarak inkübe edildi. Elektrot yüzeyine AuNP ve katalaz eklenerek biyoaktif tabakanın oluşması sonrası glutaraldehit ile katalaz enzim molekülleri arasında çapraz bağlanma gerçekleştirildi. GCE/MWCNT/MWCNT-CAT enzim biyosensörünün tasarlanmasında DMF içinde süspanse edilen çok duvarlı karbon nanotüp (MWCNT) kullanılmıştır. Biyosensör hazırlanmasında ilk aşama DMF içinde süspanse edilen MWCNT elektrot yüzeyine damlatılarak elektrot iletkenliğinin arttırılması sağlandı. İkinci aşamada ise MWCNT ile katalazın 1:3 (v/v) oranında karıştırılmasıyla oluşturulan çözeltinin sonikasyonu sonrası elektrot yüzeyine damlatılmasıyla biyosensör tasarımı tamamlandı. İki farklı immobilizasyon metodu kullanılarak geliştirilen biyosensörler ile hidrojen peroksit ölçümleri, -0,2 V & +0,5 V potansiyelleri arasında diferansiyel puls voltametrisi (DPV) yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. Tasarlanan her iki biyosensör için ölçüm ortamında bulunan K3[Fe(CN)6]'ün -0,2 V & +0,5 V potansiyelleri arasında yükseltgenme piklerinde gözlenen değişimler ile hidrojen peroksit konsantrasyonu arasındaki doğrusal ilişkiden faydanılarak ölçümler alınmıştır. Tasarlanan enzim temelli biyosensörlerin çalışma koşullarının optimizasyonuna yönelik olarak sıcaklık, pH, iyon şiddeti ve farklı tamponlarda çalışmalar yapılmıştır. Tasarlanan enzim temelli biyosensörlerin karakterizasyonuna yönelik olarak yapılan çalışmalarda ise doğrusal tayin aralığının belirlenmesi, tekrarlanabilirlik ve sütte hidrojen peroksit tayini gibi parametreler belirlenmiştir. Deneysel çalışmalardan elde edilen sonuçlar incelendiğinde her iki immobilizasyon yöntemi ile geliştirilen enzim biyosensörleri için en iyi çalışma koşullarının 50 mM, pH: 7,0 potasyum fosfat tamponu ve 30ºC olduğu belirlenmiştir. Tasarlanan enzim temelli biyosensörler ile hidrojen peroksit için yapılan doğrusal tayin aralığı aynı olup 150 µM - 1000 µM arasında bulunmuştur. AuNP kullanılarak tasarlanan enzim biyosensörü için yapılan tekrarlanabilirlik çalışmalarında 600 µM hidrojen peroksit konsantrasyonunda (n=6) ortalama değer ( ) = 591.4 µM, standart sapma (S.S) = ± 6.54 µM ve % varyasyon katsayısı (% V.K) = 1.105 olarak bulunmuştur. MWCNT kullanılarak geliştirilen enzim temelli biyosensör için yapılan tekrarlanabilirlik denemelerinde 600 µM hidrojen peroksit konsantrasyonunda (n=6) ortalama değer ( ) = 596,3 µM, standart sapma (S.S) = ± 26.8 µM ve % varyasyon katsayısı (% V.K) = 4.5 olarak bulunmuştur. Bunların dışında enzim biyosensörleri ile süt örneklerinde hidrojen peroksit analizi de yapılmıştır. Anahtar sözcükler: Altın nanopartikül, çok duvarlı karbon nanotüp, hidrojen peroksit, 3-Merkaptopropiyonik asit, sisteamin, enzim temelli biyosensör
Nanoyapılı malzemelerin biyolojik moleküllerle entegrasyonu,karakterizasyonu ve uygulamaları
Nano boyutta yenilikçi biyomalzemelerin tasarlanması, özellikle biyouyumluluk ve biyobozunurluk gibi özelliklerin önem arz ettiği biyoteknolojik ve nanoteknolojik proseslerde en güncel araştırma konularından biridir. Diğer biyomalzemeler ile kıyaslandığında karbohidrat temelli polimer malzemeler; ulaşılabilirlik, maliyet ve fizikokimyasal özellikler açısından çok önemli avantajlar sağlar. Elektroeğirme tekniği, nano boyutlu karbohidrat temelli fiber sentezi için kolay ve gelecek vaad eden bir tekniktir. Bu çalışmada, selüloz türevi olan selüloz asetat (CA) polimeri kitosan (CS) polimeri ile karıştırılmış, elektroeğirme tekniği kullanılarak CA-CS nanofiberleri sentezlenmiştir. Nano boyutta, boncuk içermeyen CA-CS fiberlerin elde edilebilmesi için farklı çözgen sistemleri ve CA-CS oranları incelenmiş, işlem parametreleri optimize edilmiştir. Sentezlenen, CA-CS nanoliflerinin yüzey morfolojisini karakterize etmek için taramalı elektron mikroskobu kullanılmıştır. Daha sonra CA-CS nanofiberlerin, immobilizasyon materyali olarak uygunluğunun test edilmesi amacıyla; glukoz oksidaz enzimi CA-CS nanofiber kaplı GCE üzerine kovalent olarak immobilize edilmiş ve CA-CS/GOx biyosensörü hazırlanmıştır. İmmobilizasyonun başarısını kanıtlamak amacıyla CV, DPV, EIS teknikleri kullanılarak ölçümler alınmış ardından CA-CS/GOx biyosensörünün glukoza karşı cevabı amperometrik olarak incelenmiştir. CA-CS/GOx biyosensörlerinin dedeksiyon limiti ve glukoz doğrusal aralığı sırasıyla, 14 μM ve 5 µM-0,75 mM bulunmuştur. Son olarak CA-CS/GOx biyosensörünün gerçek örneklerde uygulanabilirliğinin araştırılması amacıyla, glukoz içeren sentetik örnekler ile ölçümler alınmıştır.
Bazı endemik bitkilerin antimikrobiyal ve antioksidan aktivitelerinin incelenmesi
Enfeksiyon hastalıkları, mikroorganizmaların insan vücuduna girerek çoğalması ve konak immün cevabı uyarması ile oluşmaktadır. Antibiyotiklerin keşfi ile enfeksiyon hastalıklarının görülme sıklığı azalırken mikroorganizmaların direnç geliştirmesiyle tekrar gündeme gelmiştir. Öyle ki Dünya Sağlık Örgütü (WHO), bazı patojen bakteriler için acil olarak yeni antibiyotik ihtiyacını duyurmuştur. Bu nedenle yeni antibiyotik ve alternatiflerin geliştirilmesi bir zorunluluk halini almıştır. Bitkilerde bulunan bazı fitokimyasalların antimikrobiyal aktivite gösterdiğinin anlaşılması ile çalışmalar bu yönde odaklanmıştır. Öte yandan yapılan son çalışmalarda, reaktif oksijen ve nitrojen kaynaklı oksidatif stresin; kanser, diyabet, katarakt, romatoid artrit ve yaşlanma gibi çeşitli inflamatuvar ve dejeneratif hastalıklarda rol oynadığı kanıtlanmıştır. Sentetik antioksidanlar, etkin, stabil ve ucuz olsa da bazı potansiyel yan etkileri mevcuttur. Bitkiler ise antioksidan özelliği bulunan birçok doğal fitokimyasal içermektedir. Bu amaçla birçok bitki ekstresi antimikrobiyal ve antioksidan aktivitesi yönünden araştırılmıştır. Bu çalışmada Kermes Meşesi (Quercus coccifera) (yaprak, dikenli kabuk ve tohum), Sütleğen (Euphorbia rigida) (yaprak), Kayışkıran (Onanis natrix) (yaprak ve çiçek), Karayemiş (Prunus laurocerasus L.) (yaprak ve meyve) ve Işkın (Rheum ribes) bitkilerinin Türkiye'de yetişen endemik türlerinin fenol, flavonoid içerikleri ile antimikrobiyal ve antioksidan aktivitelerinin belirlenmesi hedeflendi. Çalışma sonucunda, Kermes meşesi yaprak ve tohum ekstrelerinin antimikrobiyal aktivite gösterdiği, tüm bitki ekstrelerinin zengin fitokimyasal içerik ve yüksek antioksidan aktiviteye sahip olduğu belirlendi. Ancak bu bitkilerin tıbbi olarak kullanılabilmesi için etken bileşenlerin saflaştırılması veyapı tayini ile ileri düzey çalışmalarının yapılması gerekmektedir.
Cloning and characterization of L-glutamine amidohydrolase (EC 3.5.1.2; glutaminase)
In this thesis we have successfully cloned L-glutaminase from Bacillus subtilis 168 genome and expressed in E.coli. Glutaminase is an important therapeutic enzyme that is used widely in many disciplines, ranging from flavor enhancement in food, manufacture of fine chemicals, analytic purposes, antitumor qualities in medicine, and more. Glutamianse holds great potential for future use as anti-cancer agent and research is being done for its successful employment in that field. Glutaminase has been purified and characterized in many living organisms but reports on its cloning are scarce which has prompted this research.
Biyolojik önemi olan küçük nükleotidlerin yapısal ve elektronik özelliklerinin moleküler modelleme yoluyla incelenmesi
Ökaryotik canlılarda genetik bilginin aktarımı ve genin ifade edilmesi deoksiribonükleik asitin (DNA) ribonükleik asite (RNA) transkripe edilmesini takiben proteine çevrilmesi şeklinde gerçekleşmektedir. Bununla birlikte, genin transkripsiyonunda görev alan enzimler, RNA polimerleşmesini başlatabilmeleri için DNA dizisi içerisinde bulunan promotör bölge olarak bilinen kısa DNA dizilerine bağlanma gereksinimi duymaktadır. Bu çalışmada, biyolojik olarak belirli işlevleri belirlenmiş olan nükleotid (öncelikli olarak mono-tetramer) yapıları belirlenerek, bu yapıların üç boyutlu modellerinin oluşturulması ile yapısal ve elektronik özelliklerinin moleküler modelleme ile araştırılması amaçlanmıştır. Bunun için, TATA-kutusu dizine ait mono, di, tri ve tetramer yapılarına ait konfomerlerin yapı analizi Spartan'14 programı ile bulundu. Bulunan konfomer yapılarının optimizasyon ve frekans hesaplamaları sulu ortamda, MOPAC2016 programı PM6-D3H4 yöntemi ve Gaussian09 programı ωB97XD/6-311++G(d,p) yöntemi ile hesaplandı. Hesaplama sonrasında rölatif enerji değerleri hesaplanarak, moleküler yapıların gösterimi Discovery Studio Visualizer 2019 programı ile yapıldı. Sonuç olarak, nükleotid yapılarının riboz halkasına bağlı –OH grubu ile -PO43- grupları arasında –H bağının oluştuğu bulundu. Buna ek olarak, tetranükleotid yapılarının nükleobazlarının eşleniklerinin (A=T) ve non-kovalent etkileşim olarak CH−π bağının oluştuğu gözlendi.
Nörodejeneratif hastalıkların tedavisinde kullanılmak üzere biyomalzeme temelli kontrollü salım sistemlerinin geliştirilmesi
Bu tez çalışmasında, Alzheimer hastalığının semptomatik tedavisinde kullanılan FDA (U.S. Food and Drug Administration) tarafından onaylı bir asetilkolinesteraz inhibitörü Galantamin hidrobromür (GAL) etken maddesinin kontrollü salımı için mini emülsiyon polimerizasyon yöntemi ile p(HEMA-MAPA) nanopolimerleri sentezlenmiştir. Sentezlenen nanopolimerlerin morfolojik özelliklerini ve yüzeydeki elementlerin miktarını belirlemek için SEM-EDS analizi yapıldı. Kimyasal yapılarının tespit edilmesi için FTIR analizi yapıldı ve partikül boyutu Zeta-Sizer cihazı ile belirlendi. SEM analizi sonucunda nanopolimerlerin yüzey morfolojisinin küresel olduğu görülmüş, Zeta-sizer analizine göre ortalama partikül boyutunun 113,3 nm olduğu bulunmuştur. Nanopolimerlerin spesifik yüzey alanı ise 844,38 m2/g olarak hesaplanmıştır. GAL'in nanopolimerlere optimum adsorpsiyon koşulları altında maksimum adsorpsiyon miktarının 1:39 polimer-ilaç oranında, 25 ̊C'de, 120 dakika temas süresinde, pH 5,5'te, 250 μg/mL GAL konsantrasyonunda 109,29 mg/g olduğu bulunmuştur. GAL'in p(HEMA-MAPA) ile adsorpsiyonunun Langmuir izotermi ile uyumlu olduğu bulunmuştur. Optimum koşullarda nanopolimere yüklenen GAL'in in vitro kontrollü salım çalışmaları için pH ve sıcaklık denemeleri ise diyaliz yöntemi ile yapılmıştır. Anahtar sözcükler: Alzheimer Hastalığı, Asetilkolinesteraz inhibitörü, Nanopolimer, Galantamin hidrobromür, Kontrollü Salım Sistemleri, Mini emülsiyon polimerizasyonu
Üçlü-faz ayırma tekniği ile saflaştırılan selülazın enkapsülasyonu, karakterizasyonu ve ın vitro kullanılabilirliği
Bu tez çalışmasında, ticari arenada sıklıkla kullanılan Trichoderma reesei selülazının üçlü-faz ayırma (TPP) metodu ile saflaştırılması ve kalsiyum aljinat jelde enkapsülasyonu çalışılmıştır. Bu iki temel deneme tüm değişkenleriyle optimize edilmiş ve sonuçta hem saflaştırma hem de enkapsülasyon çalışmaları için optimum koşullar belirlenmiştir. T. reesei selülazının saflaştırılmasında ideal TPP koşulu; %50 (w/v) amonyum sülfat doygunluğu, 1:1 (v/v) enzim: t-bütanol oranı, pH 4,5 ve 0,1 mg protein olarak belirlenmiştir. Optimum koşullarda selülaz enzimi, %113 aktivite verimi ve 1,42 saflaştırma katı ile başarı ile saflaştırılabilmiştir. Enkapsülasyon çalışmaları neticesinde ise ticari selülaz enziminin immobilizasyonu için optimum koşullar; 0,5 mg enzim (protein miktarı) ve %2 (w/v) aljinat, %0,5 (w/v) kitosan içeren 0,15 M CaCl₂, 3 saat immobilizasyon, %2,0 (v/v) glutaraldehit ile 2 saat çapraz bağlama olarak belirlenmiştir. Bu optimum koşullarda Selülaz enzimi %53 aktivite verimi ile başarı ile immobilize edilmiştir. TPP orta fazında deriştirilen selülaz enzimi ise belirlenen optimum koşullarda %10 aktivite verimi ile immobilize edilebilmiştir.
A-Galaktozidaz yüklü mikropartiküller: sentez, karakterizasyon ve In vitro salım çalışmaları
Enzimler uzun zamandır çeşitli endüstriyel sektörlerde kullanılmaktadır. Biyorafineride yenilenebilir malzemeleri kullanmak üzere son yıllarda artan ihtiyaç ve ilgi, enzimlerin endüstriyel uygulamasına daha fazla dikkat çekmiştir. α-Galaktozidaz (α-D-galaktozid galaktohidrolaz, EC 3.2.1.22), hem basit hem de kompleks oligosakkaritlerin terminal α-galaktozil kısımlarının hidrolizini katalize eden glikozid hidrolaz enzim grubudur. α-Galaktozidazlar doğada yaygın halde bulunur. Enzimlerin immobilizasyonu, temel olarak enzim maliyetlerinin işlem ekonomisi üzerindeki payını en aza indirmek amacıyla, enzimin birçok kez tekrar kullanılmasını mümkün kılan yaygın bir uygulamadır. İmmobilize edilmiş bir enzimin kullanımı ayrıca genellikle alt akım işlemini kolaylaştırır, çünkü ortamdan kolayca uzaklaştırılabilir. Enzimler ve destek taşıyıcıları arasındaki etkileşim düşünüldüğünde, enzim immobilizasyon yöntemleri fiziksel yöntemler ve kimyasal yöntemler olarak sınıflandırılabilir. Adsorpsiyon ve tutuklama, enzimler ve destek taşıyıcıları arasında kovalent etkileşimlerin olmadığı fiziksel yöntemlere dahil edilirken, kovalent bağlanma ve çapraz bağlanma kimyasal yöntemlere aittir. Bu projede, mısır unundan izole edilen ve gradient amonyum sülfat çöktürmesi ile kısmi olarak saflaştırılan -galaktozidaz enzimi tutuklama yöntemi ile kalsiyum aljinat-kitosan mikropartiküllerde immobilize edildi. Bu amaçla, mikropartiküllerin sentezi, karakterizasyonu ve son aşamada da in vitro ortamda salım çalışmaları gerçekleştirildi. İmmobilize enzim preparatının hazırlanması için belirlenen optimum koşullar; 0.1 mg protein, % 3 (w/v) aljinat, 0.15 M CaCl2, % 0.5 (w/v) kitosan, 1 saat çalkalama, %0.05 (v/v) glutaraldehit ve 1 saat inkübasyon olarak belirlenmiştir. Optimize edilen koşullarda hazırlanan immobilize ve serbest α-galaktozidaz enzimlerinin karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır. Serbest ve immobilize enzim için optimum sıcaklık 40°C olarak belirlenmiştir. Termal kararlılık denemesinde serbest enzim 60°C, immobilize enzim ise 70°C sıcaklıkta hala aktivitesinin %50' sini korumuştur. Optimum pH değeri serbest ve immobilize enzimler için sırasıyla pH 4.5 ve 5.5 olarak bulunmuştur. Serbest enzim pH 3.0 – 6.5 aralığında aktivitesinin %80'inden fazlasını korurken, immobilize enzim pH 4.5 – 6.0 arasında aktivitesinin %70' den fazlasını korumuştur. Tekrar kullanılabilirlik denemesinde immobilize enzim 2 kere kullanılabilmiştir. İmmobilize enzim için in vitro ortamda salım çalışması yapılmıştır.
Biyoaktif peptid içeren polimerik nanopartiküllerin sentezi, karakterizasyonu ve nanokozmetik bir ürün olarak potansiyelinin incelenmesi
Bu tez çalışmasında, botulinum toksininin etki mekanizmasını taklit eden asetil oktapeptid-3'ün kontrollü salımı ve nanokozmetik bir ürün olarak potansiyelinin incelenmesi için sürfaktansız emilsiyon polimerizasyon yöntemi ile p(HEMA-MAGA) nanopartiküller sentezlendi. Sentezlenen nanopartiküllerin morfolojik özelliklerini belirlemek için SEM ve AFM görüntüleri elde edildi. Kimyasal yapılarının belirlenmesinde FT-IR yöntemi kullanıldı ve Zeta-Sizer cihazı ile boyutları belirlendi. SEM ve AFM analiz sonuçlarına göre sentezlenen polimerik nanopartiküllerin homojen bir dağılım gösterdikleri ve küresel yapıda oldukları anlaşılmaktadır. Zeta-size analizlerine göre ortalama 340,5 nm boyutunda olan nanopartiküllerin spesifik yüzey alanları 350 m2/g olarak hesaplanmıştır. Asetil oktapeptid-3'ün nanopartiküllere adsorpsiyon koşullarını optimize etmek için zaman, pH, iyon şiddeti, sıcaklık ve konsantrasyon denemeleri gerçekleştirildi. Maksimum adsorpsiyon miktarı 60 dakikada, pH 4,2'te, 0,1 M iyonşiddetinde (NaCI), 1,5 mg/mL konsatrasyonunda 15˚C'de 220,69 mg/g olarak belirlenmiştir. Optimum koşullarda asetil oktapeptid-3 bağlanan nanopartiküllerin salım koşullarının incelenmesi için pH ve sıcaklık denemeleri yapılmıştır. Alamar Blue metodu kullanılarak üretilen nanokozmetik ürünün, toksik potansiyeli araştırılmıştır. Geliştirilen nanomalzemenin non-toksik ve aynı zamanda botulinum nörotoksinine alternatif ve gelecek vaadeden nanokozmetik bir ürün olduğu düşünülmektedir. Anahtar sözcükler: Nanokozmetik, Asetil Octapeptid-3, Botulinum Nörotoksini, Biyoaktif Peptid, Polimerik Nanopartiküller, Kontrollü Salım Sistemleri
Organik çözgene dayanıklı bakteri temelli mikrobiyal biyosensör ve moleküler damgalanmış polimer tabanlı biyosensör sistemleri geliştirilmesi, karakterizasyonu ve bazı steroidlerin tayininde kullanılması
Steroidlerin tayini genel olarak immunoassay yöntemler ve kromatografik yöntemlerle yapılmaktadır. Söz konusu yöntemler zaman alıcı ön işlemler ve pahalı ekipmanlar içerir. Ancak mikrobiyal biyosensörler ve moleküler damgalanmış polimer (MIP) tabanlı elektrokimyasal sensörlerin kullanılmasıyla hızlı, duyarlı, ucuz ve seçimli steroid tayini yapılabilir. Bu tez çalışmasında kortizol-kortizon ve prednisolona yönelik MIP sensörleri, kolesterole yönelik ise mikrobiyal biyosensör sistemi geliştirilmiştir. MIP sensörleri altın nanopartikül kaplanmış grafit elektrot yüzeyinde pirolün kalıp molekül varlığında elektropolimerizasyonu yöntemi ile hazırlanmıştır. Sensör cevapları Diferansiyel Puls (DP) yöntemi ile Ferri/Ferro çözeltisinden izlenmiştir. Kortizon-kortizol ve prednisolona yönelik geliştirilen MIP sensörlerinde kalıp molekül/monomer oranı, inkübasyon ve ekstraksiyon süresi optimizasyonları yapılmıştır. Kortizon-MIP sensörünün doğrusal tayin aralığı 1-100 M, tayin limiti 0,25 M olarak bulunurken Prednisolon-MIP sensörünün doğrusal tayin aralığı 1-75 M, tayin limiti ise 0,35 M olarak bulunmuştur. Tekrarlanabilirlik denemesinde Kortizon-MIP sensörünün 50 M kortizon için (n=10) ortalama (¯x), standart sapma (±S.S.) ve % varyasyon katsayısı (%VK) değerleri sırasıyla 48,10 M, ±2,42M ve %5,04 olarak bulunurken, 50 M prednisolon için (n=10) ortalama (¯x), standart sapma ve % Varyasyon katsayısı değerleri sırasıyla 48,69 M, ±1,06 M ve %2,19 olarak bulunmuştur. MIP sensörleri ile substrat spesifikliği, girişim etkisi ve depo kararlılığı denemeleri yapılmıştır. Ayrıca geliştirilen MIP sensörleri ile liyofilize idrar ve serum örneklerinde kortizol ve prednisolon tayini yapılmıştır. Mikrobiyal biyosensör geliştirilmesi aşaması kapsamında biyoalgılayıcı olarak kolesterol metabolizması indüklenmiş ve organik çözgene dayanıklı Pseudomonas sp. türü bakteriler ve katalaz enzimi kullanılmıştır. Pseudomonas sp. ve katalaz enzimi çok duvarlı karbon nanotüp (MWCNT)/iyonik sıvı (IL)/karbon pasta elektrot (CPE) içerisine immobilize edilmiştir. Biyosensörün immobilizasyon aşamaları CV ve impedans spektroskopisi ile karakterize edilmiştir. Ölçümlerde mediyatör sistemi olarak hidrokinon kullanılmıştır. Amperometrik çalışma potansiyeli -0,2 V olarak bulunmuştur. Optimizasyon ve karakterizasyon çalışmaları amperometrik yöntem ile yapılmıştır. Mikrobiyal biyosensörün çalışma koşullarının optimizasyonu denemeleri yapılmış ve optimum sıcaklık 35 °C, optimum pH : 7,0 (Fosfat tamponu, 50 mM) olarak bulunmuştur. Bakteri miktarının biyosensör cevabı üzerine etkisi incelenmiştir. Kolesterol tayinine yönelik olarak geliştirilen bu mikrobiyal biyosensörün doğrusal tayin aralığı 5-600 M tayin limiti ise 1,52 M olarak bulunmuştur. Substrat spesifikliği ve girişim etkisi denemelerinde kortizon, kortizol, testosteron, β-sitosterol ve östradiol gibi steroid bileşiklerle glukoz, askorbik asit gibi endojen analitlerin varlığının biyosensör cevabına etkisi incelenmiştir. Optimizasyon ve karakterizasyon çalışmaları tamamlanan mikrobiyal biyosensörün doygun siklohegzandaki kolesterol cevabı incelenmiş ve sulu ortamla karşılaştırılmıştır. Geliştirilen mikrobiyal biyosensörle liyofilize serum örneklerinde hem sulu fazda hem de siklohegzan fazında kolesterol tayini yapılmıştır.
Ditiyol/altın nanopartikül/3-merkapto propiyonik asit modifikasyonuna dayalı gliserol-3-fosfatın spesifik ve duyarlı tayinine yönelik yeni biyosensör sistemleri geliştirilmesi
Bu tez kapsamında, Gliserol-3-fosfat tayini için biyosensör teknolojisine yeni ve orijinal bir bakış açısı getirecek olan 1,4-bütanditiyol/Altın Nanopartikül/3-Merkapto propiyonik asit modifiye gliserol-3-fosfat oksidaz biyosensör sistemi ile yeni ve orjinal bir biyosensör tasarımı geliştirilmiştir. Biyosensör tasarımında öncelikle altın elektrot yüzeyinde; 1,4-bütanditiyol kullanılarak kendiliğinden oluşan tek tabaka oluşumu gerçekleştirilmiştir. 1,4-bütanditiyol modifiye edilmiş altın elektrot üzeri altın nanopartikül ile kaplanmış ve elde edilen bu yüzey ise 3-merkapto propropiyonik asit ile muamelenin ardından gliserol-3-fosfat oksidaz enzimi elektrot yüzeyine immobilize edildi.Tasarlanan enzim biyosensör sistemi ile gliserol-3-fosfat ölçümleri, -0,1 V & +0,6 V arasında diferansiyel puls voltametrisi yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. Ölçüm ortamında bulunan K3[Fe(CN)6]'ün belirlenen potansiyel aralığındaki yükseltgenme piklerinde meydana gelene değişimler ile gliserol-3-fosfat konsantrasyonu arasındaki doğrusal ilişkiden yararlanılarak ölçümler gerçekleştirilmiştir.
Ferritin tayinine yönelik elektrokimyasal impedans spektroskopisi esaslı immunosensör geliştirilmesi
Ferritin dünyada insan popülâsyonunda çok yaygın bir şekilde görülen demir eksikliği anemisinin en önemli belirteçlerinden biridir. Bunun yanı sıra bir akut faz reaktanı olarak pek çok enflamasyon durumunda ve bazı durumlarda da bir tümör marker olarak tayini önem taşımaktadır. Bu önemli nedenlerden dolayı proje kapsamında ferritin tayinine yönelik yeni bir impedimetrik immünosensör geliştirildi. Temel prensip olarak antijen – antikor etkileşimine dayalı afinite temelli bir biyosensör sistemi geliştirildi ve sensör yüzeyinde meydana gelen değişimler elektrokimyasal impedans spektroskopisi ile izlendi. Söz konusu değişimlerden yola çıkılarak ferritin tayini gerçekleştirildi. Antijen – antikor etkileşimi anti ferritin antikoru ile ferritin biyomolekülleri arasında gerçekleştirildi. İmmünosensör sisteminin hassasiyeti, kullanılan sensör yüzeylerinin çeşitli yöntemlerle modifikasyonları neticesinde arttırıldı. Anti ferritin antikorları altın elektrot yüzeyine 11 – merkaptoundekanoik asit (11 – MUA) ile oluşturulan kendiliğinden oluşan tek tabaka (SAM) üzerinden kovalent bağlarla immobilize edildi. Ferritin antijenleri, yüzeye immobilize edilen antikorlarla etkileşimleri sonucunda elektrokimyasal impedans spektroskopisi (EİS) sistemi ile tayin edildi. Geliştirilen biyosensör sistemi 2,5 – 400 pg/mL ferritin konsantrasyonlarında doğrusal tayin aralığına sahiptir. Biyosensörün tekrar üretilebilirlik ve tekrarlanabilirlik sonuçları ise oldukça tutarlıdır.
Doksorubisin yüklü hyaluronik asit nanopartiküllerin sentezi karakterizasyonu ve farklı kanser türlerinde uygulanabilirliğinin ın vıtro araştırılması
Kanser, Dünya Sağlık Örgütü'nün verilerine göre dünyada çapındaki ölümlerin ikinci sebebidir. Günümüzde kanser tedavisine yönelik çeşitli terapi stratejileri geliştirilmektedir. Yaygın olarak kullanılan tedavi yöntemlerinin neden olduğu yan etkiler ve kısıtlamalar yeni tedavi yöntemlerin geliştirilmesine öncülük etmektedir ki bu amaçla ilaç taşıyıcı sistemlere ihtiyaç duyulmaktadır. Bu çalışmada ilaç taşıyıcı sistem olarak hyaluronik asit nanopartiküllerin sentezi ve karakterizasyonu gerçekleştirilmiş olup, antikanser özellik göstermesi amacıyla bu nanopartiküllere doksorubisin yüklenerek farklı kanser hücre hatlarında sitotoksik etkisi incelenmiştir. Yalnızca hyaluronik asit kullanılarak oluşturulan nanopartiküller yeterli verimde, yeterince hızlı ve kolay üretilemediği için kitosan ile modifiye edilerek hyaluronik asit nanopartiküller hızlı ve başarılı bir şekilde oluşturuldu. Oluşturulan nanopartiküller için optimum hyaluronik asit konsantrasyonu 0.01 mg/mL, optimum ilaç yükleme pH'ı 8 ve konsantrasyonu 1.5 mg/ml olarak belirlendi. SKOV-3 ve A549-Luc hücre hatları için nanopartiküler sistemin IC50 değeri sırasıyla 48 ve 72 saat için 0,002 +/- 0,00265 mikrogram/ml ve 0,00078 +/- 0,00066 mikrogram/ml ve 0,84 +/- 0,69 mikrogram/ml ve 0,29 +/- 0,066 mikrogram/ml olarak tespit edildi. Sonuç olarak, hyaluronik asit nanopartiküllerin farklı kanser hücre hatlarında doksorubisin taşıyıcısı olarak potansiyele sahip olduğu düşünülmektedir.
Bazı bitkilerde hiperglisemi ve diyabetik komplikasyonların engellenmesinde etkin olabilecek fenolik yapıda bileşiklerin incelenmesi ve karakterizasyonu
Diyabet, hiperglisemi ve insulin dirençliliği ile karakterize edilen multifaktöriyel, kronik bir metabolizma hastalığıdır. Her geçen gün dünya popülasyonunda hastalığa maruz kalan kişilerin artması ile gerek hastalığın oluşumunun engellenmesi gerekse yeni tedavilerin geliştirilmesi bir zorunluluk halini almıştır. Son yıllarda birçok doğal kaynaktan diyabet tedavisinde kullanılabilecek ve farklı mekanizmalar üzerinden etkin olabilecek bileşiklerin incelenmesine ilgi artmıştır. Doğal kaynaklardan elde edilen tedavi edici etkiye sahip bileşikler sentetik orijinli olanlara oranla düşük toksisite, fizyolojik koşullarda yüksek kararlılık ve yeni ilaçların dizaynı için çeşitli kimyasal yapıları içermeleri açısından avantajlıdırlar. Bu amaçla birçok bitki ekstresi gerek fitokimyasal gerekse biyolojik etkinlikleri açısından araştırılmış olup bitkisel kaynaklarda yapılan çalışmalarda benzeri etkileri gösteren polifenolik bileşiklerin ağırlıkta olduğu çok sayıda çalışma mevcuttur. Fenolik bileşikler çok etkin olmakla birlikte kullanım dozları ayarlanmadığında veya ekste olarak alındıklarında bazı sağlık problemlerine neden olduklarından dolayı tartışılmaktadırlar. Bu çalışma kapsamında Hibiscus sabdariffa L. (Hibiskus), Hypericum sp. (Sarı kantaron), Calendula sp. (Aynı sefa) ve Prunus laurocerasus L. (Karayemiş) ekstrelerinin fitokimyasal testleri, fenolik bileşik içeriklerinin belirlenmesi, antioksidan etkinliği ve diyabet ile ilgili çeşitli biyolojik etkinliklerinin incelenmesi ve karakterizasyonu hedeflendi. Tüm bitki ekstrelerinin fenolik bileşiklerce zengin olduğu gözlendi. Hibiskus ekstrelerinde antioksidan etkinlik, lipoksigenaz ve α-amilaz inhibisyonu; Sarı kantaron ekstrelerinde antioksidan ve deglikasyon etkinlik, α-glukozidaz ve dipeptidil peptidaz 4 inhibisyonu; Aynı sefa ekstrelerinde antioksidan ve metal şelatlama etkinliği; Karayemiş esktrelerinde ise antioksidan, metal şelatlama ve deglikasyon etkinlik, α-glukozidaz, α –amilaz ve dipeptidil peptidaz 4 inhibisyonu gözlendi. Sonuç olarak her bitki ekstresinde, diyabet ve komplikasyonları ile ilişkili birden fazla biyolojik etkinlik gözlenmesi nedeni ile diyabet ve komplikasyonlarının önlenmesinde potansiyel ilaç etken maddeleri için kaynak olabilecekleri ancak bu amaca yönelik olarak etken madde saflaştırılması ve yapı tayini, in vitro ve in vivo kinetik çalışmalar vb. ileri düzeyde çalışmalarının yapılmasının gerekli olduğu açıktır.
Streptococcus pyogenes virulans proteazina spesifik DNA aptamerlerinin geliştirilmesi
Yanlış veya gereksiz antibiyotik kullanımı nedeni ile antibiyotik dirençliliği kazanmış patojen bakteriler tüm dünya için bir tehdit oluşturmaktadır. S. pyogenes, penisiline duyarlıdır ve günümüzde S. pyogenes enfeksiyonlarının tedavisinde ilk aşamada kullanılmaktadır. Penisiline direnç rapor edilmemiştir, ancak penisilin alerjisi olan kişilerde kullanılan makrolid antibiyotiklere dirençli izolatların sayısı giderek artmaktadır. Bu sorunun çözümü için potansiyel ilaç moleküllerinin elde edilmesi amacı ile S. pyogenes'in virulans mekanizmasında rol oynayan SpyCEP enzimi hedef olarak seçildi. DNA aptamerlerinin geliştirilmesi amacı ile SELEX yöntemi kullanılarak SpyCEP enzimine bağlanan ve inhibe eden DNA aptamerleri geliştirildi.
Terapötik biyomoleküllerin farklı hidrojellere enkapsülasyonu ve medikal kullanımının araştırılması
Hidrojeller, kimyasal ya da fiziksel bağ oluşturarak su ya da biyolojik sıvılarda çözünmeyen hidrofilik polimerlerdir. Doğal ya da sentetik monomerlerden hazırlanan bu yapılar biyouyumlu, biyodegrade olabilme, istenilen boyutta ve partikül çapında oluşturulabilme, şişme, hapsedilen biyomolekülü zamanla kontrollü dışarı verebilme özellikleri sayesinde son yılların gözde terapötik biyomateryalleri olmuştur. Ayrıca sıcaklık, pH, kimyasallar, ışık, elektrik alan gibi çevrelerinden gelen dış uyarılara cevap verebilecek şekilde tasarlandığında akıllı polimer olarak adlandırılırlar ve bu uyarılara bağlı salınım yapabilmeleri de birçok farklı biyomolekül, ilaç ve enzim çalışmalarında kullanılabilirliklerini artırmıştır. Bu çalışmada farklı polisakkarit tabanlı, biyouyumlu (akrilamid, kitosan, chia tohumu) hidrojeller hazırlanarak insülinin oral kullanımı için uygulanabilirlikleri test edildi. Akrilamid tabanlı hidrojel CMC ile modifiye edilerek biyouyumlu hale getirildi. Kitosanın çapraz bağlayıcı olarak kullanıldığı akrilamid tabanlı ikinci bir hidrojel de sentezlendi. Yaygın kullanılan oral terapötik kitosan hidrojelinde çapraz bağlayıcı olarak glutaraldehidten faydalanıldı. Chia tohumu ile daha önce denenmemiş terapötik hidrojel hazırlanması da tez kapsamında yapılan çalışmalardandır. Hazırlanan hidrojellerin glukoz düşürme etkinliği in vitro olarak test edildi.
Farklı kaynaklardan enzimatik hidroliz yoluyla biyoaktif peptid eldesi ve biyolojik etkinliklerinin incelenmesi
Biyoaktif peptidler canlıların vücut fonksiyonlarına ve sağlığına olumlu etkileri bulunan spesifik protein fragmentleridir. Ağız yolu ile alındıklarında aminoasit sekansına bağlı olarak kardiovasküler, sindirim, immun ve sinir sistemi gibi başlıca vücut sistemlerine yönelik tedavi edici etkileri bulunmaktadır. Biyoaktif peptidler bitkisel, hayvansal, fungal, bakteriyel ve venom kaynaklı olabilmektedir. Hedeflenen biyolojik kaynaktan elde edilecek olan biyoaktif peptidler endojen ya da eksojen peptidler olarak değerlendirilebilmektedir. Biyoaktif peptid eldesinde izlenecek yöntem peptidin endojen veya eksojen olmasına göre değişmektedir. Endojen biyoaktif peptidler çeşitli ekstraksiyon yöntemleri ile elde edilebilirken ekzojen biyoaktif peptidler proteinlerin in vitro koşullarda proteazlar ile hidrolizi sonucu biyolojik aktiviteye sahip peptid fragmentlerinin oluşturulmasını temel alır. Yapılan araştırmalarda; farklı protein kaynaklarından antihipertensif, antioksidatif, antitrombotik, antimikrobiyal, antikanser ve immünomodülatör etkili birçok biyoaktif peptid elde edilmiştir. Üretilen biyoaktif peptidler sentetik ilaç katkı maddelerine alternatif, doğal ve tedavi edici özellikte bileşenler olması nedeniyle aktivitelerine bağlı olarak çeşitli ilaçların geliştirilmesinde kullanılabilmektedir. Biyoaktif peptidlere yönelik yapılan araştırmalarda protein kaynağı olarak farklı biyolojik materyaller kullanılabilmektedir. Ülkemizdeki biyolojik kaynakların en verimli şekilde kullanılması ışığında ülkemizin ekonomik gelişimine katkı sağlanması, gıda ve farmakoloji uygulamalarında kullanılabilecek tedavi edici bileşenlerin elde edilmesi amacı ile farklı protein kaynakları (arı larvası vb.) kullanılarak enzimatik hidroliz yöntemi ile peptid eldesi ve elde edilen peptidlerin biyolojik aktivitelerinin araştırılması bu tez önerisinde amaçlandı. Bu bağlamda çalışmada halk arasında inflamasyon, bağışıklık sisitemi hastalıkları, kanser vb. birçok hastalıkta tedavi ve koruyucu etkisi olduğu bilinen bal arısı (Apis Mellifera) larvası kaynak olarak seçildi. Arı larvası peptid hidrolizatlarının elde edilmesinde homojenize edilen larvaların tripsin ve nötraz enzimleri ile hidroliz etkinliği belirlendi. Bu amaçla öncelikle farklı E/S oranları ve hidroliz süreleri denenerek optimizasyon çalışmaları gerçekleştirildi. İleri aşamada elde edilen peptid hidrolizatlarının DPP4, α-glukozidaz, ACE enzimleri inhibisyonu, metal şelatlama ve antioksidan etkinlikleri araştırıldı. Bu çalışma sonucunda arı larvası peptid hidrolizatlarının potansiyel biyolojik etkilerinin bulunması ile ileriye yönelik medikal araştırma çalışmalarına katkıda bulunulacağı düşünüldü.
L-askorbik asit(c vitamini) tayinine yönelik olarak kalem grafit elektrot-askorbat oksidaz temelli yeni bir biyosensör geliştirilmesi
Bu tezde, biyosensör teknolojisi için yeni ve özgün bir bakış açısı getirmek amacıyla KGE kullanılarak L-askorbik asit tayin için yeni bir biyosensör geliştirilmiştir. Askorbat oksidaz enzimi jelatin ve glutaraldehid kullanılarak çapraz bağlanmış, kalem grafit elektrot yüzeyinde sabitlenmiştir ve tasarlanan biyosensör L-askorbik asit tayini için kullanılmıştır. Geliştirilen biyosensör ile L-askorbik asit ölçümleri -0.7 V'ta amperometrik yöntem ile yapılmıştır. Ölçümler amperometrik yöntem kullanılarak tüketilen oksijen konsantrasyonu ile orantılı akım değerlerindeki azalmanın belirlenmesi ile gerçekleştirilmiştir. Hazırlanan biyosensörün optimizasyon çalışmalarında öncelikle optimum enzim konsantrasyonunun, optimum jelatin miktarının, optimum glutaraldehitte bekletme süresinin ve glutaraldehit tabakalandırma işleminin gereken tekrarının belirlenmesi gibi parametreler araştırılmıştır. Çalışma koşullarının optimizasyonunda; pH'ın, sıcaklığın ve tampon konsantrasyonun optimizasyonları gerçekleştirilmiştir. Daha sonra karakterizasyon çalışmaları içinde doğrusal tayin aralığı, tekrarlanabilirlik, yeniden üretilebilirlik, substrat spesifikliği, depo kararlılığı ve örnek analizi gibi bazı parametreler incelenmiştir. Optimizasyon çalışmalarından KGE/jelatin-askorbat oksidaz/glutaraldehit modifiye biyosensör için askorbat oksidaz konsantrasyonu, jelatin miktarı, glutaraldehitte bekletme süresi ve glutaraldehit tabakalandırma sayısı sırasıyla 1,5 U/mL, 0,1 mg/mL , 3 dakika ve 3 kez tabakalandırma olarak tespit edilmiştir. Potasyum fosfat tamponu (50 mM, pH: 7,0) ve 30°C sıcaklığın optimum çalışma koşullarını sağladığı belirlenmiştir. KGE/jelatin-askorbat oksidaz/glutaraldehit modifiye biyosensör ile karakterizasyon çalışmalarında L-askorbik asit için 25µM - 500µM doğrusal tayin aralığı bulunmuştur. Tekrarlanabilirlik sonuçlarına ilişkin olarak standart sapma (S.S) = ±1,46 µM ve % varyasyon katsayısı (V.K) = % 0,44 olarak belirlenmiştir. Depolama kararlılığına ilişkin denemeler sonucunda 30 günün sonunda %75'lik aktivitenin korunduğu tespit edilmiştir.
Kanser tedavisinde kullanılan ilaçların biyomoleküller ile etkileşiminin moleküler modelleme yolu ile incelenmesi
Anti-tümör aktivitesi olan antrasiklin antibiyotik doksorubisin ve glikopeptid antibiyotik bleomisin, sırasıyla Streptomyces peucetius ve Streptomyces verticillus bakterileri tarafından üretilir. Bu ilaçlarla genetik yapılar arasındaki etkileşim ve DNA iterkalasyonuyla ilgili detaylar tartışmalı konulardır. Bu nedenle, doksorubisinin ve bleomisinin bithizole kuyruğunun nükleobazlarla etkileşimi kuantum mekaniksel yöntemlerle çalışılmıştır. Bu amaçla, doksorubisin ve bleomisinin bithiazole domaininin konformasyonel analizleri Spartan 08 programı ile yapıldı ve doksorubisin için 422, bleomisin için 798 konformer bulundu. Yapılar için en uygun konformeri bulmak üzere Spartan 08 programı ile optimizasyon analizleri ve en kararlı yapıyı bulabilmek için geometri optimizasyonları yapıldı. Her bir konformer için geometri optimizasyonları ve frekans analizleri yoğunluk fonksiyoneli teorisi ile, B3LYP/6-31G** düzeyinde, Gaussian 09 programı kullanılarak yapıldı. Yapılan geometri optimizasyolarında, bithiazole domaininin yapısı başlangıçtaki 3 boyutlu yapısından farklı bulunduğu için daha ileri analizler yapılmamıştır. En kararlı 20 doksorubisin konformeri ve nükleobaz tautomerleri ɷB97XD/6-31G** düzeyinde yeniden optimize edildi ve birbirleri ile etkileşimleri yine aynı düzeyde analiz edildi. Etkileşim geometrilerinin çiziminde Discovery Studio 3.5 Client programı kullanıldı. Doksorubisin ve nükleobaz tautomerlerinin yapısı ve birbirleri ile etkileşimleri, çözücü (su) etkisinde de çalışılmış, doksorubisin ve nükleobazların, doksorubisinin tetrasiklik bölgesinden birbirleriyle etkileşerek hidrojen bağları oluşturdukları bulunmuştur.
Teranostik gadolinyum nanoparçacıkların tasarımı ve in vitro uygulamaları
Teranostik tedavi, kanser araştırmalarında eş zamanlı görüntüleme ile tedaviye aynı anda izin veren son yılların en umut vaadetmekte olan yöntemlerinden biridir. Bu çalışmada gadolinyum nanopartiküller (GdNp) ve protoporfirin IX'lar (PpIX) aynı anda yüksek kimyasal stabilite ve enkapsülasyon verimine sahip olan niozomlar ile enkapsüle edilerek (Gd-PpIX-Ni) yeni bir teranostik tedavi ajanı oluşturuldu. GdNP ve PpIX'ların iyi birer radyoterapi (RT) yoğunlaştırıcı ajan oldukları bilinmektedir. Aynı zamanda porfirin türevleri en çok çalışılan fotodinamik terapi (FDT) ajanlarındandırlar. Yapmış olduğumuz araştırmada insan tip II alveolar (ATII) akciğer kanserli epitel hücre hatları (A549), insan kanserli yumurtalık hücre hatları (HeLa) ve insan sağlıklı akciğer epitel hücre hatları (WI38) üzerinde RT ve FDT'nin kombine uygulamaları (multimodal treatment) denenmiş ve hücre görüntüleri manyetik rezonans (MR) cihazı ve floresans mikroskop altında (dual imaging) alındı. Boyut ve zeta potansiyel bağımlı karakterizasyon çalışmaları dinamik ışık saçılımı metodu (DLS) ve atomik kuvvet mikroskopu (AFM) ile yapılmış olup çalışma boyunca hücre canlılığı MTT metodu ile ölçüldü. Sonuç olarak hazırlanmış olunan 100 nm'den daha küçük partikül boyutuna sahip teranostik niozomal veziküllerin kanser için yeni bir bakış açısı olan kombine tedavi ve çoklu görüntüleme çalışmalarının aynı anda yapılmasına olanak sağlayan uygun bir kargo sistemi olabileceği kanaatine varıldı.
Bazı YopM-protein etkileşimlerinin floresans protein komplementasyon stratejisi ile incelenmesi
İnsanlar için patojen özellik gösteren sadece üç farklı Yersinia spp. bulunmaktadır: Y. pestis, Y. enterocolitica ve Y. pseudotuberculosis. Bu suşlar, konakçının fagositoz gibi bazı savunma mekanizmalarını inhibe etmektedir. Yersiniapatojen suşları, efektör proteinlerini salgılayarak konakçının immün sisteminden kaçabilmektedir. Yersinia efektör proteinleri tip III sekresyon sistemi aracılığıyla etkileşime geçilen hücrelere salgılanmaktadır. Bu efektör proteinlerden biri olan YopM, lösince zengin tekrar motiflerini içeren ve asidik bir proteindir. Bu proteinin hücre bariyerini aştığı, nükleusa ulaşabildiği ve protein transportunu sağladığı gösterilmiştir. Bu tez kapsamında, Yersinia spp. Tip III sekresyon sisteminin regülasyonunda görevli LcrV ve LcrG proteinleri ile YopM arasındaki protein-protein etkileşimi yeşil floresans proteininin (GFP) komplementasyonuna dayanan bir yöntem ile incelendi. N-terminal GFP fragmenti (1-157. amino asitler) ile LcrV veya LcrG proteinlerini kodlayan genler füzyon PCR ile birleştirildi. Benzer şekilde, C-terminal GFP (158-238. amino asitler) ve YopM geninden oluşan bir füzyon genfragmenti elde edildi. NGFP-LcrG (veya NGFP-LcrV) ile YopM-CGFP kodlayan iki plazmidin E. coli hücresinde ko-transformasyonu gereçekleştirildi ve floresans görüntüleme yapıldı. Bunun yanında, füzyon proteini saflaştırıldı ve GFP floresans spektrumu incelendi. YopM ve LcrG proteinlerinin etkileşimi sonucu NGFP ve CGFP parçalarının komplementasyonu ile GFP floresansı oluşturduğu gözlendi. Bununla birlikte, YopM ve LcrV proteinleri için benzer bir GFP floresansı elde edilemedi.
Rekombinant olarak üretilen fındık alerjen proteinine karşı dna aptamerinin geliştirilmesi
Gıda alerjisi, gıdalarda bulunan antijenlere karşı IgE aracılı immün yanıtın gelişmesidir. Alerjik bireylerin korunması amacıyla, alerjen bileşen varlığının gıda ambalajlarında deklare edilmesi zorunluluğu getirilmiştir. Gıda alerjen tayininde kullanılan mevcut yöntemler ELISA, yanal akış immünosorbent eseyleri ve RT-PCR kitleri ile sınırlıdır. Antikorlara üstünlükleri sayesinde aptamerlerin çeşitli alanlarda olduğu gibi sensör geliştirilmesi çalışmalarında kullanımı da yaygınlık kazanmıştır. Fındık alerjen proteinlerine karşı geliştirilecek bir DNA aptamerinin biyosensör ya da alerjen tayin kiti geliştirilmesi çalışmalarında kullanım potansiyeli vardır. Bu tez çalışmasında, fındık alerjen proteini Cor a 11 proteinine yüksek ilgi ve seçimlilikle bağlanan bir DNA aptamerinin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu doğrultuda Cor a 11 ve yer fıstığındaki homoloğu olan Ara h 1 proteinleri rekombinant olarak üretilmiş ve saflaştırılmıştır. Her iki proteinin manyetik boncuklara immobilize edilmesi sonrasında SELEX çalışması yapılmış ve Cor a11proteinine yüksek ilgi ve seçimlilikle bağlanma potansiyeli bulunan aptamer dizileri belirlenmiştir.
Elektrokimyasal kokain biyosensörü
Kokain, merkezi sinir sistemini doğrudan uyarması nedeniyle, güçlü tolerans oluşturan bağımlılık yapma etkisi yüksek bir maddedir. Bu bağlamda, günümüzde, kokainin duyarlı ve hızlı analizi önemli rol oynamaktadır. Bu tez projesi kapsamında, kokain tayinine yönelik geleneksel metodlara alternatif yöntem olarak elektrokimyasal biyosensör hazırlanması, analitik karakterizasyonu, uygulama ve doğrulaması hedeflenmiştir. Bu kapsamda önce, aptamer-temelli yeni platform oluşturulması için biyo-tanıyıcı yüzey tasarlandı. İlk olarak, politiyofen üzerinde homopeptid yapısında ve fonksiyonel grup içeren polialanin yan zincirleri (PT-Pala) elektrokimyasal olarak elektrot yüzeyine kaplandı ve sonrasında kovalent konjugasyon kimyasıyla polimer kaplı yüzeye kokain aptameri bağlandı. Yüzeyde her bir modifikasyon adımı elektrokimyasal karakterizasyon ile doğrulandı. Kokain ve metaboliti olan benzoilekgonine duyarlı olarak tasarlanan biyosensör sistemi sırasıyla tayin aralığı 2,5-10 nM ve 0,5-50 μM olarak bulunmuştur. Ayrıca, benzoilekgonin için dedeksiyon limiti 1,5 nM olarak bulunmasıyla kokain analizi için oldukça duyarlı bir sistem oluşturulmuştur. Diğer önemli husus ise, biyolojik sıvılarda başarılı bir şekilde analiz edilmesi pratik çalışmalarda uygunluğunu kanıtlamıştır. Bu çalışma sonucunda elde edilen verilerin, kokain ve metabolitinin elektrokimyasal tekniklerle özgül ve hızlı olarak tayini gerçekleştirildi. Sonuç olarak, farklı yaklaşımlarla tasarlanan yeni platformun, kokain ve metabolitine karşı geliştirilen seçici platformun elektroanalitik teknolojiler ile birleştirilmesi, hem yasal süreçte hem de klinik testler için ileride yapılacak çalışmaları destekleyeceği düşünülmektedir. Anahtar sözcükler: Kokain, benzoilekgonin, kokain aptameri, biyoaffinite etkileşimleri, elektrokimyasal biyosensörler, biyomoleküller ile konjugasyon.
Biyomodifikasyon yolu ile poliakrilonitril kumaşlara antimikrobiyal özellik kazandırılması
Günümüzde kullanılan antimikrobiyal ürünler, hem işlevi hem de raf ömrü gereği tüketiciyi tatmin etmemektedir. Bunun başlıca iki sebebi vardır: Antimikrobiyal ajanın işlevsizliği (antibiyotik direnci) ve antimikrobiyal ajanın bağlanma yöntemi (kovalent olmayan yöntemler). Piyasada mevcut olan antimikrobiyal ürünler, genellikle kullan-at (tek kullanımlık) özelliktedir. Bu ürünler atık olarak doğada birikmeleri nedeniyle çevre için tehdit unsuru oluşturmakta ve antimikrobiyal etkileri nedeniyle ekosistem üzerinde tehlike arzetmektedir. Tek kullanımlık olmayan alternatifler için ise daha farklı tehlikeler mevcuttur. Öncelikle, bu ürünlere antimikrobiyal özellik veren ajanlar, ürüne kovalent olarak immobilize edilmemiştir. Bu nedenle ajanlar yıkama, sürekli kullanım, zaman gibi faktörlerin etkisiyle üründen ayrılmakta, dolayısıyla ürün etkisini yitirmektedir. Öte yandan antimikrobiyal ajanın canlı vücuduna ya da çevreye salınması, bir başka tehlike arzetmektedir. Eğer kullanılan antimikrobiyal ajan bir ağır metal ise bu tehlike daha da büyümektedir. Antimikrobiyal ürünleri etkisiz kılan etmenlerden bir diğeri, uygun olmayan ve/veya sürekli antibiyotik kullanımı olup, bakterilerin bu antibiyotiklere direnç geliştirmesi ile sonuçlanmıştır. Günümüzde etkili olan antibiyotiklerin de gelecekte etkisini yitireceği, bilinen bir gerçektir. Bu durum, yeni bir antimikrobiyal ajan arayışını doğurmuş olup; antimikrobiyal peptidler (AMP) en çok öne çıkan alternatiflerdir. Tüm canlıların doğal bağışıklık sisteminin bir parçası olan AMP'ler çeşitli etki mekanizmalarına sahip olup, bu çalışmada, membrana etki eden "nisin" adlı peptid kullanılmıştır. Bu çalışmada, polikarilonitril (PAN) kumaşa sürekli antimikrobiyal özellik kazandırılarak, günümüz antimikrobiyal ürünlerinde yaygın olarak görülen iki olumsuzluğun da giderilmesi amaçlanmıştır. Dirençli bakterilere etki etmesi için seçilen nisin, mikrobiyal yolla modifiye edilen PAN kumaşlara kovalent olarak immobilize edilerek, sürekli antimikrobiyal etki gösteren kumaşlar elde edilmiştir. Çalışma kapsamında PAN kumaşın biyomodifikasyonu için Pseduomonas aeruginosa (ATCC 27853) suşunun nitrilaz enzimi kullanılmıştır. Kumaşın nitril grupları, biyotransformasyon ile yerini karboksil gruplarına bırakmış; bu şekilde daha hidrofilik hale gelen kumaşın karboksil grupları aktiflenerek nisinin kovalent immobilizasyonu gerçekleştirilmiştir. Geliştirilen ürünün karakterizasyonu yapılarak, kumaşın bakteriler üzerindeki etkisi antimikrobiyal testler ile kanıtlanmıştır. Antimikrobiyal testler için P. aeruginosa (ATCC 27853) ve Staphylococcus aureus (ATCC 6538) bakterileri kullanılmıştır. Çalışmanın iki optimizasyon aşaması bulunmaktadır: Modifikasyon aşaması ve immobilizasyon aşaması. Modifikasyonun optimizasyonu ile kumaştan mümkün olduğu kadar çok nitril grubu karboksil grubuna dönüştürülmüş; immobilizasyonun optimizasyonu ile mümkün olduğunca çok nisin peptidi PAN kumaşa bağlanmıştır.
Biyoelektrokimyasal ölçüm sistemlerinde kullanılmak üzere enzimlerle modifiye edilmiş yüzeylerin hazırlanması ve karakterizasyonu
Bu çalışmada enzim immobilizasyonu için setiltrimetilamonyum bromür modifiye Dellit (CTAB-Del) dayalı yeni bir materyal başarıyla sentezlenip piranoz oksidaz biyosensörleri (CTAB-Del/PyOx) hazırlanmasında kullanılmıştır. Del kilin içine CTAB interkalasyonu FT-IR, XRD ve TGA teknikleri ile teyit edilmiştir. Daha sonra PyOx enzimi CTAB-Del'in immobilizasyon materyali olarak kullanımıyla canımsı karbon elektrot üzerine glutaraldehit ile çapraz bağlayarak immobilize edilmiştir. Killerin gözenekli yapıları immobilize edilmiş tabakadan glukoz ve ko-substrat olarak oksijenin difüzyonunu kolaylaştırır. CTAB-Del/PyOx biyosensörlerinin analitik performansını test etmek için, kronoamperometrik ölçümler üçlü elektrod sistemi kullanarak -0,7V sabit bir potansiyelde olçümler alınmıştır. CTAB-Del/PyOx biyosensörü ile glukoz için tayin aralığı 0,01-0,5mM olarak bulunmuştur, kalibrasyon grafiği için doğru denklemi y =4,42x+0,004 (R2=0,998). Ayrıca tayin limiti (LOD) 0,081µM (S/N=3) olarak hesaplanmıştır. CTAB-Del/PyOx biyosensörünün pratik kullanımıNI doğrulamak için, çeşitli içeceklerin glukoz analizine uygulanmıştır. Buna ek olarak, Del ve CTAB-Del antimikrobiyal aktiviteleri üç farklı Gram-pozitif, beş farklı Gram-negatif bakteri ve bir maya suşuna karşı disk difüzyon duyarlılık testi ile in vitro koşullarda taranmıştır. Sonuç olarak CTAB-Del Gram-pozitif bakterilere karşı orta düzeyde antibakteriyel etki göstermiştir.
Lizozomal depo hastalıklarının lökositlerinde hastalık ile ilgili spesifik enzim aktivitelerinin ölçülmesi
Lizozomal depo hastalıkları (LDH) 40' tan fazla genetik hastalık grubunu kapsar. LDH'ta yıkılamayan moleküller, endozom/ lizozomlar içerisinde depolanmaya başlar. Depo edilen metabolitler genellikle mukopolisakkarid (MPS), sfingolipid, mukolipid, glikoprotein, oligosakkarid ve glikojendir. Lizozomlardaki bu birikim bir süre sonra hücrelerin şişmesine, fonksiyonlarının bozulmasına ve hücre ölümüne neden olur. LDH'ların tanısında kuru kan örneğinde ve lökositlerde enzim aktivitesi tayini en önemli ve en sık kullanılan yöntemdir. Ancak özellikle heterozigot hastalarda yalancı pozitiflik veya negatiflik görülebilir. Bu araştırmada bu hastaların T lenfositleri, B lenfositleri ve monosit-makrofajları flow sitometri ile CD8, CD19, CD14, CD33 reseptörleri kullanılarak izole edilerek enzim aktiviteleri tayin edilmiştir. Bu şekilde özellikle heterozigot hastaların tanısı için daha güvenli bir tanı yöntemi araştırılmıştır. Son yıllarda, Gaucher hastalarında multipl myelom ve B hücreli lenfoma insidansında artış gösterilmiştir. Bu nedenle, çalışmada Gaucher hastalarında lökosit infiltrasyonu ve lenfoid malignite gelişmesi arasındaki ilişkiyi araştırmak amacıyla Gaucher hastaları ve sağlıklı kontrollerde lökosit yüzey antijenlerinin oranı belirlenmiştir Lökosit hücre yüzeyi antijenlerinin miktarı % dağılım olarak hesaplanmıştır. Çalışmamızda GD hastalarında CD33, CD14 ve CD8 antijenleri kontrole göre hafif yüksek olarak bulunurken CD19+ lökositlerin oranı istatistiksel olarak anlamlı yüksek bulunmuştur (p<0.05). CD33, CD19, CD14 ve CD8 pozitif lökositler akım sitometresinde toplanmış ve enzim aktiviteleri belirlenmiştir. Enzim aktiviteleri hasta ve kontrol grubu arasında anlamlı farklı bulunmuştur( p≤0.00) GD hastaları genetik özelliklerine göre kendi aralarında ve kontrol grubu arasında karşılaştırılmıştır.Hücre sayı oranları incelendiğinde Homozigot GD olanlarda CD33+ lökosit oranı anlamlı yüksek olduğu görüldü (p≤0.038). Çalışmamızda bulunan CD19 antijen ekspresyonu artışı B hücre kaynaklı malignitelerin gelişiminde bu antijenin rolü olabileceğini düşündürmüş ve Gaucher'de inflamatuvar aktivasyon hipotezini desteklemiştir. CD19+ lökosit miktarının belirlenmesinin bu hastalarda malignitenin ön göstergesi olarak kullanılabileceğini düşündürmüştür. Anahtar kelimeler: Gaucher; CD19; CD33.
Nanobubble sentezi, karakterizasyonu ve biyouyumluluğunun belirlenmesi
Bu tezde, akciğer kanserinin hedefli tedavisine imkan sağlayabilen ilaç taşıyıcı sistemin sentezi, karakterizasyonu ve biyouyumluluk testlerinin yapılması amaçlandı. Sağlıklı dokularda bulunmamasına karşılık akciğer kanserinde seviyesi artan matriks metaloproteinazlarından biri olan matriks metalloproteinaz-11 enziminin parçalayabileceği peptid dizisi belirlendi. Peptid yapısına akciğer kanserinde kullanılan kemoterapi ilaçlarından pemetrexed ve pazopanib bağlandı. Elde edilen peptid-ilaç konjugatları manyetik nanopartiküllere konjuge edildi ve bu manyetik nanokonjugatlar lipozom yapılı nanobubble'lar içine hapsedildi. Manyetik alan ve ultrases duyarlı nanotaşıyıcı sistemin dışarıdan lokal olarak uygulanan manyetik alan ile tümörlü dokuya hedeflendirilebileceği ve hedeflemenin ardından yine lokal olarak uygulanan ultrases ile de taşıyıcı sistemin nanobubble içerisinden çıkarak o bölgede birikeceği düşünülmektedir. Başlıca hedef, ilaçların terapötik indeksini artıran buna karşılık sağlıklı dokulardaki yan etkisini azaltabilen, immunolojik cevaba neden olmayan, dual hedef ve dual tedavi olanağı sağlayan ilaç taşıyıcı sistemi hazırlamaktır. Elde edilen nanokonjugat yüklü nanobubble'ın karakterizasyon çalışmaları ve biyouyumluluk testleri yapılmıştır.
Pseudomonas aureofaciens'de mcl-polihidroksialkanoatların hücre içi yıkım ürünü organik asitlerin belirlenmesi
Plastiklerin sahip olduğu fiziksel ve kimyasal özelliklere sahip olan, biyolojik olarak parçalanabilen biyobozunur plastiklere örnek olarak polihidroksialkanoatlar (PHA) verilebilir. Polihidroksialkanoatlar (PHA); hidroksialkanoatların (HA) poliesterleridir. Birçok bakteri tarafından karbon ve enerji kaynağı olarak karbon kaynağının aşırısının bulunduğu fakat esansiyel (N, P, S, O ve Mg gibi) elementlerin sınırlandırıldığı koşullarda üretilen PHA'ların ekstrasellüler yıkımları üzerine çalışmalara rastlanılmakla birlikte PHA'ların hücre içi yıkım yolaklarının belirlenmesi üzerine yapılmış araştırmalara rastlanılmamıştır. Bu tez kapsamında, model organizma olarak Pseudomonas aureofaciens seçilmiştir. C/N oranları değiştirilerek organizmada önce PHA biyosentez ve ardından yıkım yolakları teşvik edilerek hücre içi PHA yıkım ürünü olan organik asitler belirlenmiştir ve çalışılan PHA üretiminin teşvik edildiği, açlık ve PHA üretiminin teşvik edilmediği koşullarda belirli periyotlarla örnek alınarak bu örneklerdeki PHA profilleri çıkartılmıştır. Yapılan analizler sonucunda formik asit konsantrasyonun özellikle açlık ve PHA üretiminin teşvik edilmediği koşullarda farklanması, üretiminin teşvik edildiği, yıkımın teşvik edildiği ve PHA üretiminin teşvik edilmediği koşullarda valerik asit konsantrasyonun çalışılan diğer organik asit konsantrasyonlarından daha yüksek olması, izobütirik asitin ise sadece mcl-PHA üretiminin teşvik edildiği koşullarda tespit edilmesi, glutamik asit, treonin ve valin amino asit konsantrasyonlarının da çalışılan diğer amino asit konsantrasyonlarından farklılık göstermesi bu organik asitlerin PHA metabolizması ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Tüm bu sonuçlar, hücre içi mcl-PHA yıkım yolağının aydınlatılması ile ilgili yapılacak çalışmaların öncüsü niteliğinde olup, yapılacak yeni çalışmalara ışık tutacaktır.
Pseudomonas aureofaciens'de mcl-polihidroksialkanoatların hücre içi yıkım metabolitlerinin GC-MS ile profillenmesi
Polihidroksialkanoatlar (PHA), aşırı karbon kaynağının bulunduğu azot sınırlamalı stress koşulları altında bakterilerde granüler halde enerji rezervi depolanan biyopolimerlerdir. Fiziksel ve kimyasal özelliklerinin petrol-türevli polimerlere benzer oluşu bu biyopolimerlerin petrol-türevli plastiklerin yerini alabilmesine olanak sağlamaktadır. Aynı zamanda biyouyumlu ve biyobozunur özellikte olmaları nedeniyle PHA'lar doku mühendisliği ve biyomedikal alanında da kullanım potansiyeline sahiptir. Endüstriyel olarak üretimi ve kullanım açısından üzerine yapılmış ve devam eden birçok çalışma bulunmaktadır. Yapılan bu çalışmalar ağırlıkla üretim veriminin arttırılması ve kullanım potansiyelleri yönündedir. Ancak üretici mikroorganizmada yıkım da devam etmektedir. Bu işlem ise hücre içi PHA depolimerazlar olarak adlandırılan enzimler tarafından yapılmaktadır. PHA sentezinin arttırılması yanında, yıkımının da bloke edilmesinin/hızının azaltılmasının üretim verimini daha da arttıracağı açıktır. Bu işlemin getireceği bir diğer avantaj, üretim süresinin azalması, üretim maliyetinin düşürülmesi anlamına gelmektedir. Mevcut literatürler incelendiğinde PHA'ların hücre içi yıkım yolaklarının belirlenmesi üzerine yapılmış araştırmalar oldukça azdır. Bu tez çalışmasında, PHA üretici olarak olarak Pseudomonas aureofaciens seçilmiştir ve karbon kaynağı olarak oktanoik asit kullanılarak üç farklı koşulda mcl-PHA metabolizması incelenmiştir. PHA üretiminin teşvikdildiği, açlık ve PHA üretiminin teşvik edilmediği koşullarda belirli periyotlarla örnek alınarak bu örneklerdeki PHA profilleri çıkartılmış ve yağ asidi türevli metabolitler GC-MS ile analizlenmiştir. Yapılan analizler sonucu elde edilen metabolitlerden 3-hidroksioktanoat, trans/cis-3-oktenoik asit ve 2-oktenoik asidin doğrudan poli-3-hidroksikoktanoat (PHO) metabolizmasıyla ilşkili olduğu ve polimerin biyosentez ve yıkımının bu metabolitler üzerinden gerçekleştiği düşünülmektedir. Diğer metabolitlerin ise dolaylı yollardan temel metabolitlerin ileri dönüşüm ürünleri veya organizmanın rutin metaboliti olduğu düşünülmektedir. Elde edilen bu veriler ile PHO metabolizmasının anlaşılmasına yardımcı olabilecek literatür bilgisinin sağlanacağı düşünülmektedir.
Kanser tedavisinde hedgehog yolağı inhibisyonuna yönelik organometalik bileşiklerin sentezlenmesi, karakterizasyonu ve kanser tedavi potansiyelinin in vitro/in vivo/ex vivo araştırmaları
Kanserde sürekli çoğalma özelliği metabolik yolaklar ile düzenlenmektedir. Ancak Hedgehog yolağı gibi bazı metabolik yolaklar özellikle kanserin agresif olması, invazyon, metastaz yapma ve rekürrens gösterme gibi yetenekler kazanmasında önemli rol oynamaktadır. Hedgehog metabolik yolağı normal koşullar altında embriyonik gelişim sürecinde ve kendini yenileyen dokularda aktif iken, bu yolak üzerindeki bir yeniden düzenlemenin kanser oluşumuna neden olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca, Hedgehog metabolik yolağının kanser kök hücresinde aktivitesinin yüksek olması bu metabolik yolağa yönelik inhibitör arayışlarına önem katmıştır. Doktora tez çalışması kapsamında Hedgehog metabolik yolağına yönelik organometalik bileşik sentezlenmesi, karakterizasyonu, hücre kültürü çalışmaları, nüde farelerde ksenograft kanser modeli oluşturularak tedavi potansiyelinin incelenmesi ve ex vivo çalışmalarının gerçekleştirilmesi amaçlanmıştır. Çalışma sonucunda %62 oranında bir verim ile cis-4-hidroksifenilplatinum(II)diamin bileşiği sentezlenmiştir. A549-luc ve SKOV3-luc hücre hatları üzerinde yapılan MTT denemesi sonucunda IC50 değerleri sırasıyla 13,44 ve 7,91 μM olarak hesaplanmıştır. Ksenograft modellerde i.v. ilaç uygulama ile tedavi grubunda iyileşme gözlenirken kontrol grubunda tümör büyümesi devam etmiştir.
Çeşitli kaynaklarda peptid temelli deglikasyon ajanlarının araştırılması
Diabetes mellitus multifaktoriyel, kronik bir metabolizma hastalığıdır. Her geçen gün dünya popülasyonunda hastalığa maruz kalan kişilerin artması ile gerek hastalığın oluşumunun gerekse hastalık sonucunda gelişen nefropati, retinopati, nöropati, anjiyopati vb. komplikasyonların engellenmesine yönelik yeni tedavilerin geliştirilmesi bir zorunluluk halini almıştır. Bu bağlamda birçok araştırıcı tarafından farklı yönleriyle araştırılmaktadır. Hiperglisemide, glukoz ve proteinlerin amino grupları arasında kendiliğinden gelişen enzimatik olmayan glikasyon reaksiyonları yoluyla önce Schiff bazları, sonrasında daha stabil olan Amadori ürünleri oluşur. Amadori ürünlerinin oluşumundan sonra ileri glikasyon son ürünleri(AGE) meydana gelir. Son zamanlarda yapılan çalışmalarda AGE oluşumunun glukozun oto-oksidatif prosesine bağlı olduğu ve serbest oksijen radikallerinin oluşumunu etkiledikleri gösterilmiştir. İleri glikasyon son ürünleri olarak adlandırılan bu ürünlerin birikmesi ile doku proteinlerinde yapısal ve fonksiyonel değişiklikler oluşmaktadır. Sonuç olarak yaşlanma ve yaşlanmaya bağlı hastalıklar, diyabetik komplikasyonlar, romatoid artrit, nörodejeneratif hastalıklar vb. birçok önemli hastalığın patojenezinde önemli rol oynadıkları bilinmektedir. Bu nedenle enzimatik olmayan bu glikasyonun ve ileri glikasyon ürünlerinin oluşumunun engellenmesi son yıllarda üzerinde sıklıkla durulan konular arasındadır. Genel anlamda AGE oluşumunun inhibisyonunda diğerlerinin arasında en etkin olduğu düşünülen deglikasyon prosesi de enzimatik olmayan prosesin ilk ürünleri olan Schiff bazları (glikozaminler) üzerindendir. Bu deglikasyon prosesindeki ilk adım transglikasyon olarak adlandırılmaktadır ve şekerin Schiff bazından düşük molekül kütleli intraselüler nükleofillere transferini içerir. Transglikasyon ajanları sayesinde, glikasyon ilk evrelerinde tersine çevrilir. Bunu gerçekleştirebilme yeteneğine sahip bir bileşiğin etkinliği ne kadar fazla ise, yaşam süresini uzatmak ve kaliteli kılmak açısından önemli olacaktır. Bu bağlamda bu tez çalışmasında sistein ve histidince zengin bitkilerden deglikasyon etkinliği olan peptid yapıda bileşiklerin izolasyonu gerçekleştirilerek deglikasyon etkinliklerine bakıldı. Sonuç olarak hazırlanan bitki peptid izolatlarından sırasıyla soya, arpa, bağdem ve buğday'ın antiglikasyon etkinliklerinin karnozin ve aminoguanidin'e kıyasla kayda değer ölçüde etkin olduğu belirlendi. İncelenen tüm parametreler açısından değerlendirildiğinde ise soya peptid izolatının en iyi deglikasyon, antioksidan ve metal bağlama etkinliği olduğu saptanmış olup daha etkin ve seçimli inhibitörlerin geliştirilmesi açısından önemli olduğu düşünüldü.
Beyin hücrelerinin adezyonunda kullanım potansiyeli olan yeni fonksiyonel yüzeylerin hazırlanması
Bu çalışma, farklı gruplara sahip 2 monomerin ve beyin hücrelerinin seçimli adezyonuna olanak sağlayan bir peptidin kullanımını temel almaktadır. Monomerlerden bir tanesi floresan özellik taşıyan rodamin (RD) diğeri ise fonksiyonel grup olarak serbest amino grubuna sahiptir (RF). Bu iki monomer indiyum kalay oksit ile modifiye edilmiş cam (ITO) yüzeyler üzerine elektrokimyasal polimerizasyonla biriktirilmiştir. Yüzeyler kopolimer ile kaplandıktan sonra ArginilGlisilAspartik asit (RGD) isimli tripeptid 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid (EDC) kullanılarak karboksil gruplarından amino grubu içeren yüzeye kovalent olarak bağlanmıştır. Oluşturulan seçimli yüzey, integrin avb3 reseptör pozitif hücre hattı olan Glioblastoma (U87-MG) için adezyon platformu olarak kullanılmıştır. İnsan keratinosit (HaCaT) hücreleri ise kontrol grubu olarak seçilmiştir. Yüzeyin kopolimer ve RGD ile modifikasyonunun izlenmesi için elektrokimyasal ve mikroskobik teknikler kullanılmıştır. Sonuç olarak, tasarlanan P(RF-co-RD)/RGD platformu U87-MG hücrelerinin 10 ile 104 hücre/mL aralığında elektrokimyasal dedeksiyonuna olanak sağlamıştır. Ayrıca ek bir boyama işlemine gerek kalmadan hücrelerin floresan görüntülenmesi gerçekleştirilebilmiştir. Bu bağlamda hem elektrokimyasal hem de floresan görüntülemeye olanak sağlayan seçimli bir yüzey başarılı bir şekilde gerçekleştirilmiştir.
Fenolik bileşiklerin belirlenmesinde kullanılacak biyoanaliz sistemlerinin hazırlanması ve karakterizasyonu
Endüstriyel atıkların çevredeki artışıyla birlikte birçok atık türünde doygunluğa ulaşılmıştır ve bu atıkların zararları görülmeye başlamıştır. Bu atıklardan en önemlilerinden olan fenol ve fenol türevleri; patlayıcı madde, farmasötik, plastik, kâğıt, boya, pestisit ve antioksidanların üretimi gibi birçok endüstriyel proseste kullanılmaktadırlar. Bazı fenoller ve aromatik bileşikler yüksek oranda toksisite, kanserojen ve alerjen özellik gösteren maddeler olmaları sebebiyle tayin edilmeleri ve çevreden uzaklaştırılmaları yüksek öneme sahiptir. Bu bileşiklerin tayini amacıyla atık su, içecekler gibi çeşitli ortamlarda kolorimetrik, florometrik, türbidimetrik, spektrofotometrik ve enzimatik yöntemler uygulanmaktadır. Ancak kullanılan bu yöntemlerin oldukça zaman alıcı ve pahalı sistemler olduğu bilinmektedir. Bu tip sistemlere kıyasla biyosensörler ile maliyeti düşük, pratik ve hızlı sonuç veren analizlerin uygulanması mümkündür. Bu tez çalışmasında, fenolik bileşiklerin belirlenmesine yönelik lakkaz (Lac) enzimi kullanılarak biyosensör dizayn edilmiştir. Bu amaçla, kolaylıkla hazırlanabilen ve enzimin kovalent bağlarla immobilize edilmesini sağlayan poliamik asit (PAA) membranlar kullanılmıştır. İlk olarak PAA membranlar florofor bir madde olan antraseni (Ant) içerecek şekilde sentezlenmiştir. Ant-PAA yapısına Lac enzimi, gluteraldehidin çapraz bağlayıcı olarak görev yaptığı bir yöntemle immobilize edilmiştir. Oksijenin antrasenin floresans şiddetini sönümlemesi yapılan ölçümlerin temelini oluşturmaktadır. Lac reaksiyonu sırasında fenolik bileşikler yükseltgenirken oksijen suya indirgenir. Ölçüm ortamından oksijenin uzaklaştırılmasıyla floresans şiddeti artmaktadır. Bu prensibin temel alınmasıyla konsantrasyona bağımlı floresans şiddetindeki artış ilişkilendirilerek fenolik bileşiklerin kantitatif tayini yapılmıştır. Ant-PAA/Lac sistemi için optimum pH 5,5 olarak bulunmuştur. Fenol 0,05-0,25 mM aralığında tayin edilmiştir. Ayrıca floresans şiddetine girişim yapma olasılığı olan çeşitli bileşiklerin etkisi test edilmiş ve sentetik atık suda fenol tayin yapılmıştır. Bir sonraki aşamada Paraoksonaz (PON) ve Lakkaz (Lac) enzimleri birlikte immobilize edilerek Ant-PAA/Lac-PON sensör sistemi hazırlanmıştır. Ant-PAA/Lac-PON için optimum pH 8,0 olarak bulunmuş ve fenil asetat için tayin aralığı 0,01-0,5 mM olarak bulunmuştur. Girişimci etkisi test edilmiştir. Siproflaksasinin PON için inhibitör olduğu bilinmektedir ve Ant-PAA/Lac/PON sistemi inhibitör temelli biyosensör olarak kullanılarak Siproflaksasinin kantitatif tayini yapılmıştır.
Görüntüleme kılavuzlu ve tedaviye yönelik nanoparçacıkların sentezi ve in vitro uygulamaları
Biyomedikal uygulamalardaki büyüyen ihtiyaca yönelik olarak multifonksionel nanopartiküllerin diğer bir tanımla tek bir partikülde hem tedavi hem de diyagnoz özelliği taşıyan teranostiklerin gelişimi hızlanmıştır. Bu bağlamda teranostiklerin etkin hücresel alımını sağlamak için çeşitli kompozisyon ve biyokonjugasyonlar ile görüntüleme kılavuzlu terapi amacıyla birçok stratejiye başvurulmuştur. Bu tez projesinde, multifonksiyonel nanopartiküller, yenilikçi teranostikler olarak tasarlandı ve sentezlendi. Genel tasarım olarak, teranostiklere yönelik sentez stratejileri dünyada en çok mortalitenin ikinci görüldüğü hastalığa ilişkin olarak kanserli hücre hatlarına göre planlanmıştır. Tez çalışmasında kullanılan ana nanopartiküller, yüzey modifikasyonu, polimer kaplama, enkapsülasyon ve folik asit ya da antikor ile biyokonjugasyonu ile yapılan ileri işlevselliğe ve hedefleme kabiliyetine sahip altın nanopartiküller (AuNP), karbon noktalar (CD) ve lipozomlar ve niozomları gibi veziküler sistemlerdir. Bunun için, fonksiyonel polimer kaplı AuNP'ler, FA bağlanmış niozomlar ve anti-CD44 bağlı lipozomlar ve bununla beraber moleküler baskılanmış polimer kaplı CD'ler çalışılmıştır. Tüm nanopartiküllerin sentezi sonrasında, ilgili karakterizasyon ve takibinde in vitro hücre temelli çalışmalar teranostiklerin toksisite, hücre alımı, biyogörüntüleme ve kemo/radyo- ya da fotodinamik terapiuygulamaları ile multimodal özellikleri incelenmiştir. Tez kapsamında elde edilen tim sonuçlar, bu fütüristik partiküllerin aydınlatılmış karakteristikleri ve artırılmış biyokimyasal performansları sayesinde klinik amaçlar doğrultusunda etkin araçlar olabileceğini işaret etmektedir.
Kötüye kullanılan maddelerin analizinde ın vıtro diagnostik testler için farklı nanobiyokonjugatlar ve test bileşenlerinin hazırlanması ve uygulamaları
"In vitro diagnostik, (IVD), Point of care (POC)" teknolojiler; klinik bir konu hakkında diagnostik sonuca yerinde, hızlı ve pratik bir biçimde ulaşmayı sağlamaları açısından geleceğin teknolojisi olarak gösterilmektedir. IVD kitler yasadışı maddelerin hızlı ve yerinde dedeksiyonu açısından çok kritik araçlardır. Madde kullanımının oluşturduğu sorunlara paralel olarak sağlık, adli durumlar, bazı işyerlerinde ve trafikte olmak üzere farklı uygulamalarla madde kullanımının tespiti zorunlu hale gelmiştir. Geniş bir kullanıcı ağına sahip bu ürünlerin geliştirilmesi ve iyileştirilmesine katkıda bulunacak bilimsel ve teknolojik altyapının oluşturulması bu tez projesinin konusunu oluşturmaktadır. Nanomateryal teknolojileri ile pratik dedeksiyon teknolojilerinin kombine edildiği bu tez projesinde, yasadışı/bağımlılık yapıcı maddelere yönelik farklı metodolojik yaklaşımlarla IVD test kitleri tasarlandı. Tasarımı yapılan test kitlerinde farklı ölçüm teknikleri dolayısıyla farklı sinyal ajanları ve yüzey kimyası kullanıldı. Yeni tekniklerle hazırlanan mikroplaka temelli ve lateral flow test (LFA) temelli test kitlerinin çalışma performansları detaylı bir şekilde araştırıldı ve sentetik biyolojik matrikslerin kullanılmasıyla örnek uygulama ve kromatografik doğrulama adımları başarıyla tamamlandı. Geliştirilen test kitlerinin akıllı telefon uygulamasıyla kombine edilmesi sonucu test yanıtları bir cep telefonu ile ölçüldü. Cep telefonu ile analize imkan sunan, yenilikçi, yerinde uygulanabilir hızlı tanı kitleri prototipleri tez projesinin çıktılarını oluşturmaktadır.
Elektroeğirme tekniği ile hazırlanmış nanolifleri temel alan elektrokimyasal biyosensör geliştirilmesi
Biyomolekül temelli tanı ve teşhis teknikleri; gıda/içecek endüstrileri, hastalıkların teşhisi, biyolojik proseslerin izlenmesi gibi çeşitli alanlardaki uygulamalar için büyük bir potansiyele sahiptir. Yüksek kararlılıktaki tanı testlerinin hazırlanmasında biyomoleküllerin immobilizasyonu anahtar bir parametredir. Nanofiberler, biyomoleküllerin immobilizasyonu için iyi bir alternatif yöntemdir. Bu çalışmada, birinci nesil amperometrik enzim biyosensörlerinin tasarımı amacıyla organokil temelli nanofiberler hazırlanmıştır. Montmorillonit kilinin (Mt) interkatalizasyonunda PAMAM-G2 dendrimerleri kullanılmış ve daha sonra Mt' nin PAMAM ile modifikasyonu FTIR, XRD, TGA/DTG ve zeta potansiyel ölçümleri kullanılarak karakterize edilmiştir. Yardımcı polimer olarak poli (vinil) alkol (PVA) kullanılarak Mt ve PAMAM-Mt' nin elektro-eğirilmesi ile PVA/PAMAM-Mt nanofiberleri hazırlanmış; elde edilen nanofiberlerin karakterizasyonu ise SEM, TEM ve AFM teknikleri ile yapılmıştır. Daha sonra, PVA/PAMAM-Mt nanofiberlerinin üzerine piranoz oksidaz (PyOx) enzimi çapraz bağlayıcı ajan aracılığıyla camımsı karbon elektrot yüzeyinde immobilize edildi. Amperometrik ölçümler, tampon çözelti içerisinde, karıştırmalı ortamda ve -0,7 V' de gerçekleştirildi. PVA/Mt/PyOx ve PVA/PAMAM-Mt/PyOx biyosensörleri için glukoz doğrusal aralıkğı 0,005 ile 0,25 mM arasındadır. PVA/PAMAM-Mt/PyOx biyosensörünün dedeksiyon limiti 0,7 μM glukozdur. Gerçek örneklerde glukoz tayini için ölçümler, glukoz yerine substrat olarak kolanın kullanılmasıyla gerçekleştirildi.
Polikistik over sendromu hastalarında nesfatin-1 düzeyleri ve metabolik sendromla ilişkili parametreler
Hipotalamusta ve vücudun çeşitli bölgelerinde sentezlenerek gıda alımının düzenlenmesinde rol oynayan yeni keşfedilmiş bir hormon olan nesfatin-1'in yumurtalık fonksiyonları üzerine de etkili olduğu düşünülmektedir. Biz çalışmamızda üreme çağındaki kadınlarda sık görülen, obeziteye eğilim yaratan, aynı zamanda yumurtalık fonksiyonlarıyla ilgili bir sendrom olan polikistik over sendromunda bu yeni hormonun düzeylerinde izlenebilecek değişiklikleri metabolik parametrelerle beraber değerlendirmeyi amaçladık. Çalışma grubumuza İstanbul Bilim Üniversitesi Avrupa Florence Nightingale Hastanesi Araştırma ve Uygulama Merkezi, Kadın Hastalıkları ve Doğum Polikliniği'ne başvuran 18-45 yaş arasındaki PCOS teşhisi alan 55 hasta ve 35 sağlıklı kadın dahil edildi. Tüm çalışma grubu bireylerinden adetin 3-4. gününde kan alınarak Lüteinize hormon, Folikül stimüle edici hormon, serbest testosteron, Dihidroepiandrostenedion sülfat, İnsulin, Açlık kan şekeri, Yüksek dansiteli lipoprotein, Düşük dansiteli lipoprotein, Trigliserid, Seks hormonu bağlayıcı globülin ölçümleri yapıldı; Homeostatik model değerlendirme-İnsülin direnci değeri hesaplandı. Nesfatin-1 düzeyleri ELISA yöntemiyle ölçüldü. Sonuçta; PCOS'lu kadınlarda kontrol grubuna göre nesfatin-1 düzeylerinin daha düşük olduğu belirlense de bunun hasta grubunda BMI değerlerinin yüksek olmasından kaynaklanabileceği göz önünde bulundurulup tüm gruplar BMI'ye göre alt gruplara ayırılarak karşılaştırıldı; bunun sonucunda hastalık durumundaki nesfatin-1 düşmelerinin BMI'den bağımsız olduğu izlenimi edinilse de kesin sonuçlara varılabilmesi için bu alt grupların genişletilmesi gerektiği kanısına varıldı.
Floroglusinol'ün insan prostat kanseri hücrelerinde sitotoksik ve apoptotik etkinliğinin değerlendirilmesi
Bu tez çalıĢmasında, florotanen türevi doğal kaynaklı bir bileĢik olan floroglusinolün, insan prostat kanser hücreleri üzerindeki antikanser etkinliğinin değerlendirilmesi amaçlanmıĢtır. Bu kapsamda, androjen bağımsız PC3 insan prostat kanser hücreleri kullanılmıĢ olup, floroglusinolün söz konusu hücreler üzerindeki sitotoksik etkisi MTT testi ile değerlendirilmiĢtir. BileĢiğin hücreler üzerindeki apoptotik etkinliğinin değerlendirilmesi amacı ile Annexin V bağlanma analizi çalıĢmaları gerçekleĢtirilmiĢtir.
Dulsitol'ün çeşitli meme kanseri hücrelerinde apoptotik etki mekanizmalarının araştırılması
Kanser günümüzde, kardiyovasküler hastalıklar ve inmeden sonra dünya genelinde meydana gelen ölümlerin birincil nedenlerinden biridir. 2018 yılında yayınlanan verilere göre meme kanserinin dünyada kadınlar arasında en yaygın kanser türü ve kanser ölümlerinin ana nedeni olduğu bildirilmiştir. Meme kanseri, spesifik klinik, histopatolojik ve moleküler özellikler taşıyan bir hastalık grubudur. Meme kanserinin kompleks yapıda olması ve heterojenite göstermesi farklı alt tiplere sınıflandırılmasına ve tedavide çeşitli rejimlerin uygulanmasına neden olmuştur. Meme kanseri'nin tedavisi için uygulanan geleneksel tedavi yöntemlerinin etkinliğinin düşük ve yan etkilerinin yüksek olması sorunları, meme kanserinin tedavisi için yeni ajanlar geliştirmenin önemini giderek arttırmaktadır. Dulsitol, doğal bir şeker alkolü olup, farklı hücre hatları üzerinde anti-kanser ve anti-enflamatuvar etkinliği belirtilmiş bir bileşiktir. Son yıllarda doğal kaynaklı bileşiklerin kanser hücrelerinin proliferasyonu üzerinde etkili olduklarının gösterilmesi ile bu etkinliğe yönelik mekanizmaların araştırılma çalışmaları hızla devam etmektedir. Bu tez çalışmasında, dulsitolün, MCF-7 ve MDA-MB-231 meme karsinoma hücreleri üzerinde antiproliferatif ve apoptotik etkinliğinin değerlendirilmesi amaçlandı. Elde edilen bulgular, dulsitolün MDA-MB-231 hücrelerinde hücre canlılığını anlamlı olarak azaltırken, MCF-7 hücrelerinde etkili olmadığını gösterdi. Ayrıca, dulsitolün MDA-MB-231 hücrlelerinde apoptozu indüklediği ve MMP-2/-9 mRNA ekspresyonunu anlamlı olarak azalttığı gösterildi. Söz konusu çalışma, dulsitolün meme kanseri hücreleri üzerindeki etkinliğinin değerlendirildiği ilk çalışma olması bakımından önem taşımakta olup, elde edilen bulguların literatüre katkı sağlayacağı düşünülmektedir.
Transuda ve eksuda: Enzim aktivitelerinin vücut sıvılarında araştırılması
Bu çalışmada vücut sıvılarının (plevra, asit, BOS) transuda ve eksuda olarak ayırımında, laktik dehidrogenaz (LDH), alkalen fosfataz (ALP), amilaz, aspartat aminotransferaz (ÂSAT), ve alanın aminotransferaz (ALAT) aktivitelerinin önemi araştırılmıştır. Çalışma, 64 vücut sıvısı ile yapılmıştır. Vücut sıvılarının transuda ve eksuda ayırımında; protein, PSP/TSP, dansite ve rivalta testi değerlerinden yararlanılmıştır. Vücut sıvılarından elde edilen LDH, ALP,- amilaz, ASAT ve ALAT bulgularının istatistiksel analizinde; LDH çok ileri düzeyde farklılık göstermiştir (p < 0.001). ALP, amilaz, ASAT ve ALAT farklı bulunmuştur (p < 0.05). Bu çalışma ile vücut sıvılarının transuda ve eksuda -ayırımında LDH dışında söz konusu öteki enzimlerin aktivite değerlerinin yararı olamayacağı kanısına varılmıştır. Anahtar Kelimeler: Vücut sıvıları, transuda, eksuda, enzimler, spektrofotometre.
Plasenta kaynaklı mezenkimal kök hücrelerden eksozomların izolasyonu, karakterizasyonu ve ilaç taşıyıcı sistem olarak etkinliğinin araştırılması
Amaç: Mezenkimal kök hücreler (MSC), kendi kendini yenileme yeteneğine sahip doku kaynaklı hücrelerdir ve çeşitli hücre soylarına farklılaşabilirler. Plasenta, fetal toleransı koruyan ve zengin bir MSC rezervuarı oluşturan geçici bir organdır. MSC'ler invaziv prosedürler olmaksızın plasentadan kolayca izole edildiğinden, kullanımları etik kaygılara yol açmaz. Büyüme faktörleri, sitokinler, kemokinler, mikroveziküller (200-1000 nm çap) ve eksozomlar (40-200 nm çap) gibi ekstrasellüler vezikül salgı proteinleri dahil olmak üzere MSC'lerin sekretomunun, MSC'lerin terapötik özelliklerinin çoğunu sergilediği gösterilmiştir. Bu çalışmanın amacı, plasenta kaynaklı mezenkimal kök hücrelerden salınan eksozomların, dosetaksel (DOC) ile fonksiyonel hale getirilerek serviks kanseri tedavisinde etkisinin araştırılmasıdır. Gereç ve Yöntem: Tip I kollajenaz ile doku inkübasyonu sonucu MSC'ler plasentadan izole edildi. İzole MSC'leri tanımlamak için CD44, CD90, CD105 ve CD34 kullanıldı. Eksozomlar, her 48 saatte bir, ultrasantrifüj yöntemi kullanılarak MSC açlık ortamından izole edildi. Santrifüjlemeden sonra, eksozom pelletleri PBS içinde yeniden süspanse edildi ve Exo-Quick eksozom saflaştırma kiti ile saflaştırıldı. Saflaştırılmış eksozomlar, partikül boyutu ve yapısının yanı sıra CD9, CD63 ve CD81 işaretçileri kullanılarak karakterize edildi. MSC'den türetilen eksozomlar, docetaxel (EXO-DOC) ile elektroporasyona tabi tutuldu ve ardından 24 ve 48 saat boyunca HeLa rahim ağzı kanseri hücreleri ile inkübe edilerek sitotoksisite testleri yapıldı. Bulgular: Taramalı elektron mikroskobu, saf ve docetaxel yüklü eksozomların partikül boyutunu ve yapısını sırasıyla 81 ve 107 nm olarak ortaya koymuştur. Dosetaksel yüklü eksozomlar daha kısa sürede ve daha düşük konsantrasyonlarda etkinlik gösterir. Western blot ve qPCR sonuçlarına göre EXODOC, rahim ağzı kanseri hücrelerinde apoptozu artırır ve epitelyal mezenkimal geçişi(EMT) azaltır. Sonuç: Plasentanın eksozomları doğumdan sonra izole edilirse ilaç taşıyıcı sistem olarak kullanılabilirler ve bu eksozomlar ilacın hücrelere girişini kolaylaştırarak ilaçların düşük dozlarda daha etkili olmasını sağlar. Bu çalışmanın bulguları, antikanser tedaviler için yeni ilaç dağıtım sistemlerinin geliştirilmesinde plasenta kaynaklı eksozomların kullanılması potansiyelini arttırmaya yardımcı olacaktır. Anahtar kelimeler: Dosetaksel, Eksozom, Mezenkimal kök hücre, Plasenta, Servikal kanser.